专利名称：一种草鱼水霉病疾病模型的建立方法水霉病(Saprolegniasis)又叫肤霉病(Dermatomyucosis),是由丝状真菌引起的一种水产养殖常见病害，其中最主要的病原是水霉(Saprolegnia)和绵霉(Achlya)两个属的种类，二者均属于水霉科(Saproleniaceae)。水霉对寄主无严格选择性,各种水产动物从卵到各龄成体都可感染。一般认为水霉是腐生性的，对水产动物是一种继发感染。养殖动物受伤或因组织的营养而迅速生长，致命组织发炎、坏死，鱼体负担过重，游动失常，食欲减退，很快瘦弱死亡。长期以来，水霉病的防治是鱼类病害防治中最棘手的一个难题之一。为了更有效的防治水霉病，现在许多国家的研究者致力于这方面的研究工作，而水霉病疾病模型的建立则是水霉病防治研究中的重要一环。鱼类试验动物疾病模型在新渔药研发过程中起着举足轻重的作用，新渔药研发流程有以下四个阶段第一个阶段是发明(发现)阶段，第二个阶段是非临床(临床前)研究阶段，第三个阶段是临床研究阶段，第四个阶段是上市后阶段。鱼类试验动物疾病模型一般在第三阶段发挥作用，此阶段主要确定新渔药产品是否有进一步研发的意义。该试验包括试验动物疾病模型耐受性试验，寻找有效剂量和中毒剂量范围，确定试验动物的有效性和安全性；开展试验动物疾病模型的药代动力学及生物利用度试验，为下步推荐临床使用剂量提供依据，即用健康靶动物在可控条件下进行药效对照试验，并进行鱼类试验动物疾病模型药代动力学试验，确定初步的有效剂量，因此也有人称为剂量确定实验。试验动物疾病模型对于学科和技术的发展极为重要，医学和陆生动植物已建立了包括动物试验、组织培养和病原保藏中心等在内的数百种标准试验模型，有力地促进了医学和陆生动植物病害研究的发展，而水生生物标准的试验模型(包括组织培养模型、鱼类试验动物疾病模型和病原库)相对来说数量极少。而目前关于草鱼QCtenopharyngodoni而7^ ，属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属)水霉病疾病模型及其建立方法还未见报道。
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种草鱼水霉病疾病模型的建立方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种草鱼iCtenopharyngodon水霉病疾病模型的建立方法,所述的方法选自下列方法中的一种 1)将草鱼刮伤后置于含水霉孢子IX IO3 I X IO5个/mL的水体中，25°C下恒温养殖； 2)将草鱼刮伤后置于含水霉孢子IX IO3 I X IO5个/mL的水体中，使水温在Ih内降低8 12°C或者使水温在Ih内升高8 12°C，养殖。所述的水霉是多子水霉ferax、。所述的水体是经曝气、消毒和去氯处理后的自来水。所述的水体pH值是6. 5 6. 8。所述的水体是经下述方法处理的接种水霉至水中，在水温20 30°C条件下培养霉菌至其浓度为I X IO3 I X IO5个/mL。所述的草鱼体重40 55g、体长15 17cm。
所述的草鱼是经下述方法刮伤的将背鳍下方两侧鳞片去掉，擦拭去掉鳞片部位的皮肤2 4cm2，并擦拭掉伤口表面的粘液。所述的方法优选将25°C下养殖的草鱼刮伤后置于含水霉孢子I X IO3 I X IO5个/mL的水体中，使水温在Ih内由25°C降低至15°C，养殖48h以上。本发明优点在于
I、本发明的方法一将草鱼刮伤后置于含水霉孢子I X IO3 I X IO5个/mL的水体中，25°C下恒温养殖，该方法平均可获得13. 3%的草鱼水霉病模型，克服了水霉病发病不确定、难以收集水霉病鱼体的缺陷，令研究者可随时采用实验性诱发的方法在鱼体身上复制出来，取得条件一致的模型材料，为水霉病的研究和防治提供了重要的手段和工具。2、本发明的方法——将草鱼刮伤后置于含水霉孢子IX IO3 IX IO5个/mL的水体中，使水温在Ih内降低8 12°C或者使水温在Ih内升高8 12°C养殖，该建立草鱼水霉病模型的方法感染率更高、感染速度更快且成功重复率高，适于普遍推广使用。


附图I是用本发明的方法成功感染水霉病的草鱼。附图2是感染水霉病的草鱼皮肤表面明显的黄色水霉菌丝。附图3是感染水霉病的草鱼真皮组织病理切片(HE染色，100 X )。附图4是图3的局部放大图。

作详细说明。实施例I I实验用鱼
实验用草鱼购自江苏南通国营农场，规格为草鱼体重是40 55g/尾、体长15 17cm/尾。体表和解剖观察健康,暂养7天。2菌株来源
水霉菌株为寄生水霉(Saprolegnia parasitica),购于ATCC,即美国模式培养物集存库(American type culture collection),菌株编号200013。3暂时饲养管理
用200 L容积玻璃缸饲养，增氧器24h增氧；水源为经曝气、消毒和去氯处理后的自来水，pH 6. 6，平均水温25°C，溶氧10 mg/L，其他指标符合渔业水质标准。饲料配制参照NRC营养标准。4水霉培养及水体增殖挑取保藏于试管内的水霉菌丝转接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，配方马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，纯水1000毫升，pH自然)培养皿中，25°C培养72h使其铺满整个培养皿。取10个培养好水霉的培养皿，将水霉连同培养基取出，装入纱布袋，系好后放入用于感染的玻璃缸(20L)水中(该水体同步骤3使用的水体相同)，水温为25°C。将若干事先用水煮开裂的玉米粒放入该玻璃缸水体内，观察到90%玉米粒有水霉生长，即判断玻璃缸水体中有水霉存在。其次，将该玻璃缸中的水在显微镜下观察并计数孢子浓度，当孢子浓度IX IO4 spores/mL时,用于感染实验。5实验设计 5. I实验分组
实验选取三个感染条件刮伤、水温变化、水霉浸泡，对草鱼分别进行独立的水霉病人工感染实验。通过不同的条件分组对照确定其中影响水霉病感染的条件，同时优化出最佳的水霉病人工感染方式。具体分组为三条件实验组刮伤、水温变化、水霉浸泡组；双条件实验组变温、刮伤组；刮伤、水霉浸泡组；变温、水霉浸泡组；单一条件对照组刮伤组；水霉浸泡组；变温组；阴性对照组不刮伤，无水温变化，无水霉浸泡。每组设三个平行对照缸，每个平行对照缸放草鱼5尾。试验前24h停止给试验鱼喂食，整个试验期间亦不喂食。5. 2人工感染
用手术刀片将草鱼背鳍下方两侧鳞片去掉，并用钢丝球反复擦拭去掉鳞片部位的皮肤3cm2，将刮伤后的草鱼分别放入上述几组用于感染的玻璃缸水中，其中有变温条件的实验组温度变化通过空调进行控制，水温因室温的变化而变化，在Ih内由原水温25°C下降到15°C。两天(48h)后即可开始观察感染结果。5. 3方法可靠性检验
对感染效果较好的感染条件组进行重复性实验，以评价方法的可靠性，建立水霉人工病感染方法。即针对感染效果较好的方法重复进行三次实验，每次设置三个平行对照缸，同样每个平行对照缸放草鱼5尾。6数据处理
实验数据以平均值表示，采用SPSS 13. O软件对方法的可靠性进行F检验，评价方法可靠性。P > O. 05表示用该法进行水霉病人工感染各重复次数间无显著差异，方法可靠性好。7 结果
7. I人工感染结果
观察发现刮伤、变温、水霉浸泡三条件组的草鱼在48h内即可在背鳍下两侧肌肉刮伤处长出棉絮状白色水霉菌丝，且草鱼平均感染率均为100%。而其他对照组的草鱼在48h内均未见有水霉生长。继续观察至第四天(96h)，刮伤、水霉浸泡组有个别草鱼长出水霉，其他组仍未见水霉生长。结果见表1-1、图I、图2。表1-1 96h草鱼人工感染结果

本发明提供了一种草鱼水霉病疾病模型的建立方法，所述的方法选自下列方法中的一种1)将草鱼刮伤后置于含水霉孢子1×103～1×105个/mL的水体中，25℃下恒温养殖；2)将草鱼刮伤后置于含水霉孢子1×103～1×105个/mL的水体中，使水温在1h内降低8～12℃或者使水温在1h内升高8～12℃，养殖，优选将25℃下养殖的草鱼刮伤后置于含水霉孢子1×103～1×105个/mL的水体中，使水温在1h内由25℃降低至15℃，养殖48h。本发明的方法成功地建立了草鱼水霉病模型，且感染率高、感染速度快、成功重复率高，克服了水霉病发病不确定、难以收集水霉病鱼体的缺陷，为水霉病的研究和防治提供了重要的手段和工具，适于普遍推广使用。