专利名称：一种治疗骨科疾病的超级抗原蛋白药物的制作方法骨质疏松及其它骨科疾病包括骨折，骨裂，股骨头坏死等不仅严重威胁着老年人的身体健康，而且给社会造成了巨大的经济负担。当今社会老龄化越来越严重，骨质疏松巳成为迫切需要解决的问题。骨质疏松症是人体在衰老过程中发生的骨量減少、骨细胞微结构破坏、骨強度降低、骨脆性増加和易发生骨折的全身疾病。骨质疏松症的产生和发展是在无声无息中进行 的，早期的骨质疏松患者没有任何临床症状，到了中晚期，骨质疏松的临床症状主要为疼痛及骨折，因而有人称其为“无声的杀手”。据估计我国1999年骨质疏松症患病人数为8400万，随着人ロ的老龄化，病人将逐年増加，预计到2010年可达I. 12亿人，将成为严重的社会和经济问题。因此，寻找ー种有效的药物来预防和治疗骨质疏松是当今研究的热点。骨髓间充质干细胞(MSCs)是成骨细胞的前体细胞，具有多种分化潜能。通过定向诱导能够向成骨细胞分化，从而达到治疗骨类疾病的目的。MSCs用于骨质疏松的治疗在大鼠骨质疏松模型和绝经期妇女的临床应用中均有报道。但如何快速定向将MSCs分化成成骨细胞是当今研究的ー个重点，目前研究比较多的是化学药物和中药两类诱导促进剂。超级抗原理论是免疫学的新理论。该理论认为，超级抗原是ー类来源复杂的蛋白质。它对免疫细胞有独特的刺激机制，且在刺激力度上较普通抗原強大，只需极微量就可刺激大量免疫细胞増殖，并诱导产生细胞因子和细胞毒性，可用于医治免疫力低下引发的各种疾病。目前，国际上公认并且研究较多的超级抗原是金黄色葡萄球菌肠毒素，这是ー种強大的细胞免疫激活剂，能使T细胞，NK细胞，LAK细胞及细胞因子在短时间内巨量増殖，从而具有超级抗原的能力。我们在研究中发现C型金葡菌肠毒素能明显促进人的骨髄来源的间充质干细胞向成骨细胞的分化，所以此类超级抗原极有可能是ー种用于多种骨科疾病包括骨质疏松治疗的潜在药物。本发明的技术方案形成是依据以下几点首先，骨质疏松等多种骨科疾病的发生是ー个非常复杂的过程，总的来说，当体内矿化平衡被打破，骨形成减少而骨吸收增加时骨质疏松就会发生。骨形成減少的标志就是成骨细胞减少而脂肪细胞增多；骨吸收的标志就是破骨细胞的增多。第二，骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)是ー种干细胞，具有多向潜能性，能分化成成骨、成脂、成肌、内皮等多种细胞。在合适的刺激下，MSCs能定向分化成成骨细胞；第三，实验研究发现金黄色葡萄球菌肠毒素C2能明显的促进MSCs向成骨的分化。目前已有大量文献报道，金黄色葡萄球菌肠毒素C2是ー种超级抗原，能明显的促进白介素，干扰素ー r等免疫因子的表达。2009年，薛明在《微生物学杂志》发表文章，报道白介素及干扰素_r能促进成骨细胞的増殖，提示特们对于成骨具有一定的作用。后来，又有大量的文章报道，白介素等细胞因子能直接或间接的调控成骨细胞的分化，包括在大鼠的动物模型中的研究。所以我们推测肠毒素C2可能促进MSCs的成骨分化，其机理可能是通过激活免疫因子来调控。我们通过实验确定了肠毒素C2确实能促进MSCs的成骨分化。对于其机理，我们发现了其中ー个因子P204能被肠毒素C2激活，P204能与成骨分化的关键因子cfabl相互作用并促进成骨分化已有文献报道。P204是P200蛋白家族的ー员，是一种干扰素诱导蛋白。它能促进多种组织的分化，特别是成骨和成软骨。我们的肠毒素C2是ー种超级抗原，能大量的促进干扰素的表达，而干扰素的表达又诱导了 P204的表达，从而导致了成骨分化的发生。
本发明就是针对上述问题，提供了一种治疗骨质疏松及骨折骨裂等骨科疾病的药物。 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，其是以ー类具有超级抗原功能的蛋白金黄色葡萄球菌肠毒素为活性成份；金黄色葡萄球菌肠毒素能促进骨髓来源的间充质干细胞MSCs向成骨细胞分化；并能大力提高机体的免疫力，属于超级抗原家族。所述金黄色葡萄球菌肠毒素为金黄色葡萄球菌肠毒素A、金黄色葡萄球菌肠毒素B、金黄色葡萄球菌肠毒素C亚型中的ー种或ニ种以上。所述金黄色葡萄球菌肠毒素为金黄色葡萄球菌肠毒素C2。金黄色葡萄球菌产生的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种血清型。目前研究较多的是A，B及C型，他们都具有免疫活性，都能在较短时间内诱导大量的免疫因子包括干扰素的产生。我们以肠毒素C2型为研究对象，发现它能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，其机理是肠毒素C2诱导了大量干扰素的生成，而干扰素的大量表达又诱导ー种依赖干扰素表达的蛋白P204的生成,P204促进了(MSCs)的成骨分化[Choubey D and LengyelP, 1992; Luan Y et al, 2008]。參考文献ChoubeyD, Lengyel P 1992 Interferon action: nucleolar andnucleoplasmic localization of the interferon—inducible 72_kD protein thatis encoded by the Ifi 204 gene from the gene 200 cluster. J Cell Biol116:1333 - 1341 Luan Yj Lengyel P，Liu CJ 2008 p204，A p200 family protein, as amultifunctional regulator of cell proliferation and differentiation. CytokineGrowth Factor Rev 19:357 - 369。所述骨科疾病是指与骨相关的疾病骨质疏松、骨折、骨裂、股骨头坏死中的ー种或ニ种以上。所述药物是ー种金黄色葡萄球菌肠毒素的单ー或复方制剂； 肠毒素C可与一些促进成骨的中药如淫羊藿黄酮，女贞子等制成复方制剂，来加强成骨的效果。所述药物的剂型为吸入制剂、ロ服制剂、灌注制剂或注射制剂，特别适于静脉内或腹膜内注射，或者直接注射到骨损伤部位的制剂。本发明提供了一种可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的金黄色葡萄球菌肠毒素C2。本发明证明，该超级抗原作用于骨髓来源的MSCs后，与正常对照相比，明显缩短了成骨细胞分化成熟时间。这说明该超级抗原具有促进MSCs向成骨细胞分化的能力，具有治疗骨质疏松等骨科疾病的潜能。本发明药物的使用方式可以是ロ服，全身使用(例如通过皮肤，鼻吸入)或者通过局部注射(包括肌肉，皮下及静脉注射)。本发明优选的是静脉注射。本发明可制成针剂，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂及胶囊之类的药物也可按常规进行制备。针剂、片剂、溶液及胶囊均在无菌条件下制造。此外，本发明的预防和治疗骨科疾病的药物还可与其他治疗剂一起使用。本发明的有益效果 本发明具有超级抗原功能的金黄色葡萄球菌肠毒素C2在治疗骨质疏松方面具有特定 的效果，它能通过促进骨髄间充质干细胞向成骨细胞分化来发挥治疗潜能；进而推断出，其它型的肠毒素也具有同样的功能；由此，根据本发明可开发出系列的、金黄色葡萄球菌肠毒素类的治疗骨科疾病的生物制剂。


图I :本发明中的野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (SEC2)及基因重组的金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (rSEC2)蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝(10%SDS-PAGE)电泳图；图谱说明蛋白上样量均为20ug。SEC2为野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2 ；rSEC2为基因重组的金黄色葡萄球菌肠毒素C2。两种蛋白的纯度均在95%以上。图2 :本发明的超级抗原处理MSCs后连续培养6天，碱性磷酸酶活性测定图；图谱说明第9天时碱性磷酸酶活性測定图。纵坐标是碱性磷酸酶活性的百分比，以空白对照(C)为100%计算，其他样品处理组相对于空白対照的増加。Icarrin为淫羊藿苷，作阳性对照。SEC2为野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2 ;rSEC2*基因重组的金黄色葡萄球菌肠毒素C2。*代表P〈0. 05，表示与空白对照相比，有显著性差异。**代表P〈0. 01，表示与空白对照相比，具有非常显著的差异。图3 :本发明的超级抗原处理MSCs后连续培养12天，茜素红染色 图谱说明 第15天时茜素红染色图。C为空白对照，Icarrin为淫羊藿苷，作阳性对照。SEC2为野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2 ；rSEC2为基因重组的金黄色葡萄球菌肠毒素C2。

I.细胞培养人骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)是从健康成年人捐献骨髄中分离得到的原代细胞，经流式细胞技术鉴定，确定为MSCs。细胞采用a — MEM培养基加入质量浓度10% FBS(胎牛血清)和质量浓度I %双抗(青霉素和链霉素)，在5% CO2，37°C培养。将细胞按5X105/孔的密度种12孔板，24小时后，换以诱导成骨的培养液(添加了 10_8M地塞米松，10 μ g/mL L- 2-磷酸抗坏血酸和IOmM 2-磷酸甘油的a_MEM培养基)，同时分别以26ug/ml的野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白(SEC2)及基因重组的金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白(rSEC2)，处理MSCs细胞，处理3天。以IOuM淫羊藿苷同样处理的MSCs作为阳性对照。2.碱性磷酸酶活性的测定
碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标识物，我们采用碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物公司)对其活性进行測定。具体步骤如下
I)超级抗原处理后(以20ug/ml的浓度加入到a-MEM培养基中)，继续培养6天。去掉上清，用PBS洗3次，加入IOOul细胞裂解液(20mM pH 7. 5的Tris-HCl，150mM NaCl和1% Triton X-100),放在冰上裂解15min。收集蛋白，I, 2000rpm离心IOmin以去掉碎片。2)按照试剂盒的标准操作进行碱性磷酸酶活性的測定，在492nm下測定OD值。3)按照Bio-Rad标准操作测定每个样品的蛋白含量。

4)用所测得的碱性磷酸酶活力与蛋白含量相比得到碱性磷酸酶的比活力。5)碱性磷酸酶比活力的測定结果显示，超级抗原处理后的MSC经6天培养，与对照相比，碱性磷酸酶的活力升高了 49-58% (附图2)。结论超级抗原SEC2促进了 MSCs的碱性磷酸酶的活性。3.成骨细胞矿化的检测
成骨细胞分化的最終指标是钙结节及矿化的形成。我们采用了茜红染色(ARS)来确定最終的钙结节。如果成骨分化成功，会出现红色的钙结节沉淀。具体操作步骤如下
I)超级抗原处理后，继续培养12天。去掉上清，用PBS洗3次，加入200ul 4%多聚甲醛(一种细胞组织的常用固定剂)固定lOmin。2)用超纯水洗漆3次,然后加入姆孔300ul菌素红染液,染色lOmin。3)去掉染液，用超纯水洗涤3次。显微镜下观察拍照。4) ARS染色结果显示与对照组相比，超级抗原处理组呈现出强阳性結果。(附图
3)结论超级抗原SEC2促进了 MSCs的钙化及矿化的产生。


本发明涉及一种用于治疗骨科疾病包括骨质疏松、骨折、骨裂，股骨头坏死等的药物及用途，本发明还涉及一类具有超级抗原功能的蛋白及其用于制备药物的用途。本发明提供了一种治疗骨质疏松及骨折骨裂等骨科疾病的药物。其是以一类具有超级抗原功能的蛋白金黄色葡萄球菌肠毒素为活性成份；金黄色葡萄球菌肠毒素能促进骨髓来源的间充质干细胞MSCs向成骨细胞分化；并能大力提高机体的免疫力，属于超级抗原家族。