专利名称：：开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯l-乳酸的方法技术领域：中L-乳酸的生产方法，尤其是涉及一种开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯L-乳酸的方法。：乳酸(C2H5OCOOH)，又名α-羟基丙酸。乳酸可以分为L-乳酸(左旋性)、D_乳酸(右旋性)和DL-乳酸(消旋性)。传统上乳酸可用于食品、印染、制药等领域。近年来，随着白色污染日益受到关注以及矿物质资源的不可再生性，以可再生资源为原料生产的可生物降解聚合物引起了人们的广泛关注。其中，聚乳酸作为主要的生物可降解塑料之一，其物理性能与聚苯乙烯非常相似，有希望成为石油基塑料的替代物之一。可生物降解聚乳酸的生产需要高光学纯度的L-乳酸，而目前高光学纯度的L-乳酸的生产成本还比较高，这是造成可生物降解聚乳酸无法与石油基塑料竞争的重要因素之一。微生物发酵法是生产L-乳酸的主要方法。L-乳酸可以从淀粉、纤维质、有机垃圾等再生资源中甚至废弃物中发酵获得，原料的来源广泛。同时，可以通过菌株筛选和改造，得到可生产高光学纯度的L-乳酸的发酵生产菌株，生成的高光学纯L-乳酸易于用于聚乳酸的合成。但是在大规模分批发酵过程中，每一批次发酵都需要在灭菌后的培养基中扩大培养多级种子，以保证发酵培养过程中有足够的生产菌株细胞支持发酵生产的进行。多级种子培养不仅延长了发酵周期，还增加了种子罐等发酵设备的投入。此外，多级种子培养过程中的能量消耗尚无法避免。而在现代大规模发酵过程中，单罐发酵体积越来越大，种子培养体积也相应增大，种子培养过程中的能量消耗不容忽视。为了避免每一批次都要进行的多级种子培养，有报道提出半连续发酵的操作方式，即把部分发酵结束后的培养液作为下一批次发酵的种子。但是这种操作方式把发酵液中的代谢废物带入了新的发酵批次，容易引起发酵效率下降和菌株退化。针对这一问题，有报道提出细胞回收发酵操作，即将与发酵液分离后的菌体作为新的发酵批次的种子。目前，细胞回收发酵采用滤膜系统从发酵液中分离菌体。滤膜系统中的滤膜容易堵塞，必须定期更换。常规的细胞分离操作如旋转离心如能用于细胞回收发酵，可简化全细胞回收半连续发酵的操作。但目前通常采用的嗜中温乳酸生产菌株在非无菌条件下的细胞回收时容易污染杂菌，无法使用开放式细胞回收操作。
本发明提供了一种操作简便、纯度较高的开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯L-乳酸的方法。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯L-乳酸的方法，是以嗜热乳酸生产菌株，优选凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCN22184为菌种进行开放式发酵，发酵结束后对发酵液进行离心，去除菌体的上清液即为含有高光学纯度L-乳酸发酵液，离心后所得菌体再作为种子培养物接入下一批次发酵培养基中，以与上次发酵完全相同的发酵条件进行发酵培养，如此循环，得到光学纯L-乳酸。本发明采用凝结芽孢杆菌作为发酵菌种，所述凝结芽孢杆菌(Baci1luscoagulans)CASHCGMCCNa2184已于2007年09月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并已在中国专利CN200710176060.9中公开。所述发酵培养基配方为葡萄糖130g/L，酵母粉220g/L，余量为水，pH值6.0。所述发酵条件为发酵温度50°C55°C，发酵时间4048小时，搅拌转速130150转/分，其间自动流加重量比为30%40%碱液控制发酵液pH值在6.06.5范围内。所述发酵条件优选为发酵温度50°C，发酵时间48小时，搅拌转速150转/分钟，旋转半径33毫米，流加碱液为重量比为40%的氢氧化钠，发酵液pH值6.0。本发明突出特点是每次发酵液均在非无菌条件下以离心方式回收菌体并将菌体用于循环发酵。具体的，所述发酵结束后的发酵液以6，0008，000转/分转速在非无菌条件下离心20士2分钟；所述离心转速优选为8，000转/分。所述循环发酵次数优选为28次。为获得更好的发酵效果，所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNo2184菌种在发酵前还可先进行斜面培养和种子培养。用上述方法获得的光学纯L-乳酸也属于本发明的保护范围。本发明提供了一种开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯L-乳酸的方法。本发明采用非无菌条件下回收菌体作为种子用于循环发酵。这种开放式全细胞回收技术可以采用常规的菌体分离单元操作如旋转离心回收菌体，避免了膜单元的使用，降低了细胞回收费用，提高了细胞回收效率，使细胞回收操作更加简便易行。开放式离心全细胞回收技术可以在非无菌条件下进行，降低了细胞回收操作对设备和环境的要求，可以利用现有设备进行细胞回收，减少了设备投资，降低了细胞回收操作复杂程度。本发明采用的芽孢杆菌属于嗜热乳酸生产菌，可以在培养基不灭菌的条件下进行开放式发酵生产高光学纯度L-乳酸，这是由于其能够在50°C以上生长并生成乳酸，而普通菌株不能在如此高温条件下生长，即使在离心操作时混入杂菌，由于其高生长温度，在以其为种子的后续发酵中也能够成为优势菌株，抑制杂菌生长，保证乳酸发酵的顺利进行。嗜热乳酸生产菌株不仅能够实现开放式发酵，其高生长温度和抗污染能力还能够使常规的菌体分离操作如旋转离心能够应用于全细胞回收发酵。而普通菌株在非无菌离心操作时容易被杂菌。此外，本方法实现了非无菌条件下以常规离心方式回收细胞作为循环发酵的种子，简化了循环发酵细胞回收过程，有利于简化操作，降低L-乳酸发酵生产设备投入。本发明光学纯L-乳酸的生产方法明显优于现有的光学纯L-乳酸生产方法，具有纯度高、低污染、生产效率高、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。其目的是为了更好的理解本发明的内容，因此，所举例的实例并不限制本发明的保护范围。实施例1、开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯L-乳酸本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水；所述斜面培养基的PH值为6.5，121°C灭菌20分钟。种子培养基葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙3g/L，溶剂为水；所述种子培养基的PH值为6.5，121°C灭菌20分钟。发酵培养基葡萄糖130g/L，酵母粉10g/L，余量为水；所述发酵培养基的pH值为6.0，发酵培养基没有经过灭菌。用本发明开放式全细胞回收循环发酵的方法生产光学纯L-乳酸，具体方法包括以下步骤1.斜面培养将凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2184以常规方法接种于斜面培养基上，50°C培养12小时。2.种子培养将步骤1培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有30mL种子培养基的IOOmL三角瓶中，摇床振荡培养(150转/分)12小时，培养温度50°C。制得种子培养液。3.发酵培养(第一次发酵)将上述种子培养液以体积比10%的接种量接种到3升置于5升发酵罐中的发酵培养基(发酵培养基没有经过灭菌)中，以培养温度500C(50°C55°C均可)，搅拌转速150转/分(130150转/分均可)，培养48小时(4048小时均可)，结束发酵。培养过程中自动流加重量比为40%(30%40%均可)氢氧化钠调节发酵液PH值维持在6.0(6.06.5均可)。4.细胞回收将步骤3中发酵液在非无菌条件下，以8，000转/分(6，0008，000转/分转均可)离心20分钟(20士2分钟均可)回收菌体，上清液用于分离L-乳酸。5.重复发酵(第二次发酵)将回收的菌体作为种子培养物以体积比不低于5%的接种量接入下一批次发酵培养基中，以与第一次发酵完全相同发酵条件进行发酵培养，培养结束后离心回收菌体，上清液用于分离L-乳酸。6.发酵液检测菌体浓度采用分光光度计于620nm处检测。L-乳酸浓度采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。L-乳酸光学纯度采用AgilentllOO液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)分别测定发酵液中L-如酸和D-乳酸浓度，通过公式计算出L-乳酸光学纯度。液相系统采用手性分离柱(日本三菱化学公司，MCIGEL-CRSlOff(3μ)4.6IDX50mm，光学异体分离用)，0.002mol/L硫酸铜为流动相，流量0.5mL/min,进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25°C。D-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L0625，L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。L-乳酸光学纯度(％)=L-乳酸浓度/(L-乳酸浓度+D-乳酸浓度)X100%发酵结束后，取各批次分离的发酵液样品，根据上述检测和计算方法检测发酵液中菌体浓度、L-乳酸含量以及L-乳酸光学纯度。结果显示，第一批次发酵最大细胞浓度8.9(0D620nm)，上清液中L-乳酸浓度63g/L，生产强度1.4g/L/h，L-乳酸光学纯度99.4%。第二批次发酵最大细胞浓度9.8(0D620nm)，上清液中L-乳酸浓度70g/L，生产强度1.6g/L/h，L-乳酸光学纯度99.0%。由此可知，开放式全细胞回收循环发酵能够提高乳酸生产效率，同时保持L-乳酸光学纯度在99%以上。实施例2、开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯L-乳酸不进行斜面培养和种子培养，直接进行发酵培养将实施例1中第二次发酵所得发酵液在非无菌条件下，以8，000转/分离心20分钟回收菌体。去除菌体上清液即为含高光学纯度L-乳酸发酵液。将回收菌体作为种子培养物以体积比不少于5%的接种量接入3升置于5升发酵罐中的发酵培养基中，以与实施例1中相同的发酵条件进行第三次循环发酵。第三次循环发酵结束，再如上述操作进行第四次循环发酵。取各批次分离的发酵结束时的发酵液，检测菌体浓度、L-乳酸含量以及L-乳酸光学纯度。实验结果显示，第三批次发酵最大细胞浓度10.8(0D620nm)，L-乳酸浓度71g/L，生产强度1.6g/L/h，L-乳酸光学纯度99.3%。第四批次发酵最大细胞浓度11.5(0D620nm)，L-乳酸浓度74g/L，生产强度1.7g/L/h，L-乳酸光学纯度99.0%。由此可知，随着开放式全细胞回收发酵的循环，乳酸生产效率有进一步的提升，L-乳酸光学纯度保持在99%以上。实施例3以不同酵母粉浓度开放式全细胞回收循环发酵生产含高光学纯L-乳酸发酵液发酵培养基设计4种培养基，所变化的是实施例1所述发酵培养基中酵母粉浓度分别为2g/L、10g/L、15g/L、20g/L，葡萄糖130g/L，余量为水；所述发酵培养基的pH值为6.0，发酵培养基没有经过灭菌。不进行斜面培养和种子培养，直接进行发酵培养将实施例2中第4批次发酵得到的发酵液以8，000转/分非无菌条件下离心20分钟得到的菌体作为种子，以2g/L酵母粉为氮源的发酵培养基进行发酵。再将发酵结束后得到的发酵液以8，000转/分非无菌条件下离心收集的菌体作为种子，以10g/L酵母粉为氮源的发酵培养基进行发酵。再将发酵结束后离心收集的菌体作为种子，以15g/L酵母粉为氮源的发酵培养基进行发酵。再将发酵结束后以8，000转/分非无菌条件下离心收集的菌体作为种子，以20g/L酵母粉为氮源的发酵培养基进行发酵。每次发酵接种量不低于5%。上述每一批次发酵结束后，根据上述实施例1所述的检测和计算方法，检测发酵液中菌体浓度、L-乳酸浓度以及L-乳酸光学纯度。试验结果见表1，表明增加酵母粉浓度有利于提高L-乳酸生产效率。最大细胞光吸收可达31.8(0D620nm)。L-乳酸浓度最高可达107g/L，L_乳酸光学纯度可达99.8%，生产强度2.9g/L/h。表1酵母粉浓度对开放式全细胞回收发酵的影响酵母粉浓度I最大细胞浓度IL-乳酸浓度I生产强度IL-乳酸光学纯度(g/L)(0D620nm)(g/L)(g/L/h)(%)~~27Γ226O993<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4、开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯L-乳酸本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基和种子培养基配方与实施例1相同。发酵培养基葡萄糖130g/L，酵母粉20g/L，余量为水；所述发酵培养基的pH值为6.0，发酵培养基没有经过灭菌。用本发明开放式全细胞回收循环发酵的方法生产光学纯L-乳酸，具体方法包括以下步骤1.斜面培养与实施例1相同。2.种子培养与实施例1相同。3.发酵培养将上述种子培养液以体积比10%的接种量接种到3升置于5升发酵罐中的发酵培养基(发酵培养基没有经过灭菌)中，以培养温度55°C，培养40小时，结束发酵。培养过程中自动流加重量比为30%氢氧化钠调节发酵液pH值维持在6.5。4.细胞回收将步骤3中培养液在非无菌条件下，以6，000转/分离心20分钟回收菌体，上清液用于分离L-乳酸。5.重复发酵与实施例1相同。发酵结束后，取各批次分离的发酵液样品，检测发酵液中菌体浓度、L-乳酸含量以及L-乳酸光学纯度。结果显示，第一批次发酵最大细胞浓度10.5(0D620nm)，L-乳酸浓度88g/L，生产强度2.2g/L/h，L-乳酸光学纯度99.4%。第二批次发酵最大细胞浓度12.1(0D620nm)，L-乳酸浓度95g/L，生产强度2.4g/L/h，L-乳酸光学纯度99.3%。由此可知，开放式全细胞回收循环发酵能够提高乳酸生产效率，同时保持L-乳酸光学纯度在99%以上。权利要求一种开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯L-乳酸的方法，是以嗜热乳酸生产菌为菌种在发酵培养基中进行50℃～55℃下开放式发酵，发酵结束后对发酵液进行离心，去除菌体的上清液即为含有高光学纯度L-乳酸发酵液；离心后所得菌体再作为种子培养物接入下一批次发酵培养基中，以与上次发酵完全相同的发酵条件进行发酵培养，然后再对此次发酵液进行离心操作；如此循环多次，得到光学纯L-乳酸。2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于所述嗜热乳酸生产菌为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2184。3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于所述发酵培养基配方为葡萄糖130g/L，酵母粉220g/L，余量为水，pH值6.O。4.根据权利要求1或2或3所述的生产方法，其特征在于所述发酵条件为发酵温度50°C55°C，发酵时间4048小时，搅拌转速130150转/分，其间自动流加重量比为30%40%碱液，控制发酵液pH值在6.06.5范围内。5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于每次发酵的接种量不少于5%，发酵温度50°C，发酵时间48小时，搅拌转速150转/分钟，流加碱液为重量比为40%的氢氧化钠，发酵液PH值6.0。6.根据前述任一权利要求所述的生产方法，其特征在于每次发酵液均在非无菌条件下以离心方式回收菌体并将菌体用于循环发酵；具体的，所述发酵结束后的发酵液以6，0008，000转/分转速在非无菌条件下离心20士2分钟；所述离心转速优选为8，000转/分。7.根据前述任一权利要求所述的生产方法，其特征在于所述循环发酵次数为28次。8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于所述每次循环发酵中所用发酵培养基中，酵母粉含量逐次递增；例如，第一次发酵时发酵培养基中酵母粉含量为2g/L，第二次发酵时发酵培养基中酵母粉含量为10g/L，第三次发酵时发酵培养基中酵母粉含量为15g/L，第四次发酵时发酵培养基中酵母粉含量为20g/L。9.根据权利要求1-8任一项所述的生产方法，其特征在于所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2184菌种在发酵前还需进行斜面培养和种子培养。10.用权利要求1-9任一项所述方法获得的光学纯L-乳酸。全文摘要本发明公开了一种开放式全细胞回收循环发酵生产光学纯L-乳酸的方法。该方法是以凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCC№2184为菌种进行开放式发酵，发酵结束后对培养液进行离心，去除菌体的培养液即为含有高光学纯度L-乳酸发酵液，离心后所得菌体再作为种子培养物接入下一批次发酵培养基中，以与上次发酵完全相同的发酵条件进行发酵培养，如此循环，得到光学纯L-乳酸。本发明光学纯L-乳酸的生产方法明显优于现有的光学纯L-乳酸生产方法，具有纯度高、低污染、生产效率高、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。文档编号C12P7/56GK101805757SQ20101014802公开日2010年8月18日申请日期2010年3月24日优先权日2010年3月24日发明者唐鸿志,孙际宾,王丽敏,许平,赵博,马延和申请人:天津工业生物技术研究所