专利名称：一种生产纤维素乙醇的方法能源是人类赖以生存和持续发展的重要物质基础。而常规化石能源的储量极其有 限，全球已探明的石油、天然气和煤炭储量将分别在今后40、60和100年左右耗尽。同时， 利用化石能源所造成的环境污染和气候变化对人类生存和发展也提出了严峻挑战。这使得 开发新型、清洁、可再生的新能源变得非常必要和紧迫。生物质能源作为新兴能源之一，据 估计，在未来40年将占全球总能耗的40%。燃料乙醇是生物质能源中最容易实现产业化的 品种之一，它作为一种新型的清洁能源，是正在使用的汽车燃料的理想替代品。目前，通过 发酵玉米淀粉、甘蔗汁等已经实现第一代燃料乙醇产业化。然而，随着我国人口不断增加， 粮食危机日益加剧，利用玉米淀粉、甘蔗汁等生产燃料乙醇势必将会严重影响粮食和饲料 供给。纤维素是地球上最廉价、最丰富的可再生资源之一，应用纤维素作为原料可以有效地 避免乙醇生产和人类粮食供给的矛盾。同时，由于纤维素也是太阳能的转化载体之一，生产 和利用纤维素乙醇，并不会引起环境中C02总量的增加。因此，纤维素生物质已成为大规模 燃料乙醇生产中极具吸引力的原料。对我国而言，发展不与人争粮、不与粮争地，环境友好 的纤维素乙醇有利于低碳经济的发展，有助于推动生物质能源替代化石燃料的进程。利用纤维素生产燃料乙醇，其最大的瓶颈在于生产成本过高。由纤维素 到乙醇的转化目前有四种策略可以实现分步水解和发酵(S印arateHydrolysis and Fermentation, SHF)、同步糖化与发酵(SimultaneousSaccharification and Fermentation, SSF)、同步糖化与共酵角军(SimultaneousSaccharification and Co-Fermentation, SSCF)和联合生物加工(ConsolidatedBioProcessing，CBP)。对于 SHF、 SSF和SSCF，其成本主要在于纤维素酶的生产或购买、纤维素原料的预处理、预处理物的 糖化水解三个方面([Lynd，L. R.，ffeimer, P. J.，van Zyl, ff. H.，Pretorius, I. S. 2002. Microbialcellulose utilization :fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 506-577. ]、[Xu, Q. , Singh, A. , Himmel, M. E. 2009. Perspectivesand new directions for the production of bioethanol using consolidatedbioprocessing of lignocellulose. Curr. Opin. Biotechnol. 20，364-371.])。联合生物加工(CBP)将纤维素 酶生产、水解糖化和戊糖己糖共发酵整合在同一反应器内由同一微生物或微生物群落完成 ([Lynd, L R.，van Zyl, W. H.，McBride，J. E.，Laser，M. 2005. Consolidated bioprocessing of cellulosicbiomass :an update. Curr. Opin. Biotechnol. 16，577-583. ]、[Lynd, L R.， Weimer, P. J.，van Zyl, W. H.，Pretorius，I. S. 2002. Microbial celluloseutilization fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66，506-577.])。 其 减 少了工艺步骤；降低了工艺的复杂性；不需要为纤维素酶的生产或购买投入资金，因此 可以大幅度降低生产成本，被公认为是最理想的纤维素乙醇生产路线([Cardona，C. A.， Sanchez, 0. J.2007. Fuelethanol production :Process design trends and integrationopportunities. Bioresource Technology 98，2415-2457.]、[Gray, K. A. , Zhao，L.， Emptage, M. 2006. Bioethanol. Curr Op in Chem Biol 10，141-146. ])。2009 年，美国专利 US2009/0068714A1报道了一种可将纤维素直接转化为乙醇的革兰氏阴性细菌，其可以分解 城市垃圾、甘蔗渣、木屑、纤维素废弃物等多种物质，一步反应后，乙醇转化率能达到理论产 率的90%左右。除此之外，却再没有一种能满足所有CBP工艺要求的天然微生物菌株被 报道。近年来，国内外围绕着能适应CBP工艺要求的菌株的选育，遗传改造等方面进行了 大量研究，主要包括改造纤维素酶产生菌使其能发酵糖高产乙醇、改造乙醇产生菌使其获 得降解纤维素和共发酵多种水解糖的能力两种策略。Clostridium thermocellum([Heap J. T.，Kuehne，S. A.，Ehsaan，M.，Cart man, S. T.，Cooksley，C. M.，Scott, J. C.，Minton， N. P.2010.The ClosTron-Mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal ofMicrobiological Methods 80，49-55. ])、Saccharomyces cerevisiae([van Zyl，W. H.，Lynd，L. R.，den Haan，R.，McBride，J. E. 2007. Consolidatedbioprocessing for bioethanol production using Saccharomyces cerevisiae. AdvBiochem Eng Biotechnol 108，205-235.])、 Candida mycoderma、 Pichiapastoris、 Zymomonas mobilis ([Rogers, P. L，Jeon，Y. J.，Lee, K. J.，Lawford, H. G. 2007. Zymomonas mobilis for fuel ethanol and higher value products. Adv Biochem Eng Biotechnol 108， 263-288. ])、Escherichia col ([Dien，B. S.，Cotta，M. A.，Jeffries，T. W. 2003. bacteria engineerd for fuel ethanolproduction :current status. Applied Microbiology and Biotechnology 63. ])、Klebsiella oxytoca ([Jarboe，L. R.，Shanmugam，K. T.， Ingram，L. 0. 2009.Ethanol. in :Encyclopedia of Microbiology, (Ed. )S. Moselio， Academic Press.Oxford,pp.295-304. ])^Trichoderma reese([Xu,Q.，Singh，A.，Himmel， M. E. 2009. Perspectives and new directions for the production of bioethanol usingconsolidated bioprocessing of lignocellulose. Curr. Opin. Biotechnol.20， 364-371.])等菌都在不同程度上受到了研究。其中，较成功的例子是Shaw等([Shaw， A. J. , Podkaminer, K. K. , Desai, S. G. , Bardsley, J. S. , Rogers, S. R. , Thorne, P. G., Hogsett,D. A. ,Lynd,L. R. 2008. Metabolic engineering of athermophilic bacterium to produce ethanol at high yield. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.])采用基因工程技术敲除了 Thermoanaerobacterium saccharolyticum中的乙酸激酶、磷酸乙酰转移酶和乳酸脱氢酶 基因，调整了代谢流向，极大地减少了乙酸、乳酸等副产物，使菌株的产乙醇能力大大提高。 重组后的菌株共发酵葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖等，可获得37g/L乙醇。这一方法成功 地提高了 Thermoanaerobacterium saccharolyticum的产乙醇能力,但是其仍以糖类为底 物，要利用它转化纤维素为乙醇，仍需要为纤维素的水解糖化投入大量的成本，此种方法并 不能完全解决纤维素乙醇生产成本高的难题。
本发明的目的在于提供一种生产纤维素乙醇的方法，以改善公知技术中存在的缺 陷。为实现上述目的，本发明提供的生产纤维素乙醇的方法，主要包括以下步骤a)将厌氧纤维素降解菌和乙醇厌氧杆菌接种于种子液培养基中，厌氧条件下50-70°C进行活化；种子液培养基为:KH2P040. 5-3g/L，K2HP04 l_4g/L，氮源 l_3g/L，MgCl2 6H20 0. 5-2g/L, CaCl2 2H20 100-200mg/L, FeS04 6H20 0. 5-2mg/L, Cysteine hydrochloride 0. 5_2g/L，刃天青 l_3mg/L，碳源 4_6g/L，Morpholinopropane sulfonic acid 6_15g/L，酵 母浸出物 4-7g/L, Sodiumcitrate 2H20 1. 5-3. 5g/L ；b)将活化后的厌氧纤维素降解菌液接种于碳源为微晶纤维素的种子液培养基中， 将乙醇厌氧杆菌液接种于碳源为葡萄糖的种子液培养基中，培养得到种子液；c)种子液接种于发酵培养基中，厌氧条件下，培养温度50-70°C，培养时压力 为-0. IMPa 0. IMPa，发酵时pH为6. 5-8. 0，发酵至纤维素降解。所述的方法中，氮源为尿素、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、硫酸铵、氯化铵、硝酸 铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵中的一种或任何几种的组合。所述的方法中，碳源为葡萄糖、微晶纤维素、稻草、玉米秸秆、麦秆、莎草、甘蔗渣、 木屑的预处理物中的一种或任何几种的组合。所述的方法中，碳源浓度大于15g/L，碳氮摩尔比为4-6 1。所述的方法中，所用厌氧纤维素降解菌包括热纤梭菌 (Clostridiumthermocellum) > 口誉热角军糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum) > 布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium brockii)、嗜热厌氧解木聚 糖杆菌(Thermoanaerobacterium xylanolyticum)禾口嗜热厌氧解多糖杆菌 (Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum),以及在它们基础上进行的任何突变株；所用产乙醇厌氧杆菌包括嗜热厌氧乙醇杆菌 (Thermoanaerobacterethanolicus) > 15 BW ^ M ft If lif (Thermoanaerobacterium mathranii)、嗜热厌氧糖化杆菌(Thermoanaerobacterium saccharo 1 yticum)禾口意大禾1J嗜 热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter italicus)，以及在它们基础上进行的任何突变株。所述的方法中，厌氧纤维素降解菌和乙醇厌氧杆菌的接种体积比为10 1-1 3。所述的方法中，发酵培养中的菌种接种量体积比为1 10 1 50。所述的方法中，种子液培养基中碳源浓度大于15g/L时，控制pH为6. 8-7. 2。所述的方法中，发酵采用分批发酵、补料-分批发酵、连续发酵或半连续发酵的方 式。所述的方法中，发酵时采用间歇性或低速搅拌。本发明突破了传统的单一菌种发酵，采用本身具有较强纤维素降解能力的高温厌 氧纤维素降解菌和有较强乙醇转化能力的高温产乙醇厌氧杆菌进行混合培养。利用高温 厌氧纤维素降解菌产生的纤维素酶和半纤维素酶降解纤维素、半纤维素得到纤维二塘、纤 维糊精、木糖、木聚二糖等可发酵成分，同时由高温产乙醇厌氧杆菌将还原糖直接转化为乙 醇。高温纤维素降解菌与高温产乙醇厌氧杆菌二者互利共生，相互促进，直接发酵纤维素糖 醇转化率可达理论值的71%。自然界中菌种众多，到底哪种组合最优呢？经过我们探索，以 高温纤维素降解菌与高温产乙醇厌氧杆菌混合发酵的纤维素乙醇生产模式，采用本发明中 列举的高温细菌，是目前为止最优的组合。具体实施例方式以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任 何方式限制本发明。 实施例1 100ml厌氧瓶发酵 1)用1ml注射器各取100^1布氏嗜热厌氧杆菌 (Thermoanaerobacteriumbrockii)胃禾口 g 氏 口誉 & M ft If lif (Thermoanaerobacterium mathranii)的甘油管菌种，接种于装有5ml种子培养基(按配方KH2P04 1. 5g/L，K2HP04 (anhydrous) 2. 9g/L, urea 2. lg/L, MgCl2 6H20 1. Og/L, CaCl2 2H20 150mg/ L, FeS04 6H20 1. 25mg/L, Cysteine hydrochloride 1. Og/L,^ # 2. Omg/L,microcrystalline cellulose 5. Og/L, Morpholinopropane sulfonic acid 10. Og/L, Yeast extract 6. Og/L, Sodium citrate 2H20 3. Og/L, pH 为 7. 6)的厌氧瓶中，60°C恒温 培养，活化菌种。2)将活化好的布氏嗜热厌氧杆菌液3ml和麻氏嗜热厌氧杆菌液1ml分别接种于 30ml种子培养基中，60°C，恒温培养箱中培养24-48小时，得到一级种子液。3)按配方[KH2P04 1. 5g/L, K2HP04 (anhydrous) 2. 9g/L, urea 2. lg/L, MgCl2 6H20 1. Og/L, CaCl2 2H20 150mg/L,FeS04 6H20 1. 25mg/L, Cysteinehydrochloride 1. Og/L,刃2. Omg/L,microcrystalline cellulose 5. Og/L,Morpholinopropane sulfonic acid 10. Og/L, Yeast extract 6. Og/L, Sodiumcitrate 2H20 3. Og/L]配制发酵培养基，调整初 始pH为7. 6。分装培养基100ml于250ml厌氧瓶中，不断通入氮气，并用聚丁酯塞密封，以 保证瓶内厌氧环境。115°C，15min湿热灭菌。其中，钙、镁、铁盐分别配成100X母液于灭菌 后加入。4)测定布氏嗜热厌氧杆菌和麻氏嗜热厌氧杆菌一级种子液的々_，计算总体积 10ml下布氏嗜热厌氧杆菌与麻氏嗜热厌氧杆菌々_比为3 1时的体积。按计算所得的结 果接种布氏嗜热厌氧杆菌和麻氏嗜热厌氧杆菌于100ml发酵培养基中，60°C恒温培养。5)约36h后纤维素被完全降解，停止培养获得发酵液中乙醇浓度为1. 7g/L，糖醇 转化率33. 8%0实施例2 :5L发酵罐发酵1)按照实施例1所述方法制备布氏嗜热厌氧杆菌一级种子液200ml，麻氏嗜热厌 氧杆菌一级种子液100ml，并计算接种量为1 10，发酵液总体积为2L时各自所需体积。2)按配方[KH2P04 1. 5g/L, K2HP04 (anhydrous) 2. 9g/L, urea 17. 8g/L, MgCl2 6H20 1.Og/L, CaCl2 2H20 150mg/L, FeS04 6H20 1. 25mg/L, Cysteinehydrochloride 1. Og/L, 刃天青 2. Omg/L, microcrystalline cellulose 80g/L, Yeast extract 6. Og/L, Sodium citrate 2H20 3. Og/L]配制发酵培养基(钙、镁、铁盐母液灭菌后加入)，115°C，15min湿 热灭菌。3)灭菌结束后，不断向发酵罐中通入氮气，以去除培养基及发酵罐内的氧气。待 培养基由淡蓝色或粉红色(刃天青的颜色)变成无色后，调节培养基PH恒定为7.0，罐温 60°C，同时接入所需体积的#143菌和#146菌一级种子液，停止通气，80rpm搅拌发酵。4)约168h后纤维素被全部消耗，发酵液中乙醇浓度达21. 7g/L，转化率达 36. 17%，为理论值的71%。以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本领域技术人员应该了 解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都 落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

一种生产纤维素乙醇的方法a)将厌氧纤维素降解菌和乙醇厌氧杆菌接种于种子液培养基中，厌氧条件下50-70℃进行活化；b)将活化后的厌氧纤维素降解菌液接种于碳源为微晶纤维素的种子液培养基中，将乙醇厌氧杆菌液接种于碳源为葡萄糖的种子液培养基中，培养得到种子液；c)种子液接种于发酵培养基中，厌氧条件下，培养温度50-70℃，培养时压力为-0.1MPa～0.1MPa，发酵时pH为6.5-8.0，发酵至纤维素降解。本发明所得乙醇转化率为33％--36％。本发明同时进行纤维素降解和乙醇转化，节约能耗，降低了纤维素乙醇的生产成本，有利于推动低碳经济的发展和生物质能源替代化石燃料的进程。