专利名称：一种含黄酮类化合物抗衰老乳酸菌饮料及其制作方法乳酸菌饮料是一种发酵型的酸性含乳饮料，通常是指以鲜乳或乳粉、植物蛋白粉、果蔬菜汁或糖类为原料，经杀菌、冷却、接种乳酸菌发酵剂培养发酵，然后经稀释(向发酵后的乳液中加入水、糖液等调制)而得的制品。乳酸菌饮料根据产品中是否存在活性乳酸菌(是否进行后杀菌)分为活菌型和杀菌型(活性乳酸菌饮料和非活性乳酸菌饮料)两大类。活性乳酸菌饮料含有活性乳酸菌，可以在肠道内抑制有害菌的生长，调节肠道微生态的平衡，增强人体的免疫力；也有研究报道乳酸菌体内含有氧化还原酶和过氧化物酶，可以对抗人体内的自由基，还能抑制腐败菌生长，减少其代谢物中的氨、硫化氢、吲哚及粪臭素等有害物质的生成，因此有抗衰老、防止色素沉积的作用。活性乳酸菌饮料由于其显著的保健功效且兼具普通饮料的口感清爽、饮用方便、口味性等特点而越来越受到消费者的欢迎。根据人们对健康和/或口味的要求，在乳酸菌饮料中通过添加不同风味的营养物质制造出的新型乳酸菌饮料正在成为一种发展趋势，这些乳酸菌饮料中有的添加有维生素、矿物质、果汁或是一些具有保健作用的氨基酸、肽或功能性因子等物质。黄酮类化合物(flav onoids)是一类广泛分布于植物体内的低分子多酹类物质，在人类的饮食中它集中于水果、蔬菜、葡萄酒、茶叶和可可中，它们具有抑制脂质过氧化、螯合金属离子和消弱其他氧化反应的作用。许多研究揭示黄酮类化合物因其抗氧化作用而具有抗衰老、抗病毒等多种生物活性。目前还没有将黄酮类化合物添加到活性乳酸菌饮料以达到抗衰老功能性的相关研究。主要原因在于活性乳酸菌饮料的生产技术中，控制体系的稳定性是保证饮料质量的关键技术之一，如果物质的添加如果导致饮料的原料配方不合适或对生产工艺控制不当，饮料产品极易出现分层、脂肪上浮或蛋白沉淀等现象；并且通常天然黄酮提取物自身带有较深颜色且味道偏苦，加到乳制品中会明显影响产品品质。
本发明的一个目的在于提供一种含有黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料的制作方法，通过对黄酮类化合物进行特殊的预处理工艺，将其添加到活性乳酸菌饮料中，使产品中含有黄酮类化合物而具有一定的抗衰老功能，并且最大程度消除或减小天然黄酮类化合物的颜色及苦味对活性乳酸菌饮料的影响，保证产品品质；进一步，所述黄酮类化合物的添加还能促进发酵工艺。本发明的另一目的在于提供一种按照本发明的方法生产得到的含有黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料，该饮料产品中含有黄酮类化合物及活性乳酸菌，适合各种不同人群饮用，有益人体健康，特别具有抗衰老功效；并且，该活性乳酸菌饮料具有独特的风味和清爽的口感以及良好的稳定性。一方面，本发明提供了一种含有黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料的制作方法，该方法包括步骤:(I)对黄酮类化合物进行预处理:将黄酮类化合物原料溶于食用酒精中，加入55 65°C的β -环糊精饱和水溶液中，维持55 65°C搅拌2 2.5小时，得白色混悬液，冷却至室温下静置过夜，过滤，得沉淀物，所得沉淀物于50°C以下的温度下干燥，得到经预处理后的黄酮类化合物；(2)制备酸奶基料:将经预处理后的黄酮类化合物加入到牛奶中，或将经预处理后的黄酮类化合物、乳粉充分溶解到水中，配制发酵底物料液，并控制该发酵底物料液中经预处理后的黄酮类化合物的含量为0.1% 0.5% ;上述发酵底物料液在55 65 °C、15 30MP下进行均质，然后在90 121°C杀菌5分钟 120分钟，之后冷却到42 ± 2 °C，接种发酵剂，42 ± 2 °C发酵，待pH达到4.0 ± 0.1、酸度达到85 110° T之间时终止发酵，得到酸奶基料；(3)上述酸奶基料经稀释制得含有黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料。本发明中，除特别注明外，所述比例和含量均为重量比例和含量。根据本发明的具体实施方案，所述黄酮类化合物原料应符合相关标准的要求，可通过商购获得。本发明中使用的具体黄酮类化合物种类例如可以为沙棘黄酮(具体可以是从沙棘叶提取的黄酮类化合物，也可以是从沙棘果提取的黄酮类化合物)、银杏黄酮(主要是从银杏叶中提取的黄酮类化合物)等天然植物黄酮提取物。一般普通的天然植物黄酮类化合物纯度较低(各厂家不同产品规格纯度不同，总黄酮含量一般20% 65%左右)，自身都带有较深的颜色且口感偏苦。可以理解，本发明中应尽可能选择纯度较高的黄酮类化合物原料。本发明中，通过对所述黄酮类化合物进行特定的预处理工艺，所得到的经预处理后的黄酮类化合物已很大程度遮蔽掉自身的颜色和苦味，进一步添加到基料中，发酵制备活性乳酸菌饮料，从而可最大程度消除或减小天然黄酮类化合物的颜色及苦味对活性乳酸菌饮料的影响，保证产品品质。并且，发明人在研究中还发现，所述经预处理后的黄酮类化合物的添加，还能加速发酵速度，有效缩短发酵时间，从而可减少发酵的风险，相应提高生产效率，降低生产成本，并且，对发酵产品中的活菌数具有增殖作用。根据本发明的优选具体实施方案，在对黄酮类化合物原料进行预处理时，是先将黄酮类化合物原料溶于食用酒精中(食用酒精的量能溶解所述的黄酮类化合物原料即可)，该食用酒精的使用能够按照本发明的方法处理后的黄酮类化合物更好地遮蔽了其颜色及苦味，保证产品品质。优选地，本发明中是将黄酮类化合物原料3 5.5倍重量的β -环糊精配制成饱和水溶液，所述β -环糊精饱和水溶液的温度为55 65°C更优选为60 65°C (对于沙棘黄酮，最优选的β -环糊精饱和水溶液的温度为62°C )，将用食用酒精溶解后的黄酮类化合物加入到该β -环糊精饱和水溶液中，维持温度55°C 65°C更优选为60 65°C搅拌2 2.5小时，得白色混悬液，冷却至室温下静置过夜，过滤，得沉淀物，所得沉淀物于50°C以下的温度下干燥，得到经预处理后的黄酮类化合物。根据本发明的具体实施方案，所述的经预处理后的黄酮类化合物与未经预处理前的黄酮类化合物原料相比会有所增重，通常为处理前黄酮类化合物原料的3.5 4.5倍。根据本发明的优选具体实施方案，所述的经预处理后的黄酮类化合物在发酵液中的添加量为0.1% 0.5%，优选为0.3% 0.5%。根据本发明的具体实施方案，本发明的酸奶基料的主要原料——牛奶是指符合我国生鲜牛乳收购标准的鲜奶或还原乳，可以是全脂牛奶、部分脱脂的低脂牛奶、全部脱脂的牛奶，所述乳粉可以是全脂奶粉、脱脂奶粉或部分脱脂奶粉。根据本发明的具体实施方案，本发明的制作活性乳酸菌饮料的方法中，所述发酵底物中还含有4% 7%的白砂糖。在发酵底物料液中加入部分白砂糖，控制该含有白砂糖的发酵底物的高温杀菌条件，还会产生一种焦糖风味，从而给本发明的产品带来特殊的美好风味。根据本发明的具体实施方案，本发明的制作活性乳酸菌饮料的方法中，所述发酵底物中还含有1% 5%的还原糖，所述还原糖选自葡萄糖、果葡糖浆、果糖中的一种或多种。还原糖的添加可以使发酵底物在高温杀菌过程中产生美拉德反应，使产品具有特殊的褐色色泽。根据本发明的具体实施方案，还可以在发酵底物中添加适量的果汁(如橙汁、桃汁、蓝莓汁、葡萄汁等)或蔬菜汁浆(如胡萝卜汁浆、番茄汁浆、芹菜汁浆等)等，以制作果蔬型乳酸菌饮料。根据本发明的一具体实施方案，本发明的发酵底物的原料组成包括(以原料总重1000重量份计):还原糖10 50重量份和/或白砂糖40 70重量份；经预处理后的黄酮类化合物I 5重量份，果汁或蔬菜汁浆O 100重量份，鲜牛乳余量。根据本发明的另一具体实施方案，本发明的发酵底物的原料组成包括(以原料总重1000重量份计):固体乳粉100 180重量份；还原糖10 50重量份和/或白砂糖:40 70重量份；经预处理后的黄酮类化合物I 5重量份，果汁或蔬菜汁浆O 100重量份，水余量。本发明中，对发酵底物料液在55 65°C、15 30MP下进行均质，可以使其稳定性更好。均质后的料液在90 121°C下处理5分钟 120分钟，高温长时间的杀菌处理可以使料液中的蔗糖产生焦糖风味，同时可使料液中含有的还原糖产生美拉德反应。根据本发明的具体实施方案，本发明的制作活性乳酸菌饮料的方法中，所述发酵剂中菌种为包含嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌与植物乳杆菌的混合菌种，优选所述嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌与植物乳杆菌的添加比例为2: I: I 4，例如可以是2:1: 1、2:1: 2、2:1: 3、2:1: 4，最优选添加比例为2:1: 2。菌初始添加量为通常为1.0XlO6 3.0X107。根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述发酵菌种还可包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus, acidophilus)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(B.1ongum)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、干酪乳杆菌(L.casei)和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus.GG)等益生菌中的一种或多种。这些菌种的具体添加量可以参照所属领域的常规操作进行。根据本发明的具体实施方案，本发明的活性乳酸菌饮料的制作方法中，所述酸奶基料经稀释后制得的活性乳酸菌饮料中，所述酸奶基料的含量为30% 50%，优选为30% 40%，且该活性乳酸菌饮料的甜度为折合成其中含有9% 16%的蔗糖的甜度，pH值3.5 4.0。所述甜度可以用甜味料调节，所述甜味料可以选自蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖醇、安赛蜜、阿斯巴甜和甜蜜素中的一种或多种。所述产品PH值可以用酸味调节剂调节，例如可以是苹果酸、柠檬酸、乳酸等。根据本发明的具体实施方案，本发明中，在所述酸奶基料稀释制备活性乳酸菌饮料的过程中，还加入了 0.1 % 05 %的稳定剂,所述稳定剂选自CMC、大豆多糖体、果胶、PGA、结冷胶、黄原胶、海藻酸钠中的一种或多种。根据本发明的优选具体实施方案，本发明的乳酸菌饮料的配料组成中包括:30% 50% (优选30% 40% )的酸奶基料、0.2% 0.5%的果胶(或CMC 0.3 % 0.5% )、9% 16%的白砂糖或同等甜度的其他甜味料、0.02% 0.05%的柠檬酸或乳酸，以及适量的纯水，以使各组分之和为100%。本发明中，各原料均可商购获得，各原料性能指标符合相关质量标准要求。根据产品的口味需求，本发明的饮料产品中还可添加适量的香精香料，具体操作可以按照本领域的现有技术进行。根据本发明的具体实施方案，本发明的活性乳酸菌饮料的制作方法中，是将饮料配方中除酸奶基料以外的其它组分混合，例如是将甜味物质、稳定剂与水混合均匀，杀菌并降温后与酸奶基料混合，混合后的物料在20 30°C、15 30MP压力下均质后灌装，得富含黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料产品。本发明所述的乳酸菌饮料可以分为酸乳型以及果蔬型，酸乳型乳酸菌饮料是在酸奶的基础上将其破碎，配入白糖、香料、稳定剂等通过均质而制成的均一稳定的液态饮料；果蔬型乳酸饮料可以是前述发酵底物中加入了适量的果蔬汁制备的酸奶基料经稀释制成，或者是普通酸奶基料进一步与适量的果蔬汁混合，并通过加糖、加稳定剂或香料等调配、均质后制作而成。本发明中对产品的包装形式没有特定要求，可以采用目前市场上常见的活性乳酸菌饮料的包装形式。例如，本发明可以采用屋顶盒包装，或者采用PET、HDPE、BOPP等塑瓶包装。本发明的生产工艺中所用的设备均可采用本领域中的公知设备和相关技术，在此不再对具体的生产设备和灌装工艺进行赘述。本发明还提供了按照本发明的方法制备得到的富含黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料。具体地，该富含黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料中，活菌数> 1.0X107cfu/ml，蛋白含量> 1.0%。本发明的活性乳酸菌饮料，具有独特的风味和清爽的口感以及良好的稳定性，可在低温(O 6°C)冷藏下保存长达40天以上不出现不可接受的分层、沉淀以及脂肪上浮现象。综上所述，本发明通过在在酸奶发酵过程中添加经特定预处理后的黄酮类化合物，制作活性乳酸菌饮料，提高了活性乳饮料中的黄酮类化合物水平，所含有的黄酮类化合物是天然植物生物活性成分，对人体安全、无副作用，还进一步扩大了乳饮料的抗衰老功能性。本发明通过恰当的工艺手段，使得到的饮料不仅具有益生菌的保健功能，还具有独特的风味和清爽的口感，以及良好的稳定性。并且，本发明中添加特定预处理后的黄酮类化合物，还能促进发酵，缩短发酵时间，以减少发酵的风险，相应提高生产效率，降低生产成本。本发明的黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料，是符合现代人需要的功能性活性乳酸菌饮料制品，具有广阔的应用前景。
3)调酸:调控物料温度至25°C，加入柠檬酸进行调酸，调至pH3.6，达到酸甜比可Π ；4)均质:将上述饮料进行均质，均质压力为18MPa，要求均质机提前杀菌，且均质温度要低于50°C，优选20 30°C，防止菌株活力的降低；均质后灌装，得到本实施例的富含黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料。实施例2富含黄酮类化合物的活性褐色乳酸菌饮料及其制作方法1.对黄酮类化合物进行预处理:本实施例所用黄酮类化合物原料同实施例1。取所述沙棘黄酮原料100g，充分溶于约IOOml的食用酒精(纯度约90% )中；取400g β -环糊精，配制成62°C的饱和水溶液中；将用食用酒精溶解后的黄酮类化合物加入到该β -环糊精饱和水溶液中，维持温度62°C缓慢搅拌2小时，得白色混悬液，冷却至室温下静置过夜，过滤，得沉淀物，所得沉淀物于45°C烘干，得到经预处理后的黄酮类化合物。该经预处理后的黄酮类化合物为白色粉末，无异味。经检测，其中黄酮类化合物化合物含量为 12.76±0.21% (η = 3)。2、制备酸奶基料:(I)原料奶的标准化:选择优质、安全、合格的鲜牛奶为主要原料进行标准化；(2)配料:将上述经预处理后的黄酮类化合物加入到原料奶中，添加量为酸奶基料总重量的0.3% ;在原料奶中加入酸奶基料总重量5%的果葡糖浆；(3)均质:将上述加入了经预处理后的黄酮类化合物和糖的原料奶升温至65°C进行至均质，均质压力为18MPa ；(4)揭变:将上述均质后的料液进彳丁杀囷，杀囷要求为121 C，IOmin ；(5)冷却:将杀完菌的料液急冷至42±2°C ；(6)接种、发酵:将混合菌种(混合菌种包括:嗜热链球菌:保加利亚乳杆菌:植物乳杆菌=2: I: 3，初始接种量为lX107cfu/mL)接种至上述冷却好的料液中搅拌均匀，在42±2°C的条件下，保温发酵，待pH达到4.0左右，酸度达到105° T时终止发酵，得到酸奶基料。3、活性乳酸菌饮料的制备:活性乳酸菌饮料配方:酸奶基料30%，白砂糖10%，CMC 0.45%，柠檬酸0.05%,
余量纯水；I)糖液的制备:在配料罐中加入配方中规定的纯水，升温至60 65°C。将配方稳定剂及白砂糖进行干混合后溶于纯水中，循环20min后，121°C杀菌lOmin，后冷却至10 20 0C ；2)加入奶基:将步骤2中发酵好的奶基按照配方要求加入配料罐，充分搅拌均匀，此操作注意在无菌状态下完成；3)调酸:调控物料温度至25°C，加入柠檬酸进行调酸，调至pH3.5，达到酸甜比可Π ；4)均质:将上述饮料进行均质，均质压力为18MPa，要求均质机提前杀菌，均质温度30°C，防止菌株活力的降低；均质后灌装，得到本实施例的富含黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料。
实施例3富含银杏黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料及其制作方法1.对黄酮类化合物进行预处理:本实施例所用黄酮类化合物原料为商购银杏黄酮(银杏叶提取物)，为浅黄棕色可流动性棕黄色粉末，略有银杏叶香味，味苦。其中总黄酮甙含量:24-26% (HPLC法)，总萜内酯含量8-10% (HPLC法)，白果内酯彡2.5%，银杏内酯A彡1.4%，银杏内酯B彡1.2%，银杏内酯C彡0.9 %，银杏酸彡l-5ppm,重金属含量彡20ppm, AS ( 1PPM，干燥失重彡3 %，炽灼残渣彡1.5%，溶济残留彡I %。取所述银杏黄酮原料100g，充分溶于约80ml的食用酒精(纯度约90% )中；取500g β -环糊精，配制成62°C的饱和水溶液中；将用食用酒精溶解后的黄酮类化合物加入到该β -环糊精饱和水溶液中，维持温度62°C缓慢搅拌2小时，得白色混悬液，冷却至室温下静置过夜，过滤，得沉淀物，所得沉淀物于45°C烘干，得到经预处理后的黄酮类化合物约395g02、制备酸奶基料:(I)原料奶的标准化:选择优质、安全、合格的鲜牛奶为主要原料进行标准化；(2)配料:将上述经预处理后的黄酮类化合物加入到原料奶中，添加量为酸奶基料总重量的0.5% ;(3)均质:将上述加入了经预处理后的黄酮类化合物的原料奶升温至65°C进行至均质，均质压力为18MPa ；(4)揭变:将上述均质后的料液进彳丁杀囷，杀囷要求为120C，5min ；
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(5)冷却:将杀完菌的料液急冷至42±2°C ；(6)接种、发酵:将混合菌种(混合菌种包括:嗜热链球菌:保加利亚乳杆菌:植物乳杆菌=2: I: 2，初始接种量为lX107cfu/mL)接种至上述冷却好的料液中搅拌均匀，在42 ± 2°C的条件下，保温发酵，待pH达到4.0左右，酸度达到90° T时终止发酵，得到酸奶基料。3、活性乳酸菌饮料的制备:活性乳酸菌饮料配方:酸奶基料30%，白砂糖14%，CMC 0.43%，柠檬酸适量，余量纯水；I)糖液的制备:在配料罐中加入配方中规定的纯水，升温至60 65°C。将配方稳定剂及白砂糖进行干混合后溶于纯水中，循环20min后，121°C杀菌lOmin，后冷却至10 20 0C ；2)加入奶基:将步骤2中发酵好的奶基按照配方要求加入配料罐，充分搅拌均匀，此操作注意在无菌状态下完成；3)调酸:调控物料温度至25°C，加入柠檬酸进行调酸，调至pH3.8，达到酸甜比可Π ；4)均质:将上述饮料进行均质，均质压力为18MPa，要求均质机提前杀菌，均质温度30°C，防止菌株活力的降低；均质后灌装，得到本实施例的富含黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料。实施例4富含黄酮类化合物的低脂活性乳酸菌饮料及其制作方法1.对黄酮类化合物进行预处理:
本实施例中所用黄酮类化合物及预处理过程同实施例1。2、制备酸奶基料:(I)原料奶的标准化:选择优质、安全、合格的脱脂鲜牛奶(要求脂肪含量< 1% )为主要原料进行标准化；(2)配料:将制备黄酮类化合物预处理物加入到原料奶中，添加量为酸奶基料总重量的0.3% ;(3)均质:将原料奶升温至60°C进行至均质，均质压力为18MPa ；(4)杀囷:将上述均质后的料液进打杀囷，杀囷要求为95 C，IOmin ;(5)冷却:将杀完菌的料液急冷42±2°C ；(6)接种、发酵:将混合菌种(嗜热链球菌:保加利亚乳杆菌:植物乳杆菌=2:1: 2，初始接种量为lX107cfu/mL)接种至上述冷却好的料液中搅拌均勻，在42±2°C的条件下，保温发酵，待PH达到4.0左右，酸度达到100° T时终止发酵。3、活性乳酸菌饮料的制备:活性乳酸菌饮料配方:酸奶基料30%，白砂糖12%，果胶0.35%，乳酸适量，余量纯水；I)糖液的制备:在配料罐中加入配方中规定的纯水，升温至60 65°C。将配方稳定剂及白砂糖进行干混合后溶于纯水中，循环20min后，121°C杀菌lOmin，后冷却至20°C ；2)加入奶基:将步骤2中发酵好的酸奶基料按照配方要求加入配料罐，充分搅拌均匀，此操作注意在无菌状态下完成；3)调酸:调控物料温度至25°C，加入乳酸进行调酸，调至PH3.5，达到酸甜比可Π ；4)均质:将上述饮料进行均质，均质压力为18MPa，要求均质机提前杀菌，均质温度25 °C，防止菌株活力的降低；均质后灌装，得到本实施例的富含黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料。对比例I本对比例中，未添加黄酮类化合物预处理物，而是直接以原料奶发酵制备酸奶基料并进一步制备活性乳酸菌饮料，其他工艺条件同实施例1，制备得到作为对比样的乳酸菌饮料。对比例2本对比例中，未对黄酮类化合物进行预处理，而是直接将实施例1中所用的沙棘黄酮类化合物原料添加到原料奶发酵制备酸奶基料并进一步制备活性乳酸菌饮料，其他工艺条件同实施例1，制备得到作为对比样的乳酸菌饮料。对比例3本对比例中，未对黄酮类化合物进行预处理，而是直接将实施例3中所用的银杏黄酮类化合物原料添加到原料奶发酵制备酸奶基料并进一步制备活性乳酸菌饮料，其他工艺条件同实施例3，制备得到作为对比样的乳酸菌饮料。富含黄酮类化合物的活性乳饮料的抗衰老活性验证 对本发明实施例1 4及对比例I 3生产得到的产品抗衰老指标进行评测，评测方法是利用南京建成生物工程研究所销售的丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒，具体操作按照试剂盒说明书进行，检测各实施例及对比例产品对D-半乳糖衰老模型小鼠血清、肝脏、脑中SOD、GSH-Px、MDA含量的影响，判断各组产品抗衰老能力。测定结果如表1、表2、表3。表I小鼠血清、肝脏、脑中SOD的活性(i±s,n=10)


本发明提供了一种含黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料及其制作方法，其中是对黄酮类化合物进行预处理，然后将经预处理后的黄酮类化合物加入到牛奶中，或将经预处理后的黄酮类化合物、乳粉充分溶解到水中，配制发酵底物料液，经均质、杀菌后发酵制作酸奶基料，在经稀释制得含有黄酮类化合物的活性乳酸菌饮料。本发明通过对黄酮类化合物进行特殊的预处理工艺，将其添加到活性乳酸菌饮料中，使产品中含有黄酮类化合物而具有一定的抗衰老功能，并且最大程度消除或减小天然黄酮类化合物的颜色及苦味对活性乳酸菌饮料的影响，保证产品品质；进一步，所述黄酮类化合物的添加还能促进发酵工艺。