专利名称：一种毛冬青提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的新用途的制作方法毛冬青为冬青科冬青属植物Ilex pubescens Hook, et Arn.的干燥根，生于山坡灌木丛中，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效，临床上广泛应用于治疗冠心病、心绞痛和脉管炎、中心性视网膜炎、扁桃体炎、咽喉炎、小儿肺炎等，有较好的疗效，国内外学者广泛重视。近年来发现毛冬青在治疗心脑血管疾病方面起着重要的作用，毛冬青对脑血管保护作用，对脑血管有一定的扩张作用，这对促进脑循环调整脑血流，防治脑血管疾病有一定作用。毛冬青中含有黄酮类成分、酚性成分、香豆素类、二萜类成分、留醇、鞣质、糖类及氨基酸多种化学成分，主要成分是毛冬青黄酮苷等。研究表明毛冬青黄酮对缺血脑组织有好的保护作用。但抗脑缺血与提高脑缺血耐受是两个不同的概念。脑缺血耐受(ischemic tolerance, IT)是指预先给予一次或多次的亚致死性短暂缺血性损伤(缺血预处理，ischemic preconditioning, IP)，可以增进脑组织对再次发生的更严重的缺血性损伤的抵抗，减轻脑损伤程度。脑缺血耐受与脑缺血有本质的区别。目前， 药物对脑血管疾病的干预治疗已成为社会和医学界关注的重要课题，寻找有效的治疗药物来提高脑缺血耐受的研究越来越得到重视。目前认为脑缺血耐受的机制可能与兴奋性氨基酸(EAA)、炎症介质、炎症细胞因子、腺苷、调亡相关基因、即刻早期基因、热休克蛋白(HSP)等有关。近年的研究发现，许多在缺血再灌注后表达增加或活性上调并在缺血再灌注损伤中发挥细胞毒性作用的生物活性物质，如炎症介质NO、iNOS和炎症细胞因子TNF- α、IL-I β等在BIT的诱导中却发挥重要作用。中药可通过多条路径提高脑缺血耐受。脑缺血属于中医“中风”的范围，中医学认为中风的发生主要与风、火、痰、瘀、虚等因素有关，而与瘀关系最为密切。主张以“活血化瘀”为主的治则来治疗本病，“活血化瘀”是提高脑缺血耐受的基本方法，改善“微循环”是提高脑缺血耐受的基本原因，这为中药对脑缺血的干预作用提供了依据。现代医学认为脑缺血的病因和发病机理倾向于微血栓和血液动力学、血液流变性障碍，这与中医的“血瘀”观是一致的，血瘀是脑缺血的病理基础。中医药利用活血化瘀方药治疗脑缺血都取得了较好的效果，得到了较广泛的肯定。但用毛冬青提取物制备提高脑缺血耐受作用的药物，至今未见有公开报导。提高脑缺血耐受与抗脑缺血也有本质的区别。
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种毛冬青提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的新用途，可有效解决制备提高脑缺血耐受作用的药物， 以提高脑缺血耐受作用的问题。本发明解决的技术方案是，将毛冬青粉碎成干药粉，用乙醇回流2次，合并滤液， 浓缩后再用水分散成药液，药液静置，过滤，再离心后得毛冬青提取液；毛冬青提取液再分别经聚酰胺柱，由乙醇、碳酸钠水溶液洗脱，调PH为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得毛冬青提取物(总黄酮)，提取物质量含量总黄酮以芦丁计> M.0%。本发明方法简单，易制备，所得毛冬青提取物总黄酮，重点是毛冬青提取物总黄酮有效用于制备提高脑缺血耐受作用的药物，是毛冬青提取物的新用途，开拓了毛冬青新的药用价值，是中药上的创新。2. 1动物分组及给药取体重为观0 300g雄性SD大鼠98只，随机分为7组，每组14只，分别为假手术组、预处理模型组、缺血再灌注组、阳性对照药金纳多组(0. 02g/kg)及毛冬青总黄酮大、 中、小剂量组(分别为0. 2,0. 1,0. 05g/kg)。从预处理后第Id开始灌胃给药，阳性对照药金纳多组与毛冬青总黄酮大、中、小剂量组分别给予相应的药物灌胃；假手术组、预处理模型组与缺血再灌注组同时给予同体积生理盐水灌胃。所有大鼠灌胃体积为lml/100g。每日 1次，连续给药4d。2. 2造模方法首先建立全脑缺血模型采用Simon等[2]方法略加改进对大鼠进行脑缺血预处理。所有大鼠于术前Ia1禁食不禁水，用10%水合氯醛0.;3ml/100g腹腔注射麻醉，将其仰卧固定，用酒精擦拭干净颈部，颈部正中切口，逐层分离暴露双侧颈总动脉(CCA)，用微动脉夹阻断双侧CCA血流lOmin，观察大鼠瞳孔散大，翻正反射消失，即产生全脑缺血。(假手术组、缺血再灌注组只暴露双侧CCA，不作处理)。接着建立局灶性脑缺血模型参照Koizumi等与Nagasawa等方法略加改进制作大脑中动脉阻塞模型(Middle cerebral artery occlusion，MCA0)。于最后一次给药lh，禁食 1 后，再次麻醉大鼠，将其仰卧固定，逐层分离暴露左侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)、 颈内动脉(ICA)并挂线备用，结扎ECA与CCA，以动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与 ICA分叉处作一切口，从切口处插入头端Imm处涂有硅酮胶的光滑尼龙线(直径0. 25 0.沈讓，距头端2cm处作标记)，向上深入至分叉以上约20mm，直至有阻力，即实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处，尼龙线外留约lcm，缝合皮肤。池后轻轻提拉所留线头至略有阻力，实现大脑中动脉再灌注。假手术组仅暴露CCA和ECA，不作其它处理，其余大鼠栓塞左侧大脑中动脉。脑缺血及再灌注过程中保持室温23 25°C。模型成功的标志为以大鼠手术麻醉清醒后出现左侧肢体瘫痪，站立不稳，提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。最终建立大鼠全脑-局灶脑缺血耐受模型。实验最初纳入大鼠98只，两次手术后共计死亡四只，最终有69只大鼠进入结果分析。2. 3检测指标2. 3. 1神经功能缺失评分按照ka Longa 5级评分法，于术后24h (即再灌注22h)进行评定，0分及昏迷不醒者剔除。0分无神经功能缺损症状；1分轻微神经功能缺损，不能完全伸展右侧前爪；2 分中度局灶性神经功能缺损，向右侧转圈；3分重度局灶性神经功能缺损，向右侧倾倒；4 分不能自发行走，意识水平下降。 2.3.2全血黏度和血浆黏度所有大鼠在术后24h断头取血，肝素抗凝，测全血黏度和血浆黏度。2. 3. 3脑组织的形态学观察于术后Mh，神经评分完成后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉动物(0. 3ml/100g体重)，开颅取全脑，冠状位取视交叉向尾端3mm 4mm组织块，用10%甲醛溶液固定，做切片用HE染色，并观察脑组织形态学变化。2. 3. 4脑组织勻浆制备及检测造模后24h断头取脑，去小脑、嗅球及低位脑干， 取手术缺血侧大脑的脑前极到视交叉连线中点处至视神经根部位的脑组织，准确称取其重量，按重量体积比加生理盐水制备成10%的脑组织勻浆，勻浆液经2300r/min，4°C离心 lOmin，取上清液至-20°C冰箱冻存，用于iNOS和N0，IL-li3和TNF-α的测定。采用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定脑组织蛋白含量，应用NOS试剂盒，按照试剂盒操作说明测iNOS 活力，单位为U/mgprot。应用NO试剂盒采用硝酸还原酶法按照试剂盒操作说明，通过比色法检测大鼠脑组织勻浆中N027N03-的含量，用以表示NO的水平，以μ mol/g表示。2. 3. 4. 1考马斯亮兰蛋白的测定方法测定原理蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。试剂的组成及配制考马斯亮兰贮备液60ml Xl瓶。临用时按所需量用蒸馏水1 4稀释(即5倍稀释)，配成应用液(现用现配)；蛋白标准0. 563g/l蛋白标准液0.5ml。操作程序按下表操作考马斯亮兰蛋白测定操作程序_空白管_标准管_测定管蒸馏水(ml)0.05一一0J63g/L 左右的标准液(ml)-0.05-样品(ml) - 一 0.05
考马斯亮兰显色剂(ml)_3 _3 _3 _混勻，静置10分钟，于595nm处，Icm光径，蒸馏水调零，测各管OD值。计算公式
疋自A且丨测定管OD值-空白管OP值/τλ 虫白标准管如值_空白管值Xfe^s浓度(g/Z)2. 3. 4. 2iNOS 的测定方法测定原理N0S催化L-Arg和分子氧反应生成N0，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530nm波长下测定吸光度，根据吸光度的大小可计算出NOS活力。NOS主要有两种类型即结构型(cNOS)和诱导型(iNOS)。结构型(cNOS)主要存在于神经元和内皮细胞内，依赖钙；诱导型(iNOS)主要存在于巨噬细胞内，不依赖钙。根据此原理可以分型。试剂的组成及配制试剂一底物缓冲液6ml X 4瓶。临用前化冻摇勻；试剂二 促进剂淡黄色或白色粉剂X6支，稀释液0. 6mlX6支。测试前取稀释液一支0. 6ml加入一支粉剂中充分混勻(即将1. 5ml小离心管反复颠倒，并将小离心管尖部的液体弹下来)；试剂三黄色显色剂6ml X 2瓶；试剂四透明剂6ml X 2瓶；试剂五终止剂60ml X 4瓶；试剂六液体10ml X 1瓶。
操作程序按下表操作iNOS测定操作程序


本发明涉及毛冬青提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的新用途，可有效解决制备提高脑缺血耐受作用的药物，以提高脑缺血耐受作用的问题，其解决的技术方案是，将毛冬青粉碎成干药粉，用乙醇回流2次，合并滤液，浓缩后再用水分散成药液，药液静置，过滤，再离心后得毛冬青提取液；毛冬青提取液再分别经聚酰胺柱，由乙醇、碳酸钠水溶液洗脱，调pH为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得毛冬青提取物，提取物质量含量总黄酮以芦丁计≥54.0％，本发明方法简单，易制备，所得毛冬青提取物总黄酮，重点是毛冬青提取物总黄酮有效用于制备提高脑缺血耐受作用的药物，是毛冬青提取物的新用途，开拓了毛冬青新的药用价值，是中药上的创新。