专利名称：作为肿瘤治疗中的有效工具的靶向肿瘤血管的新型疫苗的制作方法血管发生-新生毛细血管形成-在发育和需要血管发生的生理状况诸如伤口愈合和月经周期的过程中至关重要。然而，在健康的男性中，血管发生是稀少的，并且内皮细胞 池的更新时间为数百天。然而，延长的和过度的血管发生涉及许多病理过程，即，类风湿性关节炎，视网膜病变和肿瘤生长。正常的脉管系统受到天然存在的促血管生成因子和抗血管生成因子之间平衡的紧密调节。一个非常重要的此类因子是血管内皮生长因子(VEGF)，其是胚胎发生期间血管系统发育所必需的，并且也是成人新生血管形成的重要调节物[I]。迄今为止，已经记述了多种对血管发生负调节的内源性因子[2]。到目前为止记述的抑制剂主要分成三组血浆蛋白类，基底膜蛋白类和丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)。血管发生的内源性抑制剂的实例为凝血酶敏感蛋白(TSP)，基底膜蛋白，内皮抑素(endostatin),胶原蛋白XVIII的片段,血管抑素(angiostatin),纤溶酶原和肿瘤抑素(tumstatin)的片段，胶原蛋白IV的片段。它们的作用机制涉及通过利用整联蛋白作为受体或通过特异性地结合不同的基质成分，诱导内皮细胞凋亡和/或干扰整联蛋白功能。遗传证据进一步支持了这些分子作为血管发生的负调节物的作用。在小鼠皮肤中TSP-I的过 度表达导致皮肤癌症形成延缓和减少，而缺少TSP-2的小鼠则具有增加的皮肤血管化并显示增强的癌症形成[3]。此外，缺少肿瘤抑素或内皮抑素的表达的小鼠显示加速的肿瘤生长和血管化[4]。血管生成抑制以许多方式作为治疗以过度血管形成为特征的疾病的临床策略受到关注，特别是当与化疗联合时。通过减少血管化饥饿肿瘤不靶向肿瘤区室，并且因此不依靠肿瘤细胞的特定特质，所述特定特质已知是遗传学不稳定的。到目前为止，美国食品药品监督管理局(FDA)已经批准了 5种抗血管生成药物，它们均靶向VEGF或VEGFR2[1]。在临床上，迄今为止最为成功的是VEGF-中和抗体贝伐珠单抗(Bevacizumab)(贝伐单抗(Avastin)),其在2004年早期就被批准。当与化疗联合给药时,Avastin延长患有转移性结肠癌、肺癌和乳腺癌的患者的存活。由FDA批准的第二种抗血管生成药物是抗-VEGF适体培加尼布(Pegaptanib)/哌加他尼钠(Macugen),其用于治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)。另外，靶向VEGFR2 (以及TOGF-受体β、Flt3和c_Kit)的受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼(Sunitinib) (Sutent)和索拉非尼(Sorafenib) (Nexavar)分别于 2006 年 I 月和 2005 年12月被批准用于治疗肾癌和胃肠癌。靶向VEGF-诱导的信号传导的第五种药物是VEGF-中和抗体片段兰尼单抗(Ranibizumab) (Lucentis),于2006年6月被FDA批准用于治疗年龄相关性黄斑变性，该病在西方世界是失明的主要病因。以前设想由于其靶向肿瘤中的未转化细胞，抗血管生成治疗将不会遭受耐药性相关的问题，该问题是与化疗普遍相关的问题。然而，这种假设证明是不完全正确的。积累的数据显示当疾病进展时其他血管生成途径可以替代VEGF[5]。因此，开发可与现在肿瘤学家所使用的一系列细胞毒性药物相当的、靶向血管生成的血管的不同功能的、用于临床使用的多种抗血管生成药物是很重要的。上述这些方法中的数种是非常昂贵的，药物需要一周数次，每天一次或有时一天数次经静脉内或肌内注射以获得最大效应，并且还常常显示仅在非常有限数目的癌症类型中起效。因此需要更容易给药、更成本有效的并且具有更宽的肿瘤类型谱的新型药物。对于许多类型的疾病，疫苗接种是令人关注的方式。广泛的疫苗接种计划已经实际上根除了致残和威胁生命的病症诸如小儿麻痹症、白喉和天花。对于癌症使用疫苗接种作为治疗策略的可能性成为深入研究的焦点已经持续一些时间了。然而到目前为止对于该疾病还没有在临床中使用疫苗接种。为什么较难以开发用于癌症治疗的疫苗存在数种原因。首先，被靶向的抗原经常是自身抗原，其也可能在生理条件下，但以较低的水平表达或在胚胎发生期间表达。因此，与针对外来病毒或细菌抗原的疫苗接种相反，需要破坏免疫系统针对所述抗原的自身耐受性。其次，肿瘤细胞具有演变机制以逃避免疫系统的识别，进一步使针对肿瘤细胞抗原的疫苗接种复杂化。第三，当针对自身抗原进行疫苗接种时，重要的是使用疾病特异性靶标。在此我们提出了一种通过将自身抗原、肿瘤血管靶标连接至非自身抗原上来增强肿瘤疫苗的功效的新策略，所述非自身抗原的尺寸大至足以包含大量T细胞表位。这确保被大多数任意MHC背景中的T细胞识别和可以用于远系繁殖群体(OUtbread)如人中的疫苗。血管的优先靶向还减少了肿瘤细胞耐受治疗的可能性。此外，抗血管生成疫苗接种可以为药物的反复和长期给药提供一种成本有效的替代方式。对于处于发生遗传类型癌症高危的个体，抗血管生成疫苗接种也可作为预防性治疗。我们为开发癌症疫苗选择的抗原是在成人生命期间优先地在肿瘤脉管系统中表达的六种不同的抗原，纤维连接蛋白的胞外结构域(extra-domain)B (EDB) [6]、纤维连接蛋白的胞外结构域A(EDA) [6]、腱生蛋白(tenascin)-C的胞外结构域C[7]、膜联蛋白(annexin)Al [8]、内皮唾酸蛋白(endosialin) [9,10]和 Robo4(magic roundabout) (MR)。EDB是一个通过选择性剪接插入至纤维连接蛋白中的91个氨基酸的结构域。EDB在胚胎发生期间表达，但在成人中在正常情况下不表达。然而，EDB在许多实体肿瘤中高度表达[6]。通过施用与放射性试剂或细胞毒性剂连接的抗体靶向EDB已经在癌症的小鼠模型中且在II期临床试验中得到了非常有希望的结果(关于更新的信息参见http:// WWW. philogen. com/)。EDA是通过选择性剪接插入至纤维连接蛋白中的另一个胞外结构域(REF)。此结构域已经被发现在某些肿瘤组织中表达，但一般不在成人的其他组织中表达ο腱生蛋白C的C-结构域在多种肿瘤类型中过度表达，例如，在高级别星形细胞瘤中，但在大多数正常成人组织中检测不到[7]。同样MR在活跃的血管生成的部位处表达，如肿瘤，但除了胚胎发生期间以外在正常组织中不表达[7]。同样内皮唾酸蛋白和膜联蛋白Al两者优先地在肿瘤组织中表达。现有技术治疗癌症的疫苗接种策略已经成为来自制药工业和学术研究者两方面都非常活跃的研究领域。然而，成功非常有限。对于此不成功的一个非常重要的因素是大多数临床和临床前试验采用未修饰的蛋白进行。这也导致肿瘤生物学领域内的几乎所有研究小组都得出结论，不可能获得有效的肿瘤疫苗。因此几个小组和公司已经转向使用单克隆抗体。采用EDB所面临的甚至更为困难的情形是该序列极端保守，使得几乎不可能在小鼠或大鼠中制备针对人蛋白质的单克隆抗体，已经使用噬菌体展示技术来获得用于治疗的EDB结合结构(参见http://www. philogen. com/)。然而至少有一家公司已经采用修饰的蛋白质进行了癌症疫苗的研究，其是位于丹麦的Pharmexa。他们已经使用了来自于各种非自身蛋白质的所谓的优势免疫表位。这些短的优势免疫表位已经被插入至祀分子中(WWW. pharmexa.com)。然而，插入优势免疫表位的思路是，表位与特定的MHC I类，或II类分子非常强的结合。这使得这些疫苗依赖于高度变化的参数，即MHC分子的肽特异性。通过使用具有较多数目的肽的融合蛋白，我们克服了采用单一的优势免疫表位的问题，并且获得了具有更普遍用途的疫苗。所有以前测试的疫苗还靶向肿瘤和非血管相关抗原。肿瘤抗原已经显示容 易被下调，并且肿瘤可以因此相对容易地逃避这些治疗方法。这是由肿瘤细胞的高度可塑性导致的。然而，所有肿瘤需要血管来生存和生长，因此采用新的更强力的治疗性疫苗(该疫苗由单种或至多6种不同的肿瘤特异性血管靶标的组合组成)靶向血管的这种策略是一种靶向侵袭性极强的快速生长肿瘤的新的和更为有效的方式。本发明的目的本发明的目的是提供一种通过靶向肿瘤脉管系统(生长中的肿瘤的必要部分)用于治疗各种类型癌症的方便的、有效的和成本有效的方法。采用由纤维连接蛋白的细胞外结构域B (EDB)、EDA、膜联蛋白Al、内皮唾酸蛋白、腱生蛋白C的胞外结构域C或Robo4 (MR)与任何非自身来源的外源载体分子之间的融合蛋白组成的疫苗，一次用这些融合蛋白中的一种或用这些融合蛋白中的两种至六种的组合治疗各种类型的癌症。
根据本发明通过疫苗或疫苗的组合实现了上述目的，所述疫苗的特征在于包含与一种或多种异源载体蛋白连接的一种蛋白或两种至六种蛋白的组合并且任选地包含佐剂，所述蛋白具有来自待接种物种的处于其原始形式或多聚形式的EDB、EDA、膜联蛋白Al、内皮唾酸蛋白、腱生蛋白C的胞外结构域C或Robo4(MR)的完整氨基酸序列或所述氨基酸序列的大于5个氨基酸的节段。图1A、B、C、D、E和F分别显示人EDB、EDA、膜联蛋白Al、内皮唾酸蛋白、腱生蛋白C的胞外结构域C或Robo4 (MR)的氨基酸序列。图2显示硫氧还蛋白-EDB和GST-EDB构建体，和来自相同构建体的纯化蛋白的示意性图示，所述构建体作为ELISA包被抗原用于免疫并且用于小鼠肿瘤模型中的概念验证的研究。图3显示疫苗接种后对肿瘤重量的作用。给出了接种小鼠和对照小鼠组中的抗体效价。图4显示了在小鼠肿瘤模型中疫苗接种策略对肿瘤大小的显著作用。
和生物活性抗体，以及其对肿瘤生长具有良好的疗效。参考文献[I]Olsson AK, Dimberg A，Kreuger J，Claesson-Welsh L. VEGF receptorsignalling-in control of vascular function. Nat Rev Mol Cell Biol 2006 ；7 (5)359-71.[2]Folkman J. Endogenous angiogenesis inhibitors. Apmis 2004 ;112 (7-8)496-507.[3]Hawighorst T，Velasco P, Streit M，Hong YK, Kyriakides TR, Brown LF，etal. Thrombospondin-2 plays a protective role in multistep carcinogenesis a novelhost anti-tumor defense mechanism. Embo J 2001 ；20 (11) :2631-40.[4]Sund M， Hamano Y， Sugimoto H， Sudhakar A， Soubasakos M， Yerramalla U等.Function of endogenous inhibitors of angiogenesis as endothelium-specifictumor suppressors. Proc Natl Acad Sci USA 2005 ；102 (8) :2934-9.[5]Ferrara N，Kerbel RS. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature2005 ；438(7070) :967-74.[6]Scarpino S,Stoppacciaro AiPellegrini CiMarzullo A,Zardi L,TartagliaF 等· Expression of EDA/EDB isoforms of fibronection in papillary carcinoma ofthe thyroid. J Pathol 1999; 188 (2) :163-7.[7]Silacci M，Brack SS, Spath N，Buck A，Hillinger S，Ami S，et al.人monoclonal antibodies to domain C of tenascin—C selectively target solid tumorsin vivo.Protein Eng Des Sel 2006 ；19 (10) :471-8.[8] Oh P，Li Y，Yu J，Durr E，Krasinska KM, Carver LA，et al. Subtractiveproteomic mapping of the endothelial surface in lung and solid tumours fortissue-specific therapy. Nature 2004 ；429 (6992) :629-35.[9]Teicher BA. Newer vascular targets endosialin(review). Int J Oncol2007 ；30(2) :305-12.[10] Rettig WJ, Garin-Chesa P，Healey JH, Su SL, Jaffe EA, Old.Identification of endosialin， a cell surface glycoprotein of vascularendothelial cells in 人 cancer. Proc Natl Acad Sci USA 1992 ；89 (22) :10832-6.[ll]Huminiecki L, Gorn M，Suchting S，Poulsom R，Bicknell R. Robo4 is anew member of the roundabout receptor family that is endothelial speci fic andexpressed at sites of active angiogenesis. Genomics 2002 ；79 (4) :547-52.


本发明涉及一种用于治疗各种癌症的组合物。所述组合物是含有与一个或数个异种外源载体分子连接的单个或组合的EDB、EDA、膜联蛋白A1、内皮唾酸蛋白、腱生蛋白的C结构域或Robo4(MR)的序列或其片段的疫苗。所述疫苗将产生针对在肿瘤血管中或周围优先表达的自身蛋白的抗体。所述疫苗优选地与佐剂一起给药。