专利名称：一种高效稳定的稻曲病菌室内接种方法及专用菌株的制作方法水稻稻曲病是由Ustilaginoidea virens引起的一种水稻穗部谷粒病害。近些年来，随着水稻栽培模式的改变，稻田氮肥施用量的增加以及新型高产密穗型杂交稻的大面积推广，稻曲病在世界各水稻产区发生日益严重。稻曲病不仅影响水稻产量，病原菌所产生的毒素还污染稻谷，影响米质，降低商品价值，严重威胁着全世界的食品安全。迄今为止，已有不少学者对稻曲病进行了广泛研究，初步揭示了稻曲菌的生物学特性、病害循环和防治方法，但这些研究大多局限于田间自然发病的调查和研究，难以向侵染过程、致病机制、抗病机制以及抗病育种等深层次研究领域扩展。室内人工接种技术即是制约稻曲病深入研究的技术瓶颈。据检索，申请号为03131625. 5、申请日期为2003. 6. 3 (高效引发稻曲病的接种方法)的发明公开了一种引发稻曲病的接种方法。该发明虽然比较了不同接种条件对稻曲病发病严重度的影响，如水稻生育期、接种时段等，但发明所涉及的水稻生育期的限定并不准确，也没有表观的定义，而且在接种试验之中也未能对温湿度环境条件进行控制或监测。由此得出的接种试验结果往往会因接种温湿度的条件变化而不稳定。因此在室内完善稻曲病的人工接种条件，建立起一套稳定高效的稻曲病接种技术体系，已成为现今稻曲病研究的一项重要任务。
本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种高效稳定稻曲病菌的室内人工接种方法以及专用于该方法的菌株，解决了目前稻曲病室内人工接种发病率不稳定这一难题。实现本发明的技术方案如下所述。一、稻曲菌菌株HWD-2的分离、筛选和鉴定I、稻曲菌菌株的分离待分离病样材料——稻曲球是申请人的发明人2009年10月从湖北省武汉市江夏区五里界镇东湖村水稻田采集得到，按常规组织分离法(参照方中达，植物病理学，北京 中国农业出版社，1998)，将稻曲球置于75%酒精中消毒30s，再经O. I %升汞表面消毒5min 后，无菌水漂洗3次。然后用无菌吸水纸将稻曲球表面水分吸干，切取其内层组织，置于 PSA (PSA培养基成分按g/L计，马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉12g ;补充蒸馏水至1000ml) 平板(含50ug/ml的链霉素)上，28°C黑暗条件下培养14天，待长出菌落后挑取边缘的菌丝移至新鲜PSA平板中培养，将分离物命名为HWD-2。2、稻曲菌分类鉴定采用传统的鉴定方法和分子鉴定等三种方法对候选分离物进行了鉴定，具体步骤如下(I)菌落形态鉴定取6mm菌丝块，置于PSA平板上，28°C黑暗条件下培养14天， 观察其菌落形态(如图I)。其菌落白色，中央隆起，菌丝致密，边缘光滑，7-10天后基质菌丝呈黄色，呈典型稻曲病菌菌落特征。(2)孢子形态鉴定将分离物在PSA培养基上培养7天后，取直径为6mm菌丝块 I块，置于200mlPSB培养基(PSB培养基成分按g/L计，马铃薯200g，蔗糖20g ;补充蒸馏水至1000ml)中，于28°C、转速180rpm的摇床上振荡培养7_10天，得到菌丝孢子混合液。 将以上获得的菌丝孢子混合液经四层纱布过滤，取滤液，即得薄壁分生孢子液，在显微镜 (10X40倍)下观察孢子形态(见图2)。分生孢子为单孢，无色透明，表明光滑，呈卵圆形， 呈典型稻曲病菌分生孢子特征。(3)分子鉴定采用报道的CTAB法(刘少华，2005)提取分离物的培养7天后的菌丝总DNA，按照 Zhou Yongli报道的方法进行PCR扩增(Zhou Yongli，2003)，运用稻曲菌ITS序列的特异引物(见序列表SEQ ID NO :2-5所示)进行PCR扩增，用ddH20作为阴性对照(见图3)，得到的一条特异性条带(序列长度为233bp)。根据菌落形态、孢子形态及特异性PCR扩增条带，确定上述分离物HWD-2鉴定为稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)。稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)HWD-2 的生物学特征取6mm菌株HWD-2菌丝块，置于PSA平板上，隔天以十字交叉法测量菌落直径。结果表明，24-28 °C、胁本哲氏或PSA培养基的条件最适合HWD-2菌丝生长，日平均生长速率为2.5mm/ 天。菌株HWD-2在PSA上培养7天后，取6mm菌丝块I块，放入200mlPSB培养基，置于 28°C、转速ISOrpm的摇床上振荡培养7_10天，经四层纱布过滤，取滤液，获得薄壁分生孢子液，以血球计数板检测薄壁分生孢子浓度。结果表明，28°C、180rpm转速和大米汁或PSB的条件最适合HWD-2产生薄壁分生孢子。将上述孢子液用PSB稀释至浓度IO6个/ml，于不同时间点在显微镜(10X40倍) 下观察孢子萌发情况，结果表明在PSB中48h孢子萌发率可达到90%以上。3、菌株活化与保存取6mm菌丝块，置于铺有灭菌的滤纸片(IcmXlcm)的PSA平板上，于28°C，黑暗条件下培养，待7天后菌丝长满滤纸片，再将滤纸片揭下，放入硫酸纸袋中并封口，置于28°C 烘箱中干燥7天，然后放置于_20°C条件下作为长期保存的菌株，需要时进行按常规方法活化。该稻曲病菌HWD-2 (Ustilaginoidea virensHWD-2)已于 2011年 I 月 19 日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO M2011023。二、接种体制备病原菌在PSA培养基上培养7天后，取直径为6mm菌丝块I块放入200mlPSB培养基(PSB培养基成分按g/L计，马铃薯200g，蔗糖20g;补充蒸馏水至1000ml)中，置28°C、转速ISOrpm的摇床上振荡培养7_10天，得到菌丝孢子混合液。再将以上获得的菌丝孢子混合液经四层纱布过滤，取滤液，3000rmp下离心5min,弃上清液,沉淀用新鲜的PSB培养基悬浮并将孢子终浓度稀释至IO6个/ml，即得薄壁分生孢子液。三、接种方法采用注射接种法，在水稻幼穗分化第7期(黄祥辉，水稻栽培生理，上海科学技术出版社，1978)，用IOml注射器从穗苞中上部插入，向穗苞内注射制备好的IO6个/ml浓度薄壁分生孢子液2ml，直至接种液从穗苞顶部溢出。接种后的水稻植株放置在植物生长箱(型号ZSX1500GS，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内，于25 °C、95% RH下保湿培养3天，然后移至喷灌网室(十字式悬挂微喷系统，江西贝嘉实业有限公司)，白天每2小时喷水一次，夜间每4小时喷水一次，保持温度在 25-32。。，湿度 90% -98% ο四、病穗率和病情指数调查方法I、接种3周后调查病穗率和病情指数，计算方法如下病穗率=(病穗率数)/(接种并已抽穗数)X 100%病情指数=(I级株数X 1+2级的株数X 2+3级的株数X 3+4级的株数X 1+5级的株数X 5) / (总株数X 5) X 1002、稻曲病的分级标准(参照唐春生报道的方法，2001)O级无病I级每穗有I个稻曲球或染病稻粒2级每穗有2个稻曲球或染病稻粒3级每穗有3 5个稻曲球或染病稻粒4级每穗有6 9个稻曲球或染病稻粒5级每穗有10个及10个以上及稻曲球或染病稻粒本发明的优点通过准确的定义植株生育期，详细记录接种后温湿度培养条件，优化接种方法、接种时期及温湿度发病条件，可获得稳定高效的稻曲菌接种效果。稻曲菌生长易受温湿度影响，常常会因为室外天气持续高温或骤然降低等剧烈变化而难以得到理想的接种效果。因此，通过本发明可在室内人工控制的条件下，获得稳定高效的接种效果，使稻曲病研究不受气候变化的影响。表I本发明与对比文献专利申请号03131625. 5专利申请的比较本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种室内高效稳定的稻曲病菌人工接种方法及专用菌株。发明的方法包括通过PSB振荡培养1块在PSA上培养7天的菌丝块(6mm)7-10天制备菌丝孢子混合液，4层纱布过滤后获得106个/ml孢子液接种体；在水稻幼穗分化第七期以注射方式接种水稻穗苞；25℃、95％RH条件下保湿3天后置于25-32℃、90％-98％RH的喷灌网室内培养。采用本发明可使稻曲病人工接种病穗率达到90％以上，与室外的人工接种技术相比，本发明能够在可控的条件下获得高效的稳定的稻曲病发病率。