一种调控植物花粉育性的方法及其应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于植物基因工程和植物育种【技术领域】，具体涉及一种通过将Barnase分成N端和C端两个片段，分别利用两个表达时期有重叠的花粉特异启动子驱动其在植物中的表达，从而加强Barnase表达的组织特异性、克服利用Barnase基因创建植物雄性不育系时毒性泄露问题的方法。[0002]杂种优势是生物界的一种普遍现象，利用杂种优势可以显著提高作物产量、品质和抗性。杂交育种已经成为许多作物选育新品种的主要途径，而作物雄性不育系的选育又是杂种优势利用中的关键环节。由于利用常规育种方法选育不育系存在周期长、见效慢、对环境因素影响敏感等问题而不能满足生产发展的需要，近年来，利用基因工程创建雄性不育系被作为最具前景的育种途径，成为当今世界范围内研究、开发和利用的热点。[0003]目前利用植物基因工程创建雄性不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子驱动外源基因在植物中的表达来阻断花粉发育过程从而达到雄性不育的目的，如利用绒毡层特异启动子驱动Barnase基因在植物中特异表达获得基因工程核不育系或利用反义RNA技术特异关闭雄配子体发育关键基因获得基因工程核不育系等。[0004]Barnase 是解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的一种胞外 RNA酶，其产物以前体形式表达，在加工、运输过程中N端被切除约20个氨基酸，成为成熟酶，共有110个氨基酸。Barnase具有强烈的毒性，它在特定细胞中的微量表达就可以造成该细胞的死亡。1990年，Mariani等将具有特异时空表达特性的烟草花药绒毡层特异启动子TA29，与解淀粉芽孢杆菌的Barnase基因结合，构成嵌合基因，用根癌农杆菌介导法，将上述嵌合基因导入烟草和油菜，获得了转基因植物(Mariani C等,Induction of male sterility inplants by a chimaeric ribonuclease gene, Nature, 1990, 347:737_741)。结果，有相当大一部分转基因植株花药皱缩、不散粉、自交不能结实，但雌蕊正常，可由其它植株授粉结实；组织切片未发现绒毡层，花粉囊变形，无小孢子和花粉粒。因此，他们认为，TA29-BarnaSe嵌合基因在油菜、烟草中的特异表达，选择性破坏了花的绒毡层，从而阻止了花粉的形成，导致雄性不育。[0005]20年来，Barnase被导入油菜、烟草、棉花、小麦、玉米、水稻等各种作物进行了雄性不育诱导的研究。在利用Barnase创建植物雄性不育系的过程中也发现了一系列的问题，如Barnase蛋白的温度敏感性问题、驱动其表达的花粉特异启动子的特异性不够或上游有CaMV35S等强启动子而导致的毒性泄露问题等。[0006]针对这一问题，本发明提出了一种新的雄性不育载体的构建策略，在该策略中将Barnase分成N端和C端两个片段,并且由两个不同的花粉特异启动子分别启动Barnase两个半分子Barnase-N和Barnase-C的表达，由于半分子Barnase-N和Barnase-C单独存在时都不具有RNA酶的活性，因此只有在两个启动子都具有表达活性的花粉细胞中才同时存在Barnase-N和Barnase-C两个半分子,而这两个半分子可以自我组装成具有RNA酶活性的复合体，行使RNA酶的功能，从而达到植株雄性不育的目的。本发明一方面沒有用强表达的组成型启动子(如CaMV35S启动子)，避免了强启动子对Barnase基因表达特异性的影响，更好的克服了 Barnase基因的毒性泄露问题，更有效的实现了 Barnase基因在创制植物雄性不育系方面的应用。
[0007]本发明的目的是提供一种新的创建植物雄性不育系的方法，更具体的是提供一种在双子叶植物中创制雄性不育系的方法，所述方法包括选取两个花粉特异表达的启动子，更具体的是选取两个在双子叶植物的花粉中特异表达的启动子，将Barnase基因分成N端和C端，由两个启动子分别驱动表达。通过上述方法所获得的构建体在转入植株后，可以使获得的转基因植株实现雄性不育，并且能够有效避免Barnase毒性泄露问题，还能避免同时转入两个相同的启动子所导致的基因沉默问题。
[0008]本发明所涉及的Barnase基因蛋白，是解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)产生的一种胞外RNA酶，具有很强的细胞毒性，它在细胞中的特异性表达会造成细胞的死亡，因而被广泛应用于植物雄性不育系的创建等领域。
[0009]在本发明中，为了解决Barnase基因毒性太大以及容易泄露，易影响植物正常的生长发育的问题，本发明将Barnase蛋白分成了 N端(1_36位氨基酸)和C端(37-110位氨基酸)两个小肽，N端包含2个α螺旋，C端包含5个β片层。由于两个小肽都包含RNA酶活性必需的氨基酸(N端Lys27，C端Glu73和Hisl02)，所以任何一段小肽都没有RNA酶活性，但两者在同时转入到一个细胞，并同时表达出蛋白后，可以重新组合成具有RNA酶活性的复合体，该重新组 装的蛋白复合体的RNA酶活性可以达到天然蛋白的30%左右，可以导致所表达细胞的死亡。
[0010]为了使得细菌来源的Barnase基因更好的在植物中，尤其是在双子叶植物中表达，本发明还根据Barnase的高级结构、解淀粉芽孢杆菌密码子的偏好性、双子叶植物密码子的偏好性对Barnase的核苷酸序列进行改造，同时还对决定Barnase温度敏感性的6个重要氨基酸进行了点突变(Q16I，T17R, K20R, G65S, K66A和K108R)。改造并做完点突变的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示,野生型序列如SEQ ID N0:2所示。
[0011]与野生型的Barnase相比,本发明所提供的突变后的Barnase序列具有在双子叶植物中能够更有效的表达及温度敏感性低(即更耐受高温)的优点，这些优点对于利用其核糖核酸酶活性在双子叶植物中调控花粉育性及建立雄性不育系是非常重要的。
[0012]在本发明的另一方面，发明人将分别编码Barnase的N端和C端小肽的两个核苷酸序列置于两个不同的花粉特异表达启动子的驱动下，这两个花粉特异表达启动子都在花粉发育的后期表达，可以实现Barnase的N端和C端两个小肽的同时空的高效的表达，从而既达到了本发明创制雄性不育系的目的，又能克服组成型表达Barnase基因所导致的对植物正常生长发育的影响及能量的浪费，还能避免某一个花粉特异启动子在其他组织器官中的微弱活性所导致的Barnase基因的毒性泄露问题。将含有上述表达盒的表达载体转化植物，获得的转基因植物中可以实现50%的花粉无活力或活力弱，从而达到目标性调控植物花粉育性的目的。
[0013]本发明依次通过下列步骤实现:[0014](1)根据Barnase的高级结构、解淀粉芽孢杆菌密码子的偏好性、双子叶植物密码子的偏好性对Barnase的核苷酸序列进行改造，同时还对决定Barnase温度敏感性的重要氨基酸进行了点突变(Q16I，T17R, K20R, G65S, K66A和K108R)。改造并做完点突变的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，将该序列交宝生物工程(大连)有限公司合成；
[0015](2 )通过PCR方法分别扩增得到编码Barnase N端(1-36位氨基酸)和C端(37-110位氨基酸)的核苷酸片段，连接T载体并测序确认；
[0016](3)通过PCR方法分别扩增得到两个花粉发育晚期特异表达的启动子PAt03g04360和PAt2g38500，连接T载体并测序确认；
[0017](4)构建植物表达载体:将编码Barnase N端(1-36位氨基酸)和C端(37-110位氨基酸)的核苷酸片段分别置于两个花粉发育晚期特异表达的启动子PAt03g04360和PAt2g38500的驱动下；
[0018](5)转化植物，具体地，优选转化拟南芥和油菜；
[0019](6)将获得的TO代转基因拟南芥的花粉进行Alexander溶液染色分析。染成深蓝色的为可育花粉，浅蓝色的为败育花粉。结果表明有50%花粉活力弱或无活力，从而达到目标性调控植物花粉育性的目的。
[0020]本发明所述的“启动子”是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。
[0021]本发明所述的“核苷酸序列”是核酸(DNA和RNA)中核苷酸的排列顺序。许多情况下，核苷酸序列决定核酸的高级结构和生物功能，即不同序列有不同的高级结构和不同的生物功能。
[0022]本发明所述的“花粉发育晚期特异表达启动子”是指该启动子可以驱动目的基因在植物花粉发育晚期的花粉粒中特异表达而在植物的其它器官不表达的启动子。
[0023]本发明所述的“植物表达载体”是指现有技术中已知的、能够在植物细胞中恒定表达外源基因的任何一种载体，如pCAMBIA1300，pBI121等。
[0024]本发明所述的“转化”是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等
[0025]本发明所述的“转基因植物”是指通过基因转移技术获得的整合有外源基因的植物个体。通常转化植物或转基因植物基因组中稳定带有外源基因的核苷酸序列，可将该外源核苷酸序列稳定地遗传给下一代。
[0026]本发明与现有的利用Barnase创建雄性不育系的技术相比，其优势在于只有在两个花粉特异启动子同时具有表达活性的细胞中，无活性的Barnase N端和C端小肽才能够同时存在并组装成有活性的复合体，从而有效避免了花粉特异启动子特异性不够时导致的雄性不育植物其他组织器官发育异常、重要农艺性状受到影响的问题，对植物基因工程雄性不育系的创建和杂种优势的利用都具有重要意义。



[0027]图1是表达载体pBnSK的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；NapinP表示油菜Napin基因的启动子；RFP来自礁珊瑚的RFP基因编码区；PAt03g04360表示拟南芥At03g04360基因的启动子；BarW-C表示改造后的Barnase基因的C端核苷酸片段；Trbcs表示拟南芥rbcs基因的终止子；PAt2g38500表示拟南芥At2g38500基因的启动子；BarW-N表示改造后的Barnase基因的N端核苷酸片段；Tnos表示胭脂碱合成酶(nos)基因的终止子；Pvu II、Pst1、Bgl II、BamH1、Sma1、Kpn1、Sac1、EcoRI 和 BstPI 分别表不限制性内切酶的酶切位点。
[0028]图2是pBnSK转基因拟南芥和非转基因对照植株的形态。
[0029]图3是pBnSK转基因拟南芥的花粉染色观察。
[0030]图4是pBnSK转基因拟南芥种子的荧光观察。A为未转基因的拟南芥种子；B为转基因拟南芥(7号)的种子。

[0031]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成,测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，PMD18-T连接试剂盒和T4购自宝生物工程(大连)有限公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体P1300由本实验室改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1300。
[0032]实施例1.合成BarnaseW核苷酸片段
[0033]根据Barnase的高级结构、解淀粉芽孢杆菌密码子的偏好性、双子叶植物密码子的偏好性对Barnase的核苷酸序列进行改造，同时还对决定Barnase温度敏感性的重要氨基酸进行了点突变(Q16I，T17R, K20R, G65S, K66A和K108R)。改造并做完点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO:1，命名为BarnaseW，将该序列由宝生物工程(大连)有限公司合成获得。
[0034]实施例2.植物表达载体pBnSK的构建
[0035]设计用于扩增Pat2g38500的特异性引物:
[0036]引物1:5，-gCCCTCgAgACgATTTgTCCTggTTCAgTgCA-3，(SEQ ID NO:9)
[0037]引物2:5，-CCgagatctCATTggAgAgAgCg-3，(SEQ ID NO: 10)
[0038]以拟南芥的基因组DNA为模板，用上述引物扩增pAt2g38500，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入PMD18-T，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明:所扩增序列是预期的PAt2g38500启动子序列，如序列表中SEQ ID N0:3所示。
[0039]设计用于扩增BarW-N的特异性引物:
[0040]引物3:5，-CCGagatctATGGCTCAAGTG-3，(SEQ ID NO: 11)
[0041]引物4:5，-gatggtgaccttaCCATCCAAGAGCCTGAGCC-3’ (SEQ ID NO: 12)
[0042]以人工合成的BarnaseW基因为模板，用上述引物扩增BarW_N，PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入PMD18-T，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明:所扩增序列是预期的BarW-N序列，如序列表中SEQ ID NO: 4所示。
[0043]设计用于扩增Tnos的特异性引物:
[0044]引物5:5，-tctggtgaccgCGTTCAAACATTTGGC-3，(SEQ ID NO: 13)
[0045]引物6:5，-CAcggtaccCCCgATCTAgTAAC-3，(SEQ ID NO: 14)
[0046]以质粒pBnSI为模板，用上述引物扩增Tnos，PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入PMD18-T，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明:所扩增序列是预期的Tnos序列，如序列表中SEQ ID N0:5所示。[0047]设计用于扩增PAt3g04360的特异性引物:
[0048]引物7:5，-AATggtaccTgAgACCgTgTTCCggggT-3，(SEQ ID NO: 15)
[0049]引物8:5，-CCgAgctcATCATATTTTTTTTgTgTgg-3’ (SEQ ID NO: 16)
[0050]以拟南芥的基因组DNA为模板，用上述引物扩增PAt3g04360，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入PMD18-T，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明:所扩增序列是预期的PAt3g04360启动子序列，如序列表中SEQ ID N0:6所示。
[0051 ] 设计用于扩增BarW-C的特异性引物:
[0052]引物9:5，-tggagctcgactcgagatggttgcttctaagggaaacctc-3，(SEQ ID NO: 17)
[0053]引物10:5，-gatccatggttaCCATCCAAGAGCCTGAGCC-3’ (SEQ ID NO: 18)
[0054]以人工合成的BarnaseW基因为模板，用上述引物扩增BarW_C，PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入PMD18-T，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明:所扩增序列是预期的BarW-C序列，如序列表中SEQ ID NO: 7示。
[0055]设计用于扩增Trbcs的特异性引物:
[0056]引物11:5，-CCgCCATggAgCTTTCgTTCgTATCATCg-3，(SEQ ID NO: 19)
[0057]引物12:5 ，-AgTcagctggATTgATgCATgTTgTCA-3’ (SEQ ID NO:20)
[0058]以质粒pBnSI为模板，用上述引物扩增Trbcs，PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入PMD18-T，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明:所扩增序列是预期的Trbcs序列，如序列表中SEQ ID N0:8所示。
[0059]弓丨物I中序列ctcaga是XhoI的酶切位点，引物2和3中序列agatct是Bgl II的酶切位点，引物4和5中序列ggtgacc是Bstp I的酶切位点，引物6和7中序列ggtacc是KpnI的酶切位点，引物8和9中序列gagctc是SacI的酶切位点，引物10和11中序列ccatgg是NcoI的酶切位点，引物12中序列cagctg是Pvu II的酶切位点。
[0060]将上述测序验证分别连有PAt38500、Barff-N, Tnos、PAt3g04360、Barff-C 和 Trbcs片段的PMD18-T载体，分别根据引物两侧所带的酶切位点进行双酶切，得到序列正确、两端带有相应酶切位点的上述片段。在PCAMBIA1300载体中依次连入上述片段，最终得到植物表达载体pBnSK,如图1所示。
[0061]实施例3.农杆菌介导的拟南芥的遗传转化
[0062]利用电激法将植物表达载体pBnSK转入农杆菌EHA105菌株。
[0063]用农杆菌蘸花法侵染拟南芥，暗中共培养2-3天，然后正常培养至收获种子。在荧光显微镜下挑选带红色荧光标记的种子，并进行分子检测以获得转PBnSK的拟南芥植株。
[0064]实施例4:转基因拟南芥植株的花粉育性检测
[0065]对通过实施例3所述方法获得的转基因拟南芥植株材料进行分析发现，转基因植株和野生型对照植株之间没有明显的形态差异(图2)，但转基因植株的花粉育性与野生型相比明显不同，这表明通过本发明所述方法获得的PBnSK转基因植株除花粉育性表型改变外，没有造成任何其他组织器官的表型变异。
[0066]对上述转pBnSK的拟南芥植株进行花粉可染率检测，同时以野生型拟南芥的花粉作为对照。
[0067]采用的方法为:在拟南芥开花期，从转基因拟南芥植株及其野生型对照植株各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取I个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1%的Alexander溶液(95%乙醇1OmL, 1%孔雀石绿5mL，5g苯酚，1%的酸性品红5mL，1%的橘红G0.5mL,冰醋酸2mL，丙三醇25mL，蒸馏水50mL)，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察，计数可染色花粉数和花粉总数，染成深蓝色的为可育花粉，浅蓝色的为败育花粉(图3显示了染色后的可育花粉粒和不可育花粉粒)。
[0068]分析转基因拟南芥植株的花粉可染率，结果显示对照野生型植株的深蓝色花粉占98.6%~100% ;而多个随机抽取的转基因植株中，5号、7号、14号以及26号植株正常可育花粉(深蓝色)与败育花粉(浅蓝色)比例非常接近1:1，表明所构建的载体的转基因植株可以产生等量的携带外源细胞毒性基因的花粉和不携带外源细胞毒性基因的花粉，即构建体PBnSK使转基因株系花粉的50%失活。其中一个株系的花粉可染率实验结果如图3所示，该结果表明本发明所提供的载体作为整体表达在拟南芥中可以达到预期的花粉失活功能，且没有造成转基因植株其他组织器官的表型变异，证明barnase基因作为细胞毒性基因在花粉中发挥了预期的功能。
[0069]实施例5:转基因拟南芥植株的荧光种子与非荧光种子分离比分析
[0070]将转化pBnSK载体得到的转基因拟南芥植株收获种子后对其所结Tl代种子进行荧光与非荧光种子的分离比例调查，结果表明5号、7号、14号以及26号株系的种子均显示出1:1的分离比，其中一个株系种子的红色荧光分离比分析结果如图4所示，说明本发明所提供的构建体PBnSK可以实现调控花粉育性的功能。