专利名称：猪连环蛋白α样1基因CTNNAL1作为猪产仔数性状的遗传标记的制作方法猪的产仔数性状是属于低遗传力的限性性状，性状遗传力只有0.10，采用常规选择遗传进展有限。近年来分子标记辅助选择为产仔数性状的遗传改良提供了新的机遇。分子标记筛选主要有候选基因法和基因组扫描法。最早用候选基因法分离的猪产仔数性状基因或标记是雌激素受体基因(Estrogen receptor, ESR)。Rothschild研究组(1994.A major gene for litter size in pigs.Proc 5th World Congr Genet Appl LivestProd, Guelph，Canada，1994，21:225-228)研究发现ESR位点B等位基因可以显著提高梅山猪合成系的产仔数1.15头/窝，但通过基因组扫描法却没有发现在其附近存在产仔数性状上的QTL。另外一种是基因组扫描法，但由于获得具有产仔数记录的资源家系建系难，时间长、成本高，因此对产仔数性状QTL定位的报道相对少。Rathje等(1997.Evidencefor quantitative trait loci affecting ovulation rate in pigs.Journal of AnimalScience.75:1486-1494)和Milan等(1998.Current status of QTL detection in LargeWhiteXMeishan crosses in France.Proc 6th World Congr Genet Appl Livest Prod，Armidale, Australia，26:414-417)报道了 8号染色体上一个影响排卵率和单胎产仔数的大效应QTL。Zhang 等(1998.1dentification and chromosomal localization of CTNNALI,a novel protein homologous to alpha-catenin.Genomics, 54 (I):149-154.)通过基因文库的扫描，发现了一个和人类的a连环蛋白同源的基因。这个基因的cDNA长约2450bp，编码长约734个氨基酸的蛋白质。这个基因被定名为CTNNAL1 (钙粘蛋白类似物)。Park 等(2002.Association of Lbc Rho guanine nucleotide exchange factor withalpha-eatenin-related protein， alpha-catulin/CTNNAL1, supports serum responsefactor activation.J Biol Chem，277(47):45361-45370)通过比对，发现 CTNNAL1 编码的a-Catulin和CTNNAl编码的a E-catenin的同源性超过40 %以上，和CTNNA2编码的a N-catenin的同源性在50%以上。a -catenin是组成I丐粘蛋白_连环蛋白复合体的关键部分，对于钙粘蛋白的粘附活性是必须的，介导大多数脊椎动物的细胞间的黏附作用(Aberle et al.Cadherin-catenin complex:protein interactions and theirimplications for cadherin function.J Cell Biochem，1996，61:514-523)，跨膜I丐粘蛋白的黏附作用是由胞浆中的钙粘蛋白和胞内的连环蛋白(a，￠)组成的复合体来实现的。此外，a-catenin 还和生 长发育通路有关(Barth et al.Cadherins, catenins and APCprotein:interplay between cytoskeletal complexes and signaling pathways.CurrOpin Cell Biol, 1997,9:683-690)。a-catenin在wnt诱导的细胞分化中起下调的作用，抑制P-catenin介导的转录激活。Buimer 等(2008.Seven Placental Transcripts CharacterizeHELLP-syndrome.Placenta,2008,29(5):444-453)发现在 HELLP(hemolysis, elevatedliver enzymes, and low platelets syndrome)综合症中 CTNNALI 是下调表达的，HELLP综合症主要表现为溶血，肝酶升高以及血小板减少的症状这种症状是与孕产妇和围产儿的死亡率有很大的关联性。此外，在我们前期研究中CTNNAL1基因在大白猪和中国二花脸猪排卵前卵泡中差异表达(Sun et al.Microarray profiling for differential geneexpression in PMSG—hCG stimulated preovulatory ovarian follicles of ChineseTaihu and Large White sows.BMC Genomics,2011,12(I):111)因此我们将CTNNAL1基因作为猪产仔数性状候选基因，研究该基因多态性，并与产仔数性状进行关联分析，为产仔数性状改良提供新的标记。
本发明的目的在于获得一种猪产仔数性状的遗传标记，克隆猪CTNNAL1基因序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪的标记辅助提供一种选择方法。本发明的技术方案如下:本发明获得了一种猪产仔数性状的遗传标记，它是大白猪、太湖猪CTNNAL1基因的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3所示；通过上述序列进行ClustalW比对提供了位于 该扩增片段646碱基处存在I个C/G突变(如图1所示)，导致PCR-Alu1-RFLP多态性。申请人:设计了一种扩增猪CTNNAL1基因cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如SEQID NO:4 和 SEQID NO:5 所示。申请人:提供了一种筛选猪产仔数性状的遗传标记的方法，按照以下步骤:从猪血液中提取基因组DNA。登录NCBI数据库中下载人的相应基因序列，以人CTNNALI mRNA序列作为种子序列，利用NCBI网站EST-others搜寻猪的同源EST。选择同源性大于80%的猪的ESTs，利用电子克隆，将获得的ESTs进行拼接，并以此作为靶序列，设计特异引物(该引物的序列如序列表SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示)。以大白猪和太湖猪的cDNA为模板进行扩增，对PCR产物回收和克隆测序，得到如序列表SEQ ID NO: 1-3所示的基因片段；进而进行序列Clustalw比对，筛查SNP (如图1所示)，在该序列的646碱基处(即，该基因第14外显子43bp处)发现C/G等位基因突变，此突变引起了氨基酸发生改变，使得由CAG编码的Gln (谷氨酰胺)变成了 CAC编码的His (组氨酸)，该突变表现了大白猪和太湖猪种间差异，并引起了 AluI酶切位点(AG丨CT)多态性。然后以Ensembl上猪CTNNAL1基因序列及猪CTNNAL1基因673bp的cDNA片段SEQID NO =1-SEQ ID NO:3序列为靶序列，设计引物，该引物的序列如序列表SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。扩增区域包括猪CTNNAL1基因第14外显子的416bp的基因组核苷酸序列(如图2所示),然后进行AluI酶切，SNP位点检测如图3所示。本发明提供了鉴定上述序列C/G变异的AluI_RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法。其引物序列分别如序列表SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段AluI酶切分型及检测。进一步，本发明提供了利用AIu1-RFLP方法确定猪不同基因型个体与产仔数性状间的关联分析的应用。更详细的发明方案见《》所述。序列表SEQ ID NO:1:是扩增的国外血缘猪种“大白猪个体I”的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO:2:是扩增的中国血缘猪种“太湖猪个体I ”的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO:3:是扩增的中国血缘猪种“太湖猪个体2”的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO:4:是制备SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3特异基因片段所用的正向引物。序列表SEQ ID NO:5:是制备SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:3特异基因片段所用的反向引物。序列表SEQ ID NO:6:是实施猪CTNNAL1基因第14外显子C/G变异AIu1-RFLP (限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物。序列表SEQ ID NO:7:是实施猪CTNNAL1基因第14外显子C/G变异AIu1-RFLP (限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。图1:是大白猪和太湖猪CTNNAL1基因序列片段比对结果和SNP位点。图2:是包括猪CTNNAL1基因序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为1.5%;图中:M 泳道为 DNA Marker DL2, 000 ;泳道 1-7 为序列表 SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为416bp。图3:是猪CTNNAL1基因片段AIu1-RFLP检测结果。琼脂糖胶浓度为2.0%;图中:泳道M为DL 2000Markers ;1、3、4泳道为CG基因型，片段大小分别为416bp，238bp，178bp ；
2、6泳道为GG基因型，片段大小为238bp，178bp；5泳道为CC基因型，片段大小为416bp。图4:是大白猪个体I的核苷酸序列。在该序列的的646bp处存在I个等位基因突变(C/G)。图5:是太湖猪个体I的核苷酸序列。在该序列的的646bp处存在I个等位基因突变(C/G)。图6:是太湖猪个体2的核苷酸序列。在该序列的的646bp处存在I个等位基因突变(C/G)。根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。


在11个群体猪，其中7个国外血缘猪群和3个中国地方血缘猪群、I个合成系(中国瘦肉猪新品系DIV系(华中农业大学和湖北省农业科学院畜牧兽医研究所共同培育，在中国大规模推广应用的瘦肉型新品种猪)中检测猪CTNNAL1基因PCR-Alu1-RFLP多态性，检测结果如表I所示。结果表明:只有在大白猪、湖北白猪DIV以及淮南猪中存在3种基因型；但是在通城猪等7个群体中没有检测CC型，可能C等位基因纯合个体会在胚胎发育早期死亡。在所有检测的11个群体中，G等位基因频率为0.54-1.00，G等位基因为优势等位基因(见表I)。表I猪CTNNAL1基因PCR-Alu1-RFLP在不同猪种中的分布结果


本发明属于猪遗传标记制备与应用技术领域。具体涉及猪连环蛋白α样1CTNNAL1编码基因第14外显子的单核苷酸多态性(SNP)检测技术领域。其步骤包括从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物克隆、测序，序列比较分析，单核苷酸多态性检测，标记与产仔数性状间相关性分析。本发明公开了猪CTNNAL1基因第14外显子的DNA序列和SNP分型的检测技术。本发明的遗传标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示，在序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3序列646位碱基处有一个碱基突变C/G，并导致AluI-RFLP多态性。本发明公开了该遗传标记的制备方法及其在猪产仔数标记辅助选择中的应用。