专利名称：包含表面活性剂蛋白质b(sp-b)和表面活性剂蛋白质c(sp-c)的类似物的改良重构的表面 ...的制作方法人肺由大量小气囊组成，称作肺泡，其中气体在肺的血液与空气间层之间交换。在健康个体中，这种交换由存在的包含蛋白质的表面活性剂复合物介导，所述表面活性剂复合物防止呼气结束时肺塌陷。肺表面活性剂复合物主要由脂质组成且包含少量不同的蛋白质。缺乏足够水平的这种复合物导致肺功能障碍。这种综合征称作呼吸窘迫综合征(RDS)且它通常影响早产儿。使用商购的提取自动物肺的改性的天然表面活性剂制剂如称作Gurosurf 的标准制剂有效治疗所述综合征。这些表面活性剂制剂的主要成分是磷脂类和表面活性剂疏水蛋白质B和C(SP_B 和 SP-C)。由于来自动物组织的表面活性剂制剂存在缺陷，例如生产过程复杂和可能的病毒污染和/或诱发免疫反应，所以制备了本领域可利用的合成表面活性剂。所述合成表面活性剂可以是合成化合物、主要是磷脂类和其他脂质的简单混合物且称作“人造”表面活性剂；尽管它们已经用于临床实践多年，但是其功效与改性的天然表面活性剂的功效无法比拟。还包含表面活性剂蛋白质/肽类的人造表面活性剂目前也处于研发中。它们称作 “重构的”表面活性剂或“生物模拟表面活性剂”。然而，根据可得到的文献报道，迄今为止研发的重构的表面活性剂没有一种在肺顺应性方面显示出与提取自动物的表面活性剂的功效相差无几的功效。此外，它们产生肺气体量且在呼气结束时肺泡开放性差，且需要呼气末正压(PEEP)通气以得到与使用改性的天然表面活性剂相差无几的体内活性(Johansson J等人J Appl Physiol 2003,95, 2055-2063 ；Davis AJ 等人 Am J Respir Crit Care Med 1998 ； 157，553-559)。可能的解释在于处于研发中的重构的表面活性剂无法再现改性的天然表面活性剂的完整蛋白质特性，因为它们仅包含一种蛋白质(肽)成分。另一方面，除良好的功效外，表面活性剂组合物还应显示低粘度，以便能够制备在水性介质中的浓混悬液。制备在小体积中的浓混悬液的可能性实际上是将其对极低体征新生儿给药的特别重要的特征。肽磷脂系统是相当复杂的混合物，其特性明显依赖于磷脂混合物的组成和特定的磷脂类/肽组合。另一种肽的存在可以影响组合物的流变性质，从而使得该系统甚至更复杂。4在现有技术中，已经公开了包含模拟人表面活性剂蛋白质的SP-B和SP-C类似物的重构的表面活性剂，例如在WO 0076535，W02008011559和WO 2008044109中。然而，已经证实其中公开的组合物无一在肺顺应性和流变性质、特别是粘度方面具有最佳特性。因此，对重构的表面活性剂制剂仍然存在需求，其具有与提取自动物肺相差无几的功效和最佳流变性质，使得它们在给药时易于递送和分布入肺的支气管肺泡部分。本发明通过提供在肺顺应性和粘度方面具有改良特性的重构的表面活性剂组合物解决了这一问题。发明_既述本发明涉及重构的表面活性剂，其包含a) 1. 2-1. 8%重量的天然表面活性剂蛋白质SP-C的多肽类似物，其由式IPSSPVHL KRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL(SEQ. ID NO 1)表示的序列组成；b)0. 1-0. 5%重量的天然表面活性剂蛋白质SP-B的多肽类似物，其由式CWLCRALI KRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS(SEQ. I D NO 2)表示的序列组成；45 55-55 45重量比的单不饱和与饱和磷脂；全部含量均相对于重构的表面活性剂的总重计算。本发明还提供了药物组合物，其包含请求保护的单独的重构的表面活性剂或该表面活性剂与一种或多种药学可接受的载体的组合。本发明还提供了请求保护的重构的表面活性剂作为药物的应用。在另一个方面，本发明提供了请求保护的重构的表面活性剂在预防和/或治疗呼吸窘迫综合征(RDS)和其他呼吸病中的应用。此外，本发明提供了请求保护的重构的表面活性剂在制备用于预防和/或治疗呼吸窘迫综合征(RDS)和其他呼吸病的药物中的应用。本发明还提供了用于预防和/或治疗呼吸窘迫综合征(RDS)和其他呼吸病的方法，该方法包括对有这种治疗需求的患者给予治疗有效量的上述的重构的表面活性剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，包括通过灌洗技术给予本发明的稀释的重构的表面活性剂，以除去有害物质和/或炎性渗出物，使肺扩张并且改善肺功能。最终，本发明还涉及药盒，其包含a)在第一单位剂型中的上述的干粉形式的重构的表面活性剂；b)在第二单位剂型中的药学可接受的载体；和C)用于容纳所述第一种和第二种剂型的容器装置。定义表面活性剂制剂的“表面活性剂活性”被定义为降低表明张力的能力。外源性表面活性剂制剂的体外功效通常通过使用适合的装置如WiIhelmy Balance和Captive Bubble Surfactometer测定其减低表面张力的能力来测试。外源性表面活性剂制剂的体内功效通常通过测量两个参数来测试i)为肺顺应性指数的潮气量；和ii)为呼气结束时肺泡气扩张或开放性的气体量，和由此在呼气结束时在肺泡内形成稳定的磷脂薄膜的能力。本文所用的“治疗有效”量意指能够预防、避免、减轻或消除呼吸病或与内源性表面活性剂缺乏或功能障碍相关的疾病的重构的表面活性剂的量。术语“药学可接受的”或“生理学可耐受的”意指能够对人给药、但不产生不期望的生理学效应的组合物、介质、溶剂、盐。术语“天然表面活性剂蛋白质SP-C的多肽类似物”意指具有氨基酸序列的多肽， 其中与天然SP-C蛋白质相比，氨基酸缺失和/或已经被其他氨基酸替代，条件是在与磷脂类的混合物中，该多肽显示肺表面活性剂活性(正如通过体外和体内功效试验所证实的)。术语“天然表面活性剂蛋白质SP-B的多肽类似物”意指具有氨基酸序列的多肽， 其中与天然SP-B蛋白质相比，氨基酸缺失和/或已经被其他氨基酸替代，条件是在与磷脂类的混合物中，该多肽显示肺表面活性剂活性(正如通过体外和体内功效试验所证实的)。“重组”在涉及到例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过导入异源性核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质被修饰。本文所用的应用于点值的术语“约”表示士的变异性。磷脂类是脂质，其中一个脂肪酸被磷酸基团和简单有机分子替代。可以在表面活性剂制剂中发现的最常见类型的磷脂类是磷脂酰胆碱类(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰丝氨酸(PS)。磷脂类的甘油基部分主要被长链脂肪酸酯化，由此可以是饱和的(例如肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸)、单不饱和的(例如油酸)或多不饱和的(例如亚油酸和花生四烯酸)。特别地，本申请中所考虑到的种类是-1,2- 二棕榈酰基-sn-甘油_3_磷酸胆碱，也称作二棕榈酰基_磷脂酰胆碱 (DPPC)，其为饱和衍生物；和1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油，也称作棕榈酰基-油基-磷脂酰甘油(POPG)，其为单不饱和衍生物。“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用以指氨基酸残基的聚合物。氨基酸序列根据在左端携带游离氨基(氨基末端)的氨基酸和在右端携带游离羧基(羧基末端)的氨基酸的单字母密码表示。本文确定的全部氨基酸残基是天然L-构型且本文确定的序列根据氨基酸残基的标准缩写报道。为避免疑虑，氨基酸衍生物L-正亮氨酸在本文中称作nLeu，且L-鸟氨酸缩写为Orn01显示作为本发明重构的表面活性剂(n;b)与Curosurf 和未治疗动物(η = 动物数量)的时间/压力函数的潮气量(ml/kg)结果。图2显示本发明重构的表面活性剂(N3)与Curosurf 和未治疗动物(n =动物数量)的肺气体量(ml/kg)结果。发明详述构建多因素实验设计以研究WO 2008044109中一般公开的表面活性剂组合物中磷脂类和SP-B和SP-C类似物的相对量如何影响粘度，以及所述成分在重构的表面活性剂中如何彼此影响。已经发现SP-B类似物的量对表面活性剂组合物的粘度具有显著影响，且由此 SP-B的含量应维持尽可能低以便与治疗功效一致，从而将重构的表面活性剂的粘度降至可接受的低水平。WO 2008044109涉及DPPC POPG之比，优选等于或大于7 3在SP-B类似物的存在下的应用。WO 2008044109未提及这种表面活性剂组合物的粘度。目前已经发现当表面活性剂中SP-B类似物的量最小时，双饱和磷脂类如DPPC与不饱和磷脂类如POPG之间的高比例导致相应组合物的不可接受的高粘度。然而，我们已经通过制备低SP-B表面活性剂克服了这一问题，其中不饱和磷脂与饱和磷脂之比降至低于现有技术所公开的水平，优选达到约1 1，且已经证实这些表面活性剂组合物具有令人意外的低粘度，使得它们能够用于所有的临床应用。在一个实施方案中，本发明涉及重构的表面活性剂，其包含a) 1. 2-1. 8%重量的天然表面活性剂蛋白质SP-C的多肽类似物，其由式IPSSPVHL KRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL(SEQ. ID NO 1)表示的序列组成；b)0. 1-0. 5%重量的天然表面活性剂蛋白质SP-B的多肽类似物，其由式CWLCRALI KRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS(SEQ. ID NO 2)表示的序列组成；45 55-55 45重量比的单不饱和与饱和磷脂；全部含量均相对于重构的表面活性剂的总重计算。在本发明的重构的表面活性剂中，SP-C蛋白质类似物成分优选占重构的表面活性剂总重的1. 4-1. 6%、且更优选约1. 5%重量。在本发明的重构的表面活性剂中，SP-B蛋白质类似物成分优选占重构的表面活性剂总重的0. 2-0. 4%、且更优选约0. 2%重量。本发明的重构的表面活性剂可以有利地包含饱和磷脂类如二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)和二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)和单不饱和磷脂类如棕榈酰基油基磷脂酰胆碱 (POPC)和棕榈酰基油基磷脂酰甘油(POPG)。用于本发明应用的优选的饱和磷脂是DPPC，而优选的单不饱和磷脂是P0PG。有利地，磷脂类的合并重量占重构的表面活性剂总重的至少90%、有利地至少 95%、优选至少97. 7%、更优选98. 3%。在一个实施方案中，本发明涉及重构的表面活性剂，其包含a)约1. 5%重量的天然表面活性剂蛋白质SP_C的多肽类似物，其由式IPSSPVHLK RLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL(SEQ. ID NO 1)表示的序列组成；b)约0. 2%重量的天然表面活性剂蛋白质SP-B的多肽类似物，其由式CWLCRALIK RIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS(SEQ. ID NO 2)表示的序列组成；c)约50 50重量比的1，2- 二棕榈酰基-sn-甘油_3_磷酸胆碱(DPPC)与1_棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)；全部含量均相对于重构的表面活性剂的总重计算。在一个特定的实施方案中，本发明涉及重构的表面活性剂，其包含a)约1. 5%重量的天然表面活性剂蛋白质SP_C的多肽类似物，其由式IPSSPVHLK RLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (SEQ ID :N0. 1)表示的序列组成；b)约0. 2%重量的天然表面活性剂蛋白质SP-B的多肽类似物，其由式CWLCRALIK RIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (SEQ ID :N0. 2)表示的序列组成；c)约49. 15%重量的1，2_ 二棕榈酰基-sn-甘油_3_磷酸胆碱(DPPC)；和d)约49. 15%重量的1-棕榈酰基_2_油基-sn-甘油_3_磷酸甘油(POPG)，全部含量均相对于重构的表面活性剂的总重计算。在一个优选的实施方案中，SEQ ID :N0. 2的多肽可以是二硫键合的分子形式，其中分子内二硫键在1-与33-位上的两个半胱氨酸残基之间和/或在4-和27-位上的两个半胱氨酸残基之间。SEQ ID :N0. 1的多肽在WO 2008044109(完整引入本文参考)中称作 SP-C33 (Leu)，而 SEQ ID 2 的多肽在 WO 2008044109 中称作 Mini-B(Leu)且其二硫键连接形式称作 ox Mini-B (Leu)。在一个甚至更优选的实施方案中，本发明的重构的表面活性剂主要由所请求的含量的成分a)、b)、c)和任选的d)组成。有利地，两种多肽都可以以药学可接受的盐的形式存在。所述盐包括，例如盐酸盐、乙酸盐和三氟乙酸盐。优选地两种多肽都以乙酸盐的形式存在于组合物中。此外，POPG可以有利地以药学可接受的盐的形式存在，例如为钠盐(P0PG Na)。可以根据本领域技术人员众所周知的方法或重组技术制备SEQ ID :N0. 1和SEQ ID :N0. 2的多肽类。有关经典溶液合成，许多可利用技术的极佳的概要可以在J.M. Meward和 J.D.Young, “ Solid Phase Peptide Synthesis“ , W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969,禾口 J. Meienhofer, " Hormonal Proteins and Peptides" , Vol. 2, p.46, Academic Press (New York)，1983 有关固相肽合成和 Ε· Schroder 和 K. Kubke, “ The Peptides “， Vol. 1，Academic Press (New York), 1965 中找到。优选地可以使用最初Merrifield 在 J. Am. Chem. Soc. 85 :2149-2154(1963)中描述的固相合成技术制备多肽类。其他多肽合成技术例如在M.BodanSzky等人，Peptide Synthesis, John ffiley&Sons, 2d Ed.，(1976)和本领域技术人员公知的其他参考著作中可以找到。用于这种合成的合适的保护基可以在以上教科书和J. F. W. McOmie，Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY(1973)中找至丨J。例如，可以如W02008044109中所述制备两种多肽。用于治疗如本文所述的诸如RDS这样的疾病的本发明重构的表面活性剂的有效剂量根据许多不同因素而改变，包括疾病类型、给药方式、患者的体重和生理状态和治疗是预防性的还是治疗性的。一般而言，剂量由0.01mg-10g/kg体重，优选0. Ι-lg/kg体重组成，且给药次数可以根据是采用预防性治疗还是采用治疗性治疗的不同而改变。典型地，在一次剂量中给予约50mg/kg、100mg/kg或200mg/kg的剂量。为了新生儿应用，一般一次或两次给药就足够了。尽管要求可以根据呼吸病的严重性和/或其他变量的不同而改变，但是用于有效剂量的最佳范围的确定属于本领域技术人员的技能。本发明还涉及包含本发明的重构的表面活性剂的药物制剂。所述制剂有利地以溶液、分散液、混悬液或干粉形式给予。优选所述组合物包含溶于或混悬于合适的生理学可耐受的溶剂或再混悬载体如水或生理盐水溶液(0. 9% w/v NaCl)的重构的表面活性剂。本发明的制剂可以包含水溶液，优选无菌水溶液，其还可以包含PH缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。可以将制剂制成单剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶，或可以将其贮存在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前即刻加入无菌液体载体。优选地将本发明的重构的表面活性剂作为在单一应用的玻璃小瓶中的在生理盐水水溶液中的无菌混悬液提供。可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备药物制剂。这样的技术包括在有机溶剂的存在下混合多肽类和磷脂类的步骤。然后通过在氮气气氛中透析或蒸发和/或暴露于真空或通过其他本领域技术人员众所周知的合适的技术如冻干除去溶剂。有利地，残留溶剂的量可以低于0. 1%，优选低于0.05%，更优选低于0.003%，甚至更优选低于0.001%重量。然后将得到的粉末均勻和紧密地与液体载体固体细粉或它们两者混合。可以在例如通过无菌过滤除去溶剂前对多肽类和磷脂类的混合物无菌化。在一些其他实施方案中，根据本领域众所周知的方法对重构的表面活性剂组合物末端灭菌。按照本领域技术人员公知的方式进行本发明重构的表面活性剂的给药，例如，通过气管内滴入(输注或推注或通过导管)、通过喷雾给药或喷雾法。正如本文所公开的，本发明关注如本文进一步描述的浓和稀表面活性剂制剂的应用，这取决于具体应用。浓表面活性剂组合物典型地用于“推注”类型的给药，而稀表面活性剂组合物典型地用于“灌洗”类型的给药。有利地，在根据本领域众所周知的方法使用市售的常用粘度计测定时，所述制剂的粘度低于20cP、优选低于15cP。有利地，就“推注”类型的给药而言，以重量/ml溶液或混悬液(添加液体载体后) 表示的重构的表面活性剂浓度是约0. 1-约100mg/ml，优选5_80mg/ml。在本发明的一个优选的实施方案中，当通过作为在生理盐水(0. 9% w/v氯化钠水溶液)中的混悬液气管内滴入给予重构的表面活性剂时，浓度为约80mg/ml。因此，本发明的一个优选的实施方案涉及在生理盐水中的水性混悬液形式的药物制剂，其包含约80mg/ml的重构的表面活性剂，该表面活性剂由如下成分组成a)约1. 5%重量的天然表面活性剂蛋白质SP-C的多肽类似物，其由式I PSSPVHL KRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL(SEQ ID :N0. 1)表示的序列组成；b)约0. 2%重量的天然表面活性剂蛋白质SP-B的多肽类似物，其由式CWLCRALIK RIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS(SEQ ID :N0. 2)表示的序列组成；c)约49. 15%重量的1，2- 二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)；和d)约49. 15%重量的1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)，全部含量均相对于重构的表面活性剂的总重计算。典型地，所述制剂的粘度在25°C为约9 士 3cP且在37°C为8 士 3cP，正如使用市售可得到的常用旋转粘度计测定的。当用于灌洗给药时，典型的表面活性剂浓度为约0. l-20mg/ml且更优选约90. 5-10mg/ml (以mg表面活性剂/ml溶液或混悬液表示)。由于取决于浓度，所以稀制剂的粘度甚至可以更低。当作为药物治疗应用时，可以单独或任选地与用于治疗呼吸病或障碍的其他化合物或组合物结合给予包含本发明重构的表面活性剂的制剂。例如，如果治疗受试者因细菌感染导致的呼吸病，则可以将本发明重构的表面活性剂与另一种用于治疗细菌感染的化合物如抗生素一起给药。否则，在某些情况中，例如用于预防诸如旋转粘度计这样的并发症，可以将本发明重构的表面活性剂与皮质类固醇如布地奈德和丙酸倍氯米松结合给药。在某些实施方案中，可以将本发明重构的表面活性剂和再混悬载体分别同时包装在适合的容器装置中。这种将成分单独在适合的容器装置中的包装也描述为药盒。因此，本发明还涉及药盒，其包含a)在第一单位剂型中的上述举出的干粉形式的重构的表面活性剂；b)在第二单位剂型中的药学可接受的载体；和C)用于包含所述第一种和第二种剂型的容器装置。优选地药学可接受的载体是生理盐水溶液、更优选无菌的。正如本文所公开的，用于给予本发明的重构的表面活性剂及其制剂的方法是可得到的且是本领域技术人员众所周知的。根据疾病类型的不同，例如具有呼吸窘迫综合征的婴儿或成年人的不同，不同的治疗方法可能是合适的。典型地，通过保持在连续或间歇性正压换气(IPPV)下对患者器官内滴入(例如早产儿)给予所述的表面活性剂。或者，可以通过使用气管内和通过特别设计的鼻装置如面罩、叉状物或导管支持的患者体内放置的细导管、根据称作鼻腔持续正压通气(nCPAP)的方法给予所述的表面活性剂。后一种手段仅能够应用于具有低粘度的表面活性剂，因为高粘度使得表面活性剂通过细导管更困难。在患者患有与肺部炎症、肺部感染或肺挫伤相关的呼吸窘迫症的例子中，可以推荐特定的治疗方法。在一种这样的治疗方法中，用本发明的表面活性剂组合物灌洗患者作为单次或多次治疗进行。本发明的重构的表面活性剂适合于预防、延缓、缓解、阻止或抑制与呼吸病相关的症状或病症发生。特别地，它可用于预防和/或治疗早产新生儿的呼吸窘迫综合征(RDS)或其他与表面活性剂-缺乏或功能障碍相关的疾病，包括急性肺损伤(ALI)、成年人中的RDS(ARDS)、 胎粪吸入综合征(MAQ和支气管肺发育不良(BPD)。它还可以用于预防和/或治疗其他呼吸病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、呼吸道感染(例如肺炎、卡氏肺囊虫、囊性纤维化和呼吸道合胞病毒)和用于治疗严重性浆液性中耳炎(胶耳)。下列实施例更详细地示例本发明。 实施例10实施例1成分对粘度的影响构建多因素实验设计，以评价成分对制剂粘度方面的影响。测试不同百分比的多肽类 SP-C33 (Ieu)和 οχ-Mini-B (Ieu)和不同比例的 DPPC 和 POPG Na。将所有得到的混合物以80mg/ml的浓度重新混悬于生理盐水溶液(0. 9 % w/v)。在25°C 和 37°C 使用应用 100r. p.m.转速的 VISCO STAR Plus (Fungilab)粘度计测定粘度。为比较目的，Curosurf 显示粘度介于6和IOmPas之间(ImPas = 1厘泊)。将结果报道在表1中。表

本发明涉及重构的肺表面活性剂，其包含脂质载体、天然表面活性剂蛋白质SP-C的多肽类似物与天然表面活性剂蛋白质SP-B的特定的多肽类似物的组合。本发明还涉及其药物制剂及其在治疗或预防RDS和其他呼吸病中的应用。