专利名称：圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法及其应用的制作方法圣路易斯脑炎病毒属于黄病毒科，黄病毒属，1933年在美国圣路易、堪萨斯和密苏里等地约发生3000多例圣路易斯脑炎病毒感染，于死亡病人脑中分离到此病毒而得名。圣路易斯脑炎病毒是有包膜的线性单股正链RNA病毒，基因组RNA约为111Λ，病毒颗粒为圆形，大小约40 60 nm。通常，圣路易斯脑炎病毒的结构蛋白中，C蛋白构成病毒核衣壳，M 蛋白、E蛋白为病毒的包膜蛋白。PrM蛋白是膜蛋白M的前体，除具有抗原功能区外，还有助于E蛋白的正确折叠及稳定。E蛋白位于病毒颗粒的脂质双层中，构成病毒颗粒表面的突起，含有多种B细胞和T细胞抗原表位，是圣路易斯脑炎病毒的主要保护性抗原。因此，prM 蛋白和E蛋白成为研究圣路易斯脑炎的重要靶标。圣路易斯脑炎作为严重损害人类健康的病原微生物，具有高度传染性，一经流行将引发巨大社会恐慌，因此，研制快速高效的诊断试剂并找到一种有效的疫苗对于防止圣路易斯脑炎感染无疑具有重要意义。尽管相关的研究工作在不少实验室开展，但由于圣路易斯脑炎病毒的高度传染性，其病原体研究必须在P3级实验室中进行，这也极大的限制了对圣路易斯脑炎病毒的进一步了解。病毒样颗粒由于类似真实的病毒颗粒结构并不具有感染性使之成为用于圣路易斯脑炎病原体研究的安全的替代模型；其效果优于基于单个病毒蛋白的免疫学检测方法已得到证明，因此病毒样颗粒的研制成功对于烈性病毒诊断试剂的研制具有显著价值；同时， 病毒样颗粒代表一类特殊的亚单位疫苗，相比之下，它们更容易被机体免疫系统识别，并以一个更接近真实构象的形式呈递病毒抗原，因而是一个非常好的疫苗候选物。病毒样颗粒是模拟真实病毒颗粒结构的一种高效的亚单位疫苗，并且不含有感染性的病毒遗传物质； 实际上，病毒样颗粒完全没有RNA或DNA病毒的基因组成分，只是具有灭活病毒或减毒活疫苗病毒颗粒衣壳的真实构象，因而没有病毒毒力回复或病毒基因重组或重配的可能。因此，作为一种很有发展前景的疫苗候选物和安全的病毒研究替代模型，对于圣路易斯脑炎病毒这样的病原体研究和预防控制无疑具有更为重要的意义。开发一种方便、可靠的血清诊断方法来检测受感染个体血清内的抗圣路易斯脑炎病毒抗体不仅有利于临床病毒病的诊断，而且对于感染流行病学都具有重要的意义。在血清学免疫检测如EIA中使用细菌表达蛋白作为抗原存在较多潜在缺点。例如，在将大肠杆菌裂解液作为抗原用于免疫测试时会造成患者血清与大肠杆菌蛋白的非特异性交叉反应性(Purdy 等，1992，Archives of Virology, 123335-349)。另外，已经证明，膜糖蛋白上的一些抗原和免疫原性表位与构象高度相关，在大肠杆菌中表达的糖蛋白丧失了免疫原性和抗原性。此外，信号肽在外源蛋白质的表达中具有重要作用，不仅能引导外源蛋白质的分泌表达，还与蛋白质或其新生肽链在细胞内的全方位的定位有关。
为解决现有技术存在的问题，本发明一种圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法， 该方法具体为1)选取GenBank数据库中圣路易斯脑炎病毒HiAbard的基因序列、基因序列序列号为 EU566860，进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成，获得重组质粒；2)重组质粒转染哺乳动物细胞^3T，转染的细胞收获后进行瞬时表达分析；3)通过相应的纯化方法获得相应的表达蛋白，并形成圣路易斯脑炎病毒样颗粒。进一步，所述步骤1)中PCR方法进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成，该PCR方法具体为1)设计用于信号肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信号肽上游引物JF: 5，CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3，和下游引物 JR 5，TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTC CTGCACAAGCTATGA 3，；ME 上游引物 MEF :5，TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA 3，和下游引物 MER :5，CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3，；2)以划线部分分别为BamHI和)(h0 I酶切位点，以信号肽和SLEV-ME基因为模板，通过融合PCR扩增JME基因全长；
3)凝胶回收试剂盒胶回收SLEV-JME片段，分别对SJME和pcDNA5/FRT进行BamHI、 Xho I双酶切，胶回收后T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5 α，挑取单克隆菌落，扩菌提取重组质粒。进一步，所述扩增条件为先于95°C、5 min，然后 95°C、30s，65°C、30 s，72°C、3 min,扩增 35 个循环，72°C、IOmin0进一步，所述步骤2)中重组质粒转染哺乳动物细胞四31的具体步骤为转染前18-24小时接种细胞到T25细胞瓶中；将IOug质粒加入Iml无血清培养基中，再加入20ulPEI，室温孵育IOmin;倒掉旧的培养基，用无血清培养基洗两遍；加2ml培养基， 370C /5%C02孵育3小时后补加2ml培养基，72小时后进行瞬时表达分析。进一步，所述步骤3)中纯化方法具体为
1)将所述转染的细胞收获物经反复冻融及超声破碎；
2)将上清和破碎细胞离心去除细胞碎片；
3)将澄清上清通过0.45um的过滤器过滤；
4)收集上清，100KD超滤浓缩后加PBS离心缓冲液重复超滤浓缩；
5)弃去上清，PBS重悬；
6)用10%-60%的连续性蔗糖梯度离心；
7)离心分层后，逐层向下穿刺收集各个层面的所有样品，分层收集各样品包被ELISA 通过E蛋白单克隆抗体或圣路易斯脑炎病毒多克隆血清确定重组蛋白位置，获得圣路易斯脑炎病毒样颗粒。一种以圣路易斯脑炎病毒样颗粒的细胞为抗原建立的间接免疫荧光检测方法，具体为收集转染设定时间后的细胞，用预冷的IxPBS清洗细胞，取适量细胞滴到八孔显微镜载玻片上，晾干，用冷丙酮进行固定，加入稀释的抗SLEV抗体37度孵育设定时间，漂洗液洗涤；加入异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠IgG室温结合；漂洗液洗涤后于荧光显微镜下观察。一种以纯化的圣路易斯脑炎病毒样颗粒为抗原建立的蛋白印迹检测方法，具体为
1)裂解的蛋白行SDS-PAGE后转膜；
2)封闭将膜放入可密封的塑料袋中，加入适量的TBS配置的脱脂奶封闭液中，室温封闭设定时间；
3)抗体的结合用TBS配置的脱脂奶稀释纯化的抗SLEV鼠单克隆抗体作为一抗，将 PVDF膜与稀释好的抗体室温摇床孵育设定时间；
4)洗去未结合的抗体用TBS-T漂洗滤膜；
5)二抗的结合用TBS配置的脱脂奶稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，将洗涤后的PVDF膜与稀释好的二抗室温摇床孵育设定时间后，将膜用TBS-T洗涤；
6)DAB显色用TBS洗涤膜，去除磷酸和Tween 20，将膜放入DAB底物显色液中显色， 注意观察显色情况，至棕色条带出现时终止反应，照相后避光保存。进一步，所述步骤1)具体为 a取样品进行SDS-PAGE ；
b当电泳结束时，用蒸馏水淋洗玻璃板；
c.戴上手套，切2张3匪滤纸和一张PVDF滤膜，使其大小与凝胶大小相适应；
d.先将滤纸浸入转移缓冲液中，至少平衡15min，PVDF膜需进行前处理，置于100%甲醇中浸湿约5min将膜激活，再用转移缓冲液漂洗2次；
e.半干转移仪下面的电极是阳极，故在转移缓冲液中按从下至上的顺序排列滤纸一转移膜一凝胶一滤纸(可在膜的右上角切一标记，以标记膜的正反面)，各层之间应避免留有气泡；
f.将其置入半干转移仪中，胶侧置负极，膜侧置正极；
g.通电转移根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通电流，电转移45min ；
h.转移结束后，断开电源并拔下插头，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层，凝胶可移至盛有考马斯亮蓝染色液的托盘中进行染色，以便检查蛋白转移是否完全，PVDF膜用于下一步实验。一种以圣路易斯脑炎病毒样颗粒为抗原建立的检测圣路易斯病毒抗体的间接 ELISA法，具体为
1)包被抗原将纯化的蛋白抗原用ELISA包被液稀释，反应板每孔加100ul，4°C冰箱过
夜；
2)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置:3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；
3 )加 15 % FBS 封闭液 200u 1，37 °C 放置 2h ；
4)拍干后超净台风机吹干；
5)加抗体小鼠抗SLEV抗体用封闭液1:200倍稀释，反应板每孔lOOul，同时作稀释液对照，37 °C放置Ih ；
6)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次；7)加辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG，每孔lOOul，37°C放置lh;
8)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次；
9)加底物加TMBlOOul，室温暗处放置IOmin；
10)加终止液每孔50ul；
11)观察结果用酶联免疫检测仪记录450nm读数。一种用于人体以预防圣路易斯脑炎病毒感染的疫苗，它含有所述圣路易斯脑炎病毒样颗粒的配伍组合。一种检测圣路易斯脑炎病毒的试剂盒，将重组的圣路易斯脑炎病毒样颗粒作为抗原组分构成，用于SLEVIgG ELISA诊断试剂盒或SLEVIgM ELISA诊断试剂盒。本发明基于当前圣路易斯脑炎病毒的研究现状和细胞已经用于重组蛋白大量生产的现实，建立通过这种哺乳动物细胞分泌表达圣路易斯脑炎病毒重组蛋白并使之装配成病毒样颗粒的方法将是非常有用的。该系统产生的重组蛋白具有天然蛋白的免疫学特性，且不含有圣路易斯脑炎病毒感染性基因组，可以作为更具代表性的抗原或者更有效的免疫原，从而应用于圣路易斯脑炎病毒的诊断、预防和治疗工作中。


图1为显示HiAbard和Kern217毒株全基因组同源性分析结果； 图2为显示25株圣路易斯脑炎病毒E基因同源性分析结果；
图3为显示重组质粒pcDNA5/FRT-SJME的酶切鉴定结果；
图4为显示用于真核表达圣路易斯脑炎病毒蛋白而构建的重组质粒；
图5A为正常细胞检测结果；
图5Β为转染重组质粒P⑶NA5-SJME的检测结果；
图6为用圣路易斯脑炎病毒E单抗(millipore)进行Western印迹杂交；
图7A为显示细胞培养上清收获物中病毒样颗粒的电子显微镜照片；
图7B为图7A中C部放大图。

本发明针对具有天然圣路易斯脑炎病毒免疫特性的重组圣路易斯脑炎病毒膜蛋白的生产方法和应用。本发明特别针对用于圣路易斯脑炎ELISA诊断试剂的制备及其间接免疫荧光检测试剂的生产。本发明特别针对圣路易斯脑炎病毒感染的预防性疫苗的生产。本发明通过以哺乳动物细胞表达圣路易斯脑炎病毒重组蛋白以及共表达Μ、E蛋白的重组病毒样颗粒进行实际举例说明。这种举例说明不限制本发明的使用范围。本发明解决的技术问题是要将圣路易斯脑炎病毒PrM、E片段编码区序列克隆到真核表达载体，转染细胞，通过相应的纯化方法获得这些表达蛋白并可以形成相应病毒样颗粒成分，以及这些重组蛋白及病毒样颗粒的应用。本发明涉及制备衍生自圣路易斯脑炎病毒PrM、E片段基因组编码区序列的重组病毒蛋白的方法，它通过将DNA插入表达载体，然后在宿主细胞中表达重组蛋白形成病毒样颗粒。本发明生产的重组蛋白、病毒样颗粒可用于对圣路易斯脑炎病毒进行临床诊断。 可将重组蛋白，病毒样颗粒置于圣路易斯脑炎病毒检测试剂盒的配方中。提供下列实施例以进一步明确本发明，但并不限制本发明于这些实施例的个别事例。一包含引入外源信号肽的圣路易斯脑炎病毒Μ、E蛋白基因编码区序列的真核表达载体的构建(pcDNA5/FRT -SJME)
对GenBank数据库中两株圣路易斯脑炎病毒HiAbard和Kern217全基因组和25个毒株E基因进行比对，最终确定以HiAbard的基因序列(GenBank序列号为EU566860)进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成。通过拼接PCR方法扩增带有外源信号肽的prM-E基因，将其基因克隆至pcDNA5/ FRT载体，获得重组质粒pcDNA5-SJME。具体步骤如下
设计用于信号肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信号肽上游引物JF :5’ CGRRatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3，和下游引物 JR :5，TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTC CTGCACAAGCTATGA 3，；ME 上游引物 MEF :5，TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATC A 3，和下游引物 MER :5，CCGctcRaRCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3，，划线部分分别为 BamH I和Bio I酶切位点，以信号肽和SLEV-ME基因为模板，通过融合PCR扩增JME基因全长。扩增条件先于95°C、5 min，然后95°C、30s，65°C、30 s，72°C、3 min，扩增35个循环， 72°C、IOmin。凝胶回收试剂盒胶回收SLEV-JME片段，分别对SJME和pcDNA5/FRT进行BamH I、 Xho I双酶切，胶回收后T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5 α，挑取单克隆菌落，扩菌提取质粒。二、重组质粒瞬时转染细胞以前面构建引入信号肽的共表达圣路易斯脑炎病毒Μ、E蛋白的重组质粒转染哺乳动物细胞^3T，转染的细胞收获后进行瞬时表达分析。具体步骤如下
转染前18-Μ小时接种细胞到Τ25细胞瓶中(密度>85%)；将IOug质粒加入Iml无血清培养基中，在加入20ulPEI (lmg/ml)，室温孵育IOmin ；倒掉旧的培养基，用无血清培养基洗两遍。加2ml (2%serum)培养基共3ml，37°C /5%C02孵育3小时后补加2ml (2%serum) 培养基，72小时后进行瞬时表达分析。三、圣路易斯脑炎病毒蛋白在细胞中的表达
在重组质粒瞬时转染细胞的基础上，建立了间接免疫荧光检测转染细胞病毒蛋白表达的鉴定方法，具体步骤如下
收集转染后细胞，用预冷的IxPBS清洗细胞两遍，取适量细胞滴到八孔显微镜载玻片上，晾干，冷丙酮固定lOmin，加入稀释的抗SLEV抗体(使用PBS 1 40稀释)37度孵育1 h， 漂洗液洗涤5次，每次;3min;加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG室温结合40min(使用伊文思兰1:50稀释)。漂洗液洗涤5次后于荧光显微镜下观察。四哺乳动物细胞表达圣路易斯脑炎病毒样颗粒的纯化
细胞收获物经反复冻融及超声破碎和细胞培养上清IOOOOrpm离心IOmin去除细胞碎片，将澄清上清通过0.45um的过滤器过滤后，以IOOKD超滤管浓缩浓缩50000 rpm超速离心弃去上清，细胞重悬于约200ulPBS后，用10%-60%的连续性蔗糖梯度离心，离心分层后， 逐层向下穿刺收集各个层面的所有样品，分层收集各样品包被ELISA通过E蛋白单克隆抗体或圣路易斯脑炎病毒多克隆血清确定重组蛋白位置，是为圣路易斯脑炎病毒样颗粒所在组分。具体步骤如下
(1)细胞反复冻融3次，超声破碎；
(2)将上清和破碎细胞4°CIOOOOrpm离心IOmin去除细胞碎片；
(3)将澄清上清通过0.45um的过滤器过滤；
(4)收集上清，IOOKD超滤浓缩后加PBS离心缓冲液重复超滤浓缩，透过的液体-80°C 保存；
(5)50000rpm, 3h, 4°C (SW55Ti 转子)弃去上清，200ul PBS 重悬;
(6)10%_60% 的连续性蔗糖梯度离心，30000rpm，2. 5h，10°C (SW55Ti 转子)；
(7)收集各层，每层55000印111，汕，41(SW55Ti转子)，留沉淀加20ulPBS (蛋白酶抑制剂)，4°C保存。五纯化产物的蛋白印迹检测 Western Blot 分析
米用 Bio-Rad 公司的 Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell 进行半干法蛋白质转移实验
1)裂解的蛋白行SDS-PAGE后转膜 a取样品进行SDS-PAGE ； b当电泳结束时，用蒸馏水淋洗玻璃板；
c.戴上手套，切2张3匪滤纸和一张PVDF滤膜，使其大小与凝胶大小相适应；
d.先将滤纸浸入转移缓冲液中，至少平衡15min，PVDF膜需进行前处理，置于100%甲醇中浸湿约5min将膜激活，再用转移缓冲液漂洗2次；
10e.半干转移仪下面的电极是阳极，故在转移缓冲液中按从下至上的顺序排列滤纸一转移膜一凝胶一滤纸(可在膜的右上角切一标记，以标记膜的正反面)，各层之间应避免留有气泡；
f.将其置入半干转移仪中，胶侧置负极，膜侧置正极；
g.通电转移根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通电流，电转移45min ；
h.转移结束后，断开电源并拔下插头，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层，凝胶可移至盛有考马斯亮蓝染色液的托盘中进行染色，以便检查蛋白转移是否完全，PVDF膜用于下一步实验；
2)封闭将膜放入可密封的塑料袋中，加入适量的TBS配置的5%(w/v)脱脂奶封闭液中，室温封闭1 一 2小时；
3)抗体的结合用TBS配置的5%(w/v)脱脂奶1 :200稀释纯化的抗SLEV鼠单克隆抗体作为一抗，将PVDF膜与稀释好的抗体室温摇床孵育2小时；
4)洗去未结合的抗体用TBS-T(0. 5%的Tween20)漂洗滤膜3次，每次5min ；
5)二抗的结合用TBS配置的5% (w/v)脱脂奶1 :500稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，将洗涤后的PVDF膜与稀释好的二抗室温摇床孵育1小时后将膜用TBS-T洗涤 3次；
6)DAB显色用50mlTBS洗涤膜，去除磷酸和Tween 20。将膜放入DAB底物显色液中显色10 30分钟，注意观察显色情况。至棕色条带出现时终止反应，照相后避光保存。六间接ELISA法的建立
1)包被抗原将纯化的蛋白抗原用ELISA包被液稀释，反应板每孔加100ul，4°C冰箱过
夜；
2)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；
3)加1 5 % FBS 封闭液 200ul，37°C放置 2h ；
4)拍干后超净台风机吹干；
5)加抗体小鼠抗SLEV抗体用封闭液1:200倍稀释，反应板每孔lOOul，同时作稀释液对照，37 °C放置Ih ；
6)洗涤同2);
7)加辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG(1:5000倍稀释)，每孔lOOul, 37°C放置Ih ；
8)洗涤同2);
9)加底物加TMBlOOul，室温暗处放置IOmin；
10)加终止液每孔50ul；
11)观察结果用酶联免疫检测仪记录450nm读数。本发明中，使圣路易斯脑炎病毒样颗粒能够高分泌表达的信号肽及包含编码包括所述信号肽和圣路易斯脑炎病毒包膜蛋白(M，E)重组病毒的构建及其在相应重组病毒感染哺乳动物细胞中的共表达，以及由这些共表达蛋白在哺乳动物细胞中自动组装而形成的病毒样颗粒。以哺乳动物细胞生产的这些蛋白或病毒样颗粒可作为抗原建立圣路易斯脑炎病毒的免疫检测方法，亦可用于制备圣路易斯脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发及治疗方面。 通过哺乳动物细胞表达系统得到的圣路易斯脑炎病毒样颗粒是非复制型的，结构接近天然病毒，且免疫原性好，可作为天然病毒抗原建立检测圣路易斯脑炎感染的免疫检测方法，表达路易斯脑炎包膜蛋白的细胞，可建立间接免疫荧光检测方法，进一步的应用还包括将得到的病毒样颗粒或重组蛋白可按一定的作用剂量作为亚单位疫苗直接用于人体用于预防圣路易斯脑炎病毒感染。


本发明公开了一种圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法及其应用，本发明中通过哺乳动物细胞表达系统得到的圣路易斯脑炎病毒样颗粒是非复制型的，结构接近天然病毒，且免疫原性好，可作为天然病毒抗原建立检测圣路易斯脑炎感染的免疫检测方法，表达路易斯脑炎包膜蛋白的293T细胞，可建立间接免疫荧光检测方法，进一步的应用还包括将得到的病毒样颗粒或重组蛋白可按一定的作用剂量作为亚单位疫苗直接用于人体用于预防圣路易斯脑炎病毒感染及诊断试剂的研发。