专利名称：一种中间普氏菌培养基的制作方法牙周病是常见的口腔疾病，在世界范围内有很高的发病率。中间普氏菌 (Prevotella intermedia，Pi)属产黑色素类的G-厌氧杆菌，大量的研究显示Pi与牙周炎、 根尖周病和冠周炎等感染性疾病关系密切。目前的Pi检验手段主要是龈下菌斑采样进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，该种方法需要对样本进行DNA提取和PCR引物设计，且需要配备PCR相关仪器设备，成本昂贵，操作复杂。微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术，而选择性培养基是用来促进或抑制一定类型的生物体(如细胞或细菌等)而设计的培养基，利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。非选择性厌氧菌基础培养基培养牙垢标本，很难将厌氧链球菌、牙龈卟啉菌、梭菌属等分离出去，影响中间普氏菌的生长。
本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种适合于中间普氏菌生长的培养基。本发明解决其技术问题的技术方案是一种中间普氏菌培养基，其特征在，配制 IOOOml培养基的配方中含有蛋白胨15g ；牛心浸粉8g ；氯化血红素5mg ；维生素Kl IOmg ； 氯化钠5. 5g ；琼脂15g ；多西环素^ig ；甲硝唑20mg ；无菌绵羊血90ml ；蒸馏水加至1000ml。优化方案中，每IOOOml培养基还含有杆菌肽锌^ig。优化方案中，每1000ml培养基还含有L-谷氨酰胺0. lg。优化方案中，每IOOOml培养基还含有胆盐1. 8g。优化方案中，每IOOOml培养基还含有浓度200g/L的射干水煮液200ml。其中所述的蛋白胨提供碳氮源和能量；牛心浸粉含有各种多肽、脂肪、生长因子、 激素等，这些物质对促进中间普氏菌的繁殖和生长都是很重要的因素；氯化血红素和维生素Kl为厌氧菌营养剂；氯化钠维持均衡的渗透压，且由于中间普氏菌较其他的口腔厌氧菌更为耐受高盐环境，所以高氯化钠水平还有利于抑制其他口腔厌氧菌生长；琼脂是培养基的凝固剂；多西环素可以有效的抑制链球菌等革兰氏阳性菌、放线菌属、炭疽杆菌、李斯特菌、梭状芽孢杆菌、奴卡菌属、弧菌、布鲁菌属、弯曲杆菌、耶尔森菌、放线放线杆菌、黄褐色嗜二氧化碳菌；既往研究表明，甲硝唑抑制牙龈卟啉菌能力64倍于中间普氏菌；无菌绵羊血提供能量环境；杆菌肽锌可以广谱抑制革兰氏的阳性菌和阴性球菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌及螺旋体；L-谷氨酰胺属氨基酸类，为营养剂；胆盐抑制革兰氏阳性菌，特别抑制革兰氏阳性杆菌和粪链球菌；射干为鸢尾科植物射干的干燥根茎，现代研究表明，射干煎剂或浸剂，在试管中对常见的致病性皮肤癣菌有抑制作用；在体外对外感及咽喉疾患中的某些病毒，也有抑制或延缓作用。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、中间普氏菌分离率高的特点。 作详细说明。实施例1，配制IOOOml培养基的配方中含有蛋白胨15g ；牛心浸粉8g ；氯化血红素5mg ；维生素Kl IOmg ；氯化钠5. 5g ；琼脂15g ；多西环素^ig ；甲硝唑20mg ；无菌绵羊血 90ml ；蒸馏水加至1000ml。制备方法为称取蛋白胨、牛心浸粉、氯化钠；琼脂；多西环素；甲硝唑混勻，蒸馏水溶解，210°C灭菌15 min,冷却到45°C，加入无菌绵羊血、灭菌氯化血红素、 灭菌维生素K1，混勻后灭菌蒸馏水定容到IOOOml后分装。实施例2，配制IOOOml培养基的配方中含有蛋白胨15g ；牛心浸粉8g ；氯化血红素5mg ；维生素Kl IOmg ；氯化钠5. 5g ；琼脂15g ；多西环素^ig ；甲硝唑20mg ；无菌绵羊血 90ml ；杆菌肽锌2mg ；蒸馏水加至1000ml。制备方法为称取蛋白胨、牛心浸粉、氯化钠；琼脂； 多西环素；甲硝唑；杆菌肽锌混勻，蒸馏水溶解，210°C灭菌15 min，冷却到45°C，加入无菌绵羊血、灭菌氯化血红素、灭菌维生素K1，混勻后灭菌蒸馏水定容到IOOOml后分装。实施例3，配制IOOOml培养基的配方中含有蛋白胨15g ；牛心浸粉8g ；氯化血红素5mg ；维生素Kl IOmg ；氯化钠5. 5g ；琼脂15g ；多西环素^ig ；甲硝唑20mg ；无菌绵羊血90ml ；L-谷氨酰胺0. Ig ；胆盐1. Sg ；蒸馏水加至1000ml。制备方法为称取蛋白胨、牛心浸粉、氯化钠；琼脂；多西环素；甲硝唑；L-谷氨酰胺；胆盐混勻，蒸馏水溶解，210°C灭菌15 min，冷却到45°C，加入无菌绵羊血、灭菌氯化血红素、灭菌维生素K1，混勻后灭菌蒸馏水定容到IOOOml后分装。实施例4，配制IOOOml培养基的配方中含有蛋白胨15g ；牛心浸粉8g ；氯化血红素5mg ；维生素Kl IOmg ；氯化钠5. 5g ；琼脂15g ；多西环素^ig ；甲硝唑20mg ；无菌绵羊血 90ml ；浓度200g/L的射干水煮液200ml ；蒸馏水加至1000ml。制备方法为取射干加水煮沸1小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得射干水煮液；将蛋白胨、牛心浸粉、氯化钠；琼脂；多西环素；甲硝唑；射干水煮液和蒸馏水混勻，在涡旋器上震荡15min，过滤，滤液210°C灭菌15 min,冷却到45°C，加入无菌绵羊血、灭菌氯化血红素、灭菌维生素K1，混勻后灭菌蒸馏水定容到IOOOml后分装。实施例5，配制IOOOml培养基的配方中含有蛋白胨15g ；牛心浸粉8g ；氯化血红素5mg ；维生素Kl IOmg ；氯化钠5. 5g ；琼脂15g ；多西环素^ig ；甲硝唑20mg ；无菌绵羊血 90ml ；L-谷氨酰胺0. Ig ；胆盐1. 8g ；浓度200g/L的射干水煮液200ml ；蒸馏水加至1000ml。 制备方法为取射干加水煮沸1小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得射干水煮液；将蛋白胨、牛心浸粉、氯化钠；琼脂；多西环素；甲硝唑；L-谷氨酰胺；胆盐；射干水煮液和蒸馏水混勻，在涡旋器上震荡15min，过滤，滤液210°C灭菌15 min，冷却到45°C，加入无菌绵羊血、灭菌氯化血红素、灭菌维生素K1，混勻后灭菌蒸馏水定容到IOOOml后分装。所述的射干水煮液浓度为200g/L，指的是每升射干水煮液中含有生药200g。本发明所得中间普氏菌培养基用于牙垢标本具有检出可靠、中间普氏菌分离率高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。1对象与方法1. 1培养基制备共设6组，分别为实施例1方案组、实施例2方案组、实施例3方案组、实施例4方案组、实施例5方案组和对照组，对照组为厌氧血琼脂培养基(⑶C培养基)。1. 2龈下菌斑采集培养方法隔湿唾液，龈上刮治器去除龈上牙石，碘酊消毒后， 用无菌Gracey刮治器采集2颗下颂中切牙唇侧近中至远中的龈下菌斑。将采集的菌斑悬浮于Iml生理盐水，用接种环分区划线接种，在37°C，10%C02、10%H2和80%N2的厌氧罐内培养48h，挑取细小菌落进行菌属鉴定。1.3目标菌的菌落形态观察、显微镜镜检取出培养皿，观察培养基上黑色或棕色、光亮、圆形、低突、直径0. 5^2 mm的菌落的生长情况，挑选目标菌涂片，革兰氏染色，显微镜镜检。1. 3统计学分析用SPSS 13. 0进行统计分析，P< 0. 05表示有显著性意义。2结果在19份经由PCR确定中间普氏菌阳性的牙垢标本，细菌培养分离并鉴定为中间普氏菌的，4 实施例1方案组为16例，实施例2方案组为16例，实施例3方案组为 18例，实施例4方案组为16，实施例5方案组为17例，对照组⑶C培养基为11例，经统计学处理，本发明各实施例组与对照组比较具有明显差异(P<0. 05)。结果表明，本发明实施例中间普氏菌分离率明显高现有的培养基。


本发明公开了一种中间普氏菌培养基。其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有蛋白胨15g；牛心浸粉8g；氯化血红素5mg；维生素K110mg；氯化钠5.5g；琼脂15g；多西环素4mg；甲硝唑20mg；无菌绵羊血90ml；蒸馏水加至1000ml。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、中间普氏菌分离率高的特点。