专利名称：一种以球状单宁为载体的固定化α-淀粉酶的制备方法α -淀粉酶(α -amylase)从淀粉分子内部切开α _1、4键，将淀粉分解成糊精和还 原糖，广泛应用于粮食与食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业，但是由于酶是一种 可溶性的蛋白质，不易回收和重复利用，造成了催化剂浪费，而且酶蛋白还会污染产物，给 后处理造成困难。酶固定化技术是20世纪60年代发展起来的一项新型生物技术，其定义为“通过化 学或物理学的手段束缚于一定区域内，保持了催化活性并且可以重复、连续使用的酶”。利 用固定化酶进行工业生产，不仅使酶可以回收并重复利用，提高酶的使用效率、降低生产成 本，而且还可以提高酶的稳定性，避免酶蛋白对产物造成的污染，简化了后处理过程。从载 体材料的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为高分子载体、无机载体，复合载体以及 新型载体等。常见的高分子载体有壳聚糖、海藻酸、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸类等。 在大规模生产中，固定化酶大多采用球状载体，以便重复回收利用。单宁(Tarmins)为葡萄糖掊酰基化合物，其多酚羟基的结构赋予了它一系列独特 的化学特性和生理活性，如能与蛋白质、生物碱、多糖结合，常作为这些化合物的吸附材料。 单宁或富含单宁的生物质是近年发展迅速的生物质吸附剂的主要材料。中国具有丰富的 单宁资源，但是储量丰富的单宁还远没有像淀粉、纤维素、壳聚糖那样得到广泛的研究和应 用。α -淀粉酶是含钙离子的金属酶，因此可以利用单宁分子结构上的酚羟基进行改性，制 备获得符合工业生产需要的球状单宁载体。福建师范大学卢玉栋等研制成功了 “一种球状 单宁载体的制备方法”(同日分案申请)，是以单宁为原料，在分散介质有机相中，加入交联 剂，制备得到球状单宁载体。该球状单宁载体具有原料丰富、成本低廉、机械强度高，化学性 质稳定、适合工业应用的特点。以该球状单宁为固定化酶载体，用吸附-交联法固定α-淀 粉酶未见报道。
本发明的目的是提供一种以球状单宁为载体的用于固定化α-淀粉酶的制备方法。为实现本发明的目的采用的技术方案是将球状单宁载体加入到0. 5 10mg/ml 的α "淀粉酶溶液中得到球状单宁载体一 α -淀粉酶混合液；将混合液于4 50°C温度下 进行1 10小时的吸附作用，再加入质量浓度为5 30%的戊二醛溶液，加入的戊二醛溶 液与淀粉酶溶液的体积比为0. 02 0. 1，于4 50°C温度下交联1 3小时，过滤去除滤 液，用PH值为7的磷酸缓冲溶液洗涤并吸干，即制得球状单宁固定化α -淀粉酶。球状单 宁载体与α-淀粉酶的质量比为1 5 100。根据本发明制备的球状单宁固定化α-淀粉酶形状均一、表面积大；酶活力回收 率平均达到80%以上；与溶液酶相比，固定化α -淀粉酶对底物(淀粉)的亲和力提高了 12 倍以上。采用“一种球状单宁载体的制备方法”首先制取球状单宁载体，并用制得的球状单宁载 体固定化α-淀粉酶。取0. 5g球状单宁载体加入到50ml含量为2. 5mg/ml的α -淀粉酶溶液中，于30°C 温度条件下吸附5小时，加入2ml浓度为20%的戊二醛溶液中，于30°C温度条件下交联2小 时，过滤去除滤液，用PH值为7的磷酸缓冲溶液洗涤并吸干，即制得球状单宁固定化α -淀 粉酶。经测定，酶活力回收率达到82% ；与溶液酶相比，固定化α -淀粉酶对底物(淀粉) 的亲和力提高了 14. 3倍。实施例2制取球状单宁载体的方法同实施例1。采用“一种球状单宁载体的制备方法”首先制的球状单宁载体，并用制得的球状单 宁载体固定化淀粉酶。取0. 5g球状单宁载体加入到IOOml含量为9. 5mg/ml的α -淀粉酶溶液中，于30°C 温度条件下吸附5小时，加入5ml浓度为20%的戊二醛溶液，于30°C温度条件下交联2小 时，过滤去除滤液，用PH值为7的磷酸缓冲溶液洗涤并吸干，即制得球状单宁固定化α -淀 粉酶。经测定，酶活力回收率达到81. 8% ；与溶液酶相比，固定化α -淀粉酶对底物(淀 粉)的亲和力提高了 13. 2倍。实施例3制取球状单宁载体的方法同实施例1。取0. 5g球状单宁载体加入IOOml含量为3mg/ml到α -淀粉酶溶液中，于30°C温 度条件下吸附5小时，加入5ml浓度为25%的戊二醛溶液，于30°C温度条件下交联2小时， 过滤去除滤液，用PH值为7的磷酸缓冲溶液洗涤并吸干，即制得球状单宁固定化α -淀粉 酶。经测定，酶活力回收率达到85. 3% ；与溶液酶相比，固定化α -淀粉酶对底物(淀 粉)的亲和力提高了 15. 9倍。实施例4
制取球状单宁载体的方法同实施例1。取0. 5g球状单宁载体加入IOOml含量为7. 5mg/ml到α -淀粉酶溶液中，于30°C 温度条件下吸附5小时，加入IOml浓度为20%的戊二醛溶液，于30°C温度条件下交联2小 时，过滤去除滤液，用PH值为7的磷酸缓冲溶液洗涤并吸干，即制得球状单宁固定化α -淀 粉酶。经测定，酶活力回收率达到78. 1% ；与溶液酶相比，固定化α -淀粉酶对底物(淀粉)的亲和力提高了 14. 7倍。实施例5
制取球状单宁载体的方法同实施例1。取Ig球状单宁载体加入IOOml含量为2. 5mg/ml到α -淀粉酶溶液中，于40°C温 度条件下吸附4小时，加入IOml浓度为12%的戊二醛溶液，于40°C温度条件下交联1. 5小 时，过滤去除滤液，用PH值为7的磷酸缓冲溶液洗涤并吸干，即制得球状单宁固定化α -淀 粉酶。经测定，酶活力回收率达到79. 6% ；与溶液酶相比，固定化α -淀粉酶对底物(淀 粉)的亲和力提高了 15. 3倍。实施例6
制取球状单宁载体的方法同实施例1。取2g球状单宁载体加入50ml含量为2. 5mg/ml到α -淀粉酶溶液中，于30°C温度 条件下吸附5小时，加入2ml浓度为20%的戊二醛溶液，于30°C温度条件下交联2小时，过 滤去除滤液，用PH值为7的磷酸缓冲溶液洗涤并吸干，即制得球状单宁固定化α -淀粉酶。经测定，酶活力回收率达到84. 3% ；与溶液酶相比，固定化α -淀粉酶对底物(淀 粉)的亲和力提高了 13. 5倍。实施例7
制取球状单宁载体的方法同实施例1。取2. 5g球状单宁载体加入50ml含量为2. 5mg/ml到α -淀粉酶溶液中，于10°C 温度条件下吸附10小时，加入2ml浓度为20%的戊二醛溶液，于10°C温度条件下交联3小 时，过滤去除滤液，用PH值为7的磷酸缓冲溶液洗涤并吸干，即制得球状单宁固定化α -淀 粉酶。经测定，酶活力回收率达到86. 2% ；与溶液酶相比，固定化α -淀粉酶对底物(淀 粉)的亲和力提高了 12. 3倍。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形 成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。