专利名称：异源表达内切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其应用的制作方法纤维素是由β -1，4-糖苷键连接而成D-吡喃式葡萄糖聚合物，是地球上最丰富且可再生的资源。据估计，地球上每年光合作用产生1.5 X IO11亿吨纤维素(Ryu，D.D等，1980，Enzyme and Microbial Technology)。多数情况下,要高值化利用纤维素首先必须通过纤维素酶对其进行有效降解。自然界中产纤维素酶的生物很多，主要是微生物，如丝状真菌、细菌和放线菌等。因此，对产纤维素酶微生物的筛选或遗传改造研究及应用就受到了普遍的关注。自然界中各种微生物所产的纤维素酶组分和比例不尽相同，例如丝状真菌纤维素酶系(Cellulase system) 一般包括3种水解酶，即内切型β _1，4_葡聚糖(Endoglucanase, EC3.2.1.4)、外切型 β -1,4-葡聚糖酶(Exo-glucanase, EC3.2.1.91)和β _ 葡萄糖苷酶(β -Glucosidase, EC3.2.1.21) (Fogarty M, Kelly C Τ, 1990, MicrobialEnzymes and Biotechnology), 3种纤维素酶组分协同作用才能将纤维素水解成葡萄糖。其中木霉(Trichoderma sp.)作为工业化生产纤维素酶的菌株，其纤维素酶系中有2个外切酶组分(Cbh I和Cbh II)和5个内切酶组分(Eg 1、Eg II,Eg III,Eg IV和Eg V)。由于木霉具有高效分泌表达和高密度发酵等优点，常被用来构建工程菌生产其它工业酶。而利用基因工程手段高效表达外源基因，也是改变木霉宿主酶系组成的重要方法之一，如通过高效表达异源β_葡萄糖苷酶基因，可以有效弥补木霉纤维素酶系中β_葡萄糖苷酶的不足，提高菌株的滤纸酶活(Jiwei Zhang等,2010, Bioresource Technology)。目前,纤维素酶系中的各组分均可在木霉中得到有效表达需要提及的是，木霉纤维素酶系的最适pH值为4.5-5.5，在近中性和碱性条件下(pH6.5-8.0)几乎没有效果。因此，在织布除毛、牛仔布磨损和洗旧的现有工艺中，必须先调pH至酸性，再加纤维素酶。为了进一步简化工序,节约生产成本和劳动量,急需通过遗传工程方法获得在中性和碱性条件下适用的纤维素酶系。
本发明的目的是提供一种异源表达内切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其应用，即利用基因工程手段，将特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶基因转化入木霉中，构建木霉工程菌株。该工程菌能高效表达内切葡聚糖酶基因，从而增加了其纤维素酶系的内切酶组分，提高了酶活性；而意想不到的是，与未转化的木霉相比，本发明构建的木霉工程菌的纤维素酶系的PH适用范围得到了显著扩大，可以在中性或偏碱性条件下直接应用。申请人:在经过长期的筛选后发现 ，将来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶基因转化入木霉中，木霉纤维素酶系的pH适用范围得到了显著扩大，从而促成了本发明。本发明的一个方面涉及一种木霉工程菌，该工程菌携带有能表达特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶的表达载体。所述的木霉为里氏木霉(Trichoderma reesei)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)中的任一种。其中里氏木霉YFZX-1 (hph+, egV) (Trichoderma reesei YFZX-1 (hph+, egV))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于地址为武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山的“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO:M 2011469。康氏木霉YFZX-2 (egv) (Trichoderma koningii YFZX-2 (egv))工程菌，已于 2011年12月13日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO:M 2011470。绿色木霉YFZX-3 (hph+, egV) (Trichoderma viride YFZX-3 (hph+, egV))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO:M 2011471。上述的特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶,其特征在于:I)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的内切葡聚糖酶；2)在I)中限定的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有特异腐质霉的内切葡聚糖酶功能的，由I)衍生的蛋白质。上述的特异腐质霉的内切葡聚糖酶的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。所述的表达载体，其启动子序列为木霉cbhl启动子，终止子序列为木霉cbhl终止子，筛选标记为潮霉素，其一种图谱如图1所示。本发明另一方面涉及上述木霉工程菌的应用，用于生产纤维素酶系，所述纤维素酶系可在中性或碱性条件下适用。上述生产的纤维素酶在纺织工业领域中的应用，尤其在针织面料、梭织面料的表面除毛，针织面料、梭织面料的除毛染色一浴工艺，针织面料、梭织面料的除毛除氧一浴工艺以及牛仔面料的起花及除毛等领域的使用方法。本发明的木霉工程菌能高效表达特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶基因，从而增加了其纤维素酶系的内切酶组分，改变了酶学PH特性，明显扩大了其纤维素酶系在中性和碱性条件下的适用范围；本发明生产的纤维素酶产品在PH 4.0-8.0范围内，无需调酸可直接应用于水洗做旧、织布抛光等纺织工业领域，且效果良好，从而简化了应用工艺，节约成本。图1:构建的重组表达载体不意图；图2:PCR扩增鉴定转化子的电泳图；其中:A为PCR扩增潮霉素基因部分序列；B为PCR扩增目的基因；图3 =SDS-PAGE鉴定木霉工程菌所表达的目的蛋白:箭头所示为内切葡聚糖酶。图4:木霉工程菌YFZX-1所产纤维素酶的pH特性分析。
1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44% (NH4)2SO4,0.09% MgSO4, 2% KH2PO4,0.04% CaCl2,0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000)，28°C培养48小时，然后25°C培养48小时；取上清样进行SDS-PAGE检测(图3)。将I株阳性转化子命名为Trichoderma reeseiYFZX-U 保藏号:CCTCC NO:M 2011469)。工程菌 Trichoderma reesei YFZX-1 纤维素酶的pH特性分析显示:与出发菌株相比，工程菌酶液的pH适用范围更宽泛，在pH4.0-8.0条件下，都具有较高的酶活水平。(图4)同样的，采用实施例1-4中所述步骤，分别转化康氏木霉(Trichoderma.koningii)和绿色木霉(Trichoderma.viride),获得表达特异腐质霉内切葡聚糖酶基因的康氏木霉阳性转化子，命名为Trichoderma.Koningii YFZX-2 (保藏号:CCTCC NO:M 2011470)和绿色木霉阳性转化子 Trichoderma.viride YFZX-3 (保藏号:CCTCC NO:M2011471)。与出发菌株相比，康氏木霉工程菌和绿色木霉工程菌酶液的pH适用范围也更宽泛了。同时，还将表达载体转入了长枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、钩状木霉(Trichoderma hamatum),获得的工程菌的酶液 pH 适用范围也更宽泛了。上述结果表明木霉类的微生物对来源于特异腐质霉的内切葡聚糖酶具有一种未知的修饰作用。对衍生酶(例如SEQ ID NO:5)的实验也具有类似的结果。实施例5纤维素酶产品的制备将上述木霉工程菌接种于摇瓶种子培养基(葡萄糖10_30g/L，土豆100-200g/L)，30°C，200rpm摇床培养48h之后，将发酵液转入I吨种子罐(培养基为:葡萄糖20_50g/L，硫酸铵10-30g/L，硫酸镁5-10g/L，磷酸二氢钾15_30g/L)，温度控制在25 土 1°C，pH值
5.0±0.2，在种子罐培养48h之后，将种子液转入30吨发酵罐(培养基为:葡萄糖30-50g/L,乳糖2.0-10g/L,玉米浆20-50g/L,硫酸铵10_30g/L，硫酸镁5-lOg/L，磷酸二氢钾15-30g/L)，温度控制在25 ± I °C，pH值控制在5.0±0.2，在发酵罐培养IOh到15h之后，开始补加乳糖诱导菌体产酶，发酵时间约为200h到230h制成发酵菌液。发酵菌液可以直接用来对纤维素进行降解，也可以用来制备纤维素酶。 制备纤维素酶可以按照如下步骤进行:将发酵液放入40吨储罐，按照发酵液体积加入0.5-1.0 %的硅藻土和0.1-0.5%的珍珠岩。搅拌混匀之后，静止8h后采用板框过滤。采用以下步骤分别制备液体酶制剂或固体酶制剂:(I)通过过滤获得澄清的滤液进行超滤，温度控制在15°C ;最后在超滤浓缩液加入添加保护剂(16%山梨醇，3%氯化钠)，防腐剂(山梨酸钾0.12%，苯甲酸钠0.17% )获得液体酶制剂成品，CMC酶活为5000-15000IU/ml ； (2)将超滤浓缩后的滤液和载体(淀粉)混合均匀，采用喷雾干燥的方法将其喷干即得到固体酶制剂产品，CMC酶活10000-20000IU/ml。实施例6纤维素酶的应用(A)针织面料、梭织面料的表面除毛，其应用条件为35_55°C，处理时间为20_90分钟，pH范围为4.0-9.5，特别适用于6.5-7.0 ;适用的浴比范围为1: 5_1: 30，使用的设备类型为溢流染色机，卷染机，水洗机等，纤维素酶的用量为0.1-3.0g/L，该酶具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，其灭活条件为添加纯碱至PH值到10，或升温到70°C以上并保持10分钟。(B)针织面料、梭织面料的除毛染色一浴工艺及除毛、除氧、染色一浴工艺，其应用条件为35-55°C，处理时间为30-150分钟，pH范围为4.0-9.5，特别适用于染色同浴的情况；适用的浴比范围为1: 5-1: 30，使用的设备类型为溢流染色机，卷染机，水洗机等，纤维素酶的用量为0.1-3.0g/L，且纤维素酶的耐盐范围为硫酸钠10-100g/L，该酶具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，其灭活条件为添加纯碱至PH值到10，或升温到70°C以上并保持10分钟。(C)牛仔面料的起花及除毛应用，其应用条件为35_55°C，处理时间为10_60分钟，pH范围为4.0-9.5，可应用 于退浆及单独石磨洗条件下的除毛、起花工艺；适用的浴比范围为1: 5-1: 30，使用的设备类型为工业水洗机等，纤维素酶的用量为0.1-3.0g/L，该酶具有除毛干净，起花均匀，花点较小，对织物强力损失小的特点，其灭活条件为添加纯碱至PH值到10，或升温到70°C以上并保持10分钟。(D)针织面料、梭织面料的除毛除氧一浴工艺，其应用条件为35_55°C，处理时间为30-150分钟，pH范围为4.0-9.5，特别适用于与除氧酶等其它生物酶等复合应用的情况；适用的浴比范围为1: 5-1: 30，使用的设备类型为溢流染色机，卷染机，水洗机等，纤维素酶的用量为0.1-3.0g/L，该酶具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，其灭活条件为添加纯碱至PH值到10，或升温到70°C以上并保持10分钟。结果显示本发明生产的纤维素酶在pH 4.0-8.0范围内应用，无需调酸可直接使用，效果良好。布料强力损失特别小，回沾及串色最小；牛仔水洗，起花小，风格独特，批差稳定；在除氧、抛光、染色一浴产品方面，耐盐性好，直接使用可用于中和除氧后的抛光、染色一浴工艺，节能省时。


本发明涉及一种异源表达内切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其应用，所述的工程菌携带有能表达特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶的表达载体。本发明的木霉工程菌能高效表达特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶基因，从而增加了其纤维素酶系的内切酶组分，改变了酶学pH特性，明显扩大了其纤维素酶系在中性和碱性条件下的适用范围；本发明生产的纤维素酶产品在pH 4.0-8.0范围内，无需调酸可直接应用于水洗做旧、织布抛光等纺织工业领域，且效果良好，从而简化了应用工艺，节约成本。