当归多糖的分离提取工艺及其应用的制作方法【技术领域】，具体而言，涉及一种当归多糖的分离提取工艺及其应用。[0002]当归是伞型科植物当归(angelica sinensis diel)的干燥根，主产于我国甘肃岷县、云南、四川、陕西、湖北等地。当归味甘、辛、性温，为著名常用中药，有补血活血、调经止痛、润肠通便之效，用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，肠燥便秘等病症。随着对当归越来越深入的研究和新技术的应用，已经分离得到了多种化学活性成分:藁本内酯、阿魏酸、当归多糖、微量元素、维生素、氨基酸，查耳酮、倍半萜烯、炔类化合物。近年来，植物多糖的促进造血作用、免疫调节作用在抗肿瘤、对黏膜损伤有直接的治疗作用、对肝脏的保护作用，能够调节肝药酶的活性、抗衰老方面表现出了良好效果，当归多糖(angelica polysaccharides,当归多糖)也引起了人们的兴趣。目前多糖研究发展迅速，形成了空前的趋势，研究范围涉及多糖的提取、分离纯化、结构分析、生物学活性、药理学作用、新药评价及临床应用等各个方面。目前造血干细胞移植(hematopoietic stemcell transplantation, HSCT)是治疗白血病和实体瘤的有效方法,外周血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT)因其具有米集细胞方便、供者痛苦少、以及移植后造血和免疫重建快等优点，被临床广泛接受，已有替代骨髓移植之趋势。正常情况下外周血干细胞(peripheral blood stem cell, PBSC)的数量很少,远远不能满足造血干细胞移植时所需的数量，因此需要进行动员才能获取足够数量的PBSC以保证移植成功。所以，外周血干细胞动员剂的研究与应用是PBSCT是否成功的关键技术环节之一。而目前所采用的外周血干细胞动员剂都有其局限性，从而限制了 PBSCT的广泛开展。所以寻找新的PBSC动员剂成为PBSCT领域的热点问题之一。[0003]当归为中医“补`血、活血”的要药，当归多糖是其主要有效成分之一，现代实验研究证明:当归多糖对正常或贫血小鼠的髓系造血祖细胞(BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-MK)的增殖分化有显著的促进作用；同时当归多糖在体外可促进人红系、粒单系及混合系造血组细胞的增殖分化。但由于以往提取的当归多糖的含量低(30%~60%)给其生物活性的判断造成了一定的影响，所以如何通过提取、分离纯化以获得糖含量高的当归多糖是研究其药理效应的重要前提。
[0004]本发明的目的是提供一种纳豆解酒口服液及其应用，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案。[0005]本发明涉及一种当归多糖的的分离提取工艺，其特征在于包括如下步骤:当归粗粉直接用水提取，提取液浓缩后用95%乙醇沉淀得粗多糖，粗多糖经水溶解后，加饱和Ca(OH)2除蛋白，分别经过强酸性阳离子交换树脂(SACER)和强碱性阴离子交换树脂(SBAER)处理，浓缩后用透析袋透析，浓缩后即可得到当归多糖，[0006]在本发明的一个优选实施方式中，所述的分离提取工艺为:每500g当归粗粉，用蒸馏水5000ml煮提3次，每次2h，合并水提取液，浓缩后加95%乙醇沉淀得到粗多糖，粗多糖用蒸馏水溶解后，加入饱和Ca(OH)2液，将溶液调节pH至10除蛋白，离心后上清液用H2SO4 (3mol.L1)调 pH 至 4，过 SACER ；SACER 交换液用 NaOH (4mo1.L1)调 pH 为 10 ~11，过SBAER，交换液调pH至7~8，浓缩后用透析袋透析3天，透析袋内液浓缩后加95%乙醇沉淀得到纯度高当归多糖，在真空干燥器内(温度40°C，真空度为-0.09)干燥48h，所得当归多糖为白色粉状物。
[0007]本发明另一方面还涉及采用上述分离提取工艺得到的当归多糖。
[0008]在本发明的另一方面还涉及上述当归多糖作为外周血干细胞动员剂中的应用。
[0009]本发明公开的提取分离纯化方法简单易行，所得到的中性当归多糖纯度高，当归多糖对小鼠外周血WBC、LC数有明显升高作用，为进一步研究当归多糖对HSPC (造血干细胞)的动员作用提供理论指导和实验依据。

[0011]1.1药材:去皮当归头中国甘肃岷县购于重庆市中药材市场
[0012]1.2 试剂:
[0013]959ffitOH:医用酒精重庆北碚酒厂
[0014]透析袋(截留分子量10000):华美生物工程公司
[0015]氢氧化钙:AR重庆东方试剂厂
[0016]732型强酸性阳离子树脂:上海振光树脂厂
[0017]717型强碱性阴离子树脂:上海振光树脂厂
[0018]H2SO4:AR国营重庆无机化学试剂厂
[0019]盐酸:AR国营重庆无机化学试剂厂
[0020]氢氧化钠:AR北京红星化工厂
[0021]三氯乙酸:AR上海三爱思试剂有限公司
[0022]pH试纸:天津化学试剂厂
[0023]1.3 仪器
[0024]电子调温电热套:天津市泰斯特仪器有限公司
[0025]旋转蒸发仪:RE_52型上海青浦泸西仪器厂
[0026]离心机:LD4_2型北京医用离心机厂
[0027]电子天平:MP400-1型上海分析天平厂
[0028]微型循环真空水泵:SHB-D型郑州市上街区仪器厂
[0029]-20°C冰箱:长岭冰箱厂
[0030]真空干燥器:DZF_1型上海跃进医疗器械厂
[0031]磨口层析柱:配套的球型漏斗500ml 45cmX4cm重庆高教玻璃仪器厂
[0032]2.方法
[0033]1.当归多糖提取条件[0034]1.1常规当归多糖提取方法
[0035]称取当归粗粉，加95%乙醇回流2次，过滤，残渣挥去乙醇，用蒸馏水提取2次，浓缩,加95%乙醇沉淀得到粗多糖，用水溶解粗多糖，用10%三氯乙酸(Trichloroaceticacid, TCA)或饱和Ca(OH)2除蛋白，结果多糖纯度分别为:32.8%和38.5% ;将上述粗多糖溶解透析3天后纯度分别为:37.7%和42.8%。结果表明采用常规方法得到的当归多糖的纯度不高，必须进一步纯化。
[0036]1.2对常规方法改进
[0037]当归粗粉直接用水提取，浓缩后加95%乙醇沉淀粗多糖，加饱和Ca(OH)2除蛋白，结果所得多糖的纯度为:38.5% ;将上述粗多糖溶解，用稀硫酸调pH至酸性后过SACER，结果所得多糖纯度为68.7% ;将过SACER的溶液用NaOH调节pH为碱性，过SBAER，结果所得多糖纯度为:78.3% ;再将过SBAER的交换液浓缩，用透析袋透析后所得多糖纯度为:87.2%。
[0038]通过对上述方法的比较，确定当归多糖提取分离纯化基本路线，即:当归粗粉直接用水提取，提取液浓缩后用95%乙醇沉淀得粗多糖，粗多糖经水溶解后，加饱和Ca(OH)2除蛋白，分别经过SACER和SBAER处理，浓缩后用透析袋透析，浓缩后即可得到纯度较高的当归多糖，并且对当归多糖分离纯化条件进行优化。
[0039]2.当归多糖提取工艺的优化
[0040]采用直接用蒸馏水提取，每次称取当归粗粉500g进行提取，对提取时间、提取次数和水的用量三个因素按L9 (34)进行正交试验以确定最佳提取条件。蒸馏水的用量分别为3000ml、4000ml，5000ml，提取时间分别为lh、2h、3h，提取次数分别为2次、3次、4次。正交试验因素和水平见表1-1，提取工艺方案见表1-2。
[0041]表1-1试验因素与水平
[0042]