利用转座子介导外源基因导入螺旋藻的方法 [0002] 螺旋藻（Spirulina)在分类学上属于蓝藻门，颤藻纲，螺旋藻属，是一种多细胞、 微型、不分枝、无异形胞的螺旋状体，靠分裂增殖，光合自养生物。其作为一种新的基因转化 载体，具有高安全性、高营养性和高营养价值的特点，并且还有许多独到之处。如：对外源蛋 白质容受力高、繁殖迅速、再生快、培养条件简单等。螺旋藻作为一种具有重要开发应用价 值的原核生物具有巨大的潜力。 [0003] 近年来，理化诱变广泛用于筛选目标菌株，获得优良螺旋藻的传统手段一般都是 自然驯化和不断自然筛选而得，改造其基因结构，获得不同品系的更优良螺旋藻也有不少 研究。Lijianhong等用紫外诱变螺旋藻获得了富含藻蓝蛋白的突变体。Cohen等用除草剂 SAN-9785作为生长抑制剂，从钝顶螺旋藻和紫球藻中筛选获得突变株，其生长速度及糖脂 含量均高于出发株，且钝顶螺旋藻突变株富含Y-亚麻酸。物理诱变因素（Y-射线、紫外 线等）和化学诱变因素（EMS、MNNG等）均能使螺旋藻丝体或细胞发生变异，产生耐低温、耐 盐、富含某种氨基酸或藻蓝蛋白以及藻丝加长、高产的突变体。 [0004] 现有的转基因技术大多只适用于单细胞的蓝藻，对于丝状的螺旋藻尚没有成熟的 遗传转化方法。螺旋藻之所以难以转化，除了研究者们公认的，由于螺旋藻基因组自身的完 美性和复杂性而对外源基因产生强烈的排斥作用外，尚未建立有效的筛选、纯化系统和方 法也是限制其转化效率的重要因素之一。Zeng等、茅云翔等分别报道利用超声波、电击等转 化方法转化了螺旋藻单细胞，获得了具有氯霉素抗性的转化藻株。Kawata等人采用建立基 于Tn5基础上的转座子载体和转座酶进行了钝顶螺旋藻转化体系的研究。徐虹等利用超声 波转化获得了具有G418抗性的转化藻株，并使外源基因成功的表达。张海生等通过自然转 化法将带有GFP报告基因的表达载体导入钝顶螺旋藻Α9细胞中，实现了 GFP在螺旋藻细胞 中的瞬时表达。在上述试验中普遍采用的筛选标记系统是利用抗生素基因作为筛选标记， 但是选择何种抗生素以及抗生素的浓度却众说纷纭，更为重要的是单单采用抗生素标记筛 选出的转基因藻在长时间的培养过程中往往会出现杂交信号不稳定，甚至出现性状退化等 现象。出现这种现象，一方面是由于整合基因丢失，但更为主要的无疑是由于野生藻污染， 转化藻纯度不高所造成的。 [0005] 转座子是生物基因组上的可移动的遗传元件，广泛存在于细菌和各类真核生物 中。转座子的存在和在基因组中的转移可以直接或间接地造成基因重排，在基因组中引起 变异。利用转座子可以寻找和确定生物体基因组的功能，改良作物性状等。Hudson P等利 用Tn4001mod转座子构建突变株，鉴定鸡败血支原体的毒力相关因子。Shimamoto等培育 了含Ds转座元件和含Ac转座元件转座酶（AcTPase)基因的两种水稻株系，通过杂交筛选 得到了大量矮化、花期改变的突变体。转座子标签插入突变改造菌株可以用于筛选目标菌 株，同时也可以利用其自身带有的已知标签序列并结合特定的方法分析转座子标签插入位 点的相邻区域，从而确定突变基因，为研究相关基因功能奠定基础。转座子技术已有应用于 单细胞蓝藻构建突变文库的报道，但在螺旋藻中尚未见报道。

[0006] 本发明的目的旨在提供一种利用转座子介导外源基因导入螺旋藻的方法。
[0007] 本发明的具体步骤如下：
[0008] 1)以NCBI上已知的蓝藻（包括螺旋藻）的序列设计多组引物IS1、IS2、IS3、IS4， 从蓝藻上克隆出最简单的转座子元件即插入序列（IS)，其序列如下：
[0009] 第一组：（模板为聚球藻PCC6803)
[0010] ISl-I:5-ATTGCGGCCGCTTTCGACAACGTTA-3
[0011] Not I
[0012] IS1-2:GATCGATCCCTGGCGGTTCATAGTG
[0013] Cla I
[0014] IS1-3:5-GGAATTCCTAGGCCACTGACT-3
[0015] EcoR I
[0016] 第二组：（模板为铜绿微囊藻PCC7806)
[0017] IS2-1:5-GATCGATTATACAATAGCCATAC-3
[0018] Cla I
[0019] IS2-2:5-TAGCGGCCGCTGGTAGTTGGTTGTG-3
[0020] Not I
[0021] IS2-3:5-ACAGTGAGGAATTCTTAAGAGAACG-3
[0022] EcoR I
[0023] 第三组：（模板为螺旋藻869s)
[0024] IS3-1:5-TAGCAATCGATAGAACACTTAGGAC-3
[0025] Cla I
[0026] IS3-2:5-TAGCGGCCGCACAGAACACTTAGGAC-3
[0027] Not I
[0028] IS3-3:5-TAGGAATTCGTCAAGGTGGTTAG-3
[0029] EcoR I
[0030] 第四组：（模板为螺旋藻869s)
[0031] IS4-1:5-GGCGTTATCGATTTAGGGTATGATT-3
[0032] Cla I
[0033] IS4-2:5-GGCGGCCGCTGATTTAGGGTATGATT-3
[0034] Not I
[0035] IS4-3:5-GGCGTTGCTGAATTCAGGTATGATT-3
[0036] EcoR I
[0037] 其中在IS序列的上游引物分别设置了 Not I和Cla I位点，下游引物设置了 EcoR I酶切位点，以蓝藻（包括螺旋藻，第一组为铜绿微囊藻6803)染色体为模板，分别 以第一条和第三条引物，第二条和第三条引物，利用PCR技术扩增出插入序列，扩增的两种 产物大小都约为LOkb ;随后，将扩增的第一个插入序列片段经EcoR I /Not I双酶切回 收IS序列，并与经EcoR I /Not I双酶切的实验室原有的质粒载体pEGFP-recA-KET4连 接，连接产物转化E. coli DH5a，以氨苄青霉素（Ap)和卡那霉素（Km)筛选克隆子，得重组 质粒pEGFP-IS ;用EcoR I和Cla I双酶切PCR扩增的片段后，电泳回收片段，将重组质粒 pEGFP-IS用EcoR I和Cla I双酶切，回收；然后将两回收片段连接，连接产物转化感受态 E. coli DH5ci，以氨苄青霉素（Ap)和卡那霉素（Km)筛选克隆子，获得包含有两个插入序 列、gfp基因、nptll标记基因和Ap标记基因的螺旋藻整合筛选质粒pEGFP-IS-IS-Km ;
[0038] 2)供体质粒pEGFP-IS-IS-Km的超声转化和筛选：用EcoR I酶切 pEGFP-IS-IS-Km，获得线状质粒，两端各有一个IS序列，与转座子特征结构类似，超声转化 法转化螺旋藻869s，以GFP和G418 (nptll)筛选出插入突变的螺旋藻株。
[0039] 本发明按照设计从蓝藻（包括螺旋藻）染色体DNA上PCR扩增出转座子IS序列， 构建了含两个插入序列、gfp基因、nptll标记基因的供体质粒pEGFP-IS-IS-Km。螺旋藻转 座子外源基因介导整合筛选系统含有螺旋藻基因整合必须的转座子IS序列，本发明提高 了螺旋藻的转基因效率，为转基因螺旋藻优良品种的遗传改造和选育打下了基础。
[0040] 本发明构建了包含gfp基因、nptll标记基因及转座子序列的螺旋藻整合筛选系 统，以利用转座子随机插入突变来影响螺旋藻基因结构进而改变螺旋藻品质。本发明可以 应用于螺旋藻突变文库的构建，还可以进行外源基因的导入和表达，以及螺旋藻内源基因 的反义抑制调控。




[0041] 图1为通过转座子介导系统获得的不同螺旋藻转化株（显示有绿色荧光蛋白表达 的螺旋藻丝状体）。
[0042] 图2为通过转座子介导系统获得的不同螺旋藻转化株（显示形态发生改变的另外 一种螺旋藻转化株）。


[0043] 下面由实施例对本发明作进一步的说明。
[0044] 步骤一螺旋藻转座子介导系统的构建
[0045] I. 1蓝藻转座子序列（IS)的克隆
[0046] 以第一组为例，其他三组步骤与之相同。根据NCBI上提供的蓝藻IS基因序列设计 一组引物 IS1-1、IS1-2、IS1-3,其中在 IS1-1、IS1-2、IS1-3 上分别设置了 Not I、Cla I 和EcoR I位点：
[0047] ISl-I:5-ATTGCGGCCGCTTTCGACAACGTTA-3
[0048] Not I
[0049] IS1-2:GATCGATCCCTGGCGGTTCATAGTG
[0050] Cla I
[0051] IS1-3:5-GGAATTCCTAGGCCACTGACT-3
[0052] EcoR I
[0053] 在0· 5ml无菌离心管中依次加入：ddH20 37 μ 1，IOXTaq酶缓冲液5 μ 1， 4XdNTP(2. 5mmol/L)4y 1，IS1-1 引物 1μ l，ISl-3 引物 1μ 1，模板（铜绿微囊藻 6803 基因 组 DNA) 1 μ 1，Taq 酶 1 μ 1，总体积 50 μ 1。
[0054] PCR反应参数设置：94°C预变性，5min ;
[0055] 然后 94°C变性，45s ;52°C复性，45s ;72°C延伸，Imin ;30 个循环
[0056] 最后 72°C 延伸，8min。
[0057] 反应结束后，取5μ 1进行0. 8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，在电泳图谱上出现唯一 的一条符合预期大小的I. OKb片段，将其连接在T载体上并且测序，测序结果表明这个扩增 片段就是所要的蓝藻转座子序列片段。同理，PCR扩增出含EcoR I和Cla I酶切位点的转 座子片段。
[0058] 1. 2重组质粒pEGFP-IS的构建
[0059] (1)将以ISl-I，IS1-3为引物，PCR扩增后的产物经EcoR I和Not I双 酶切后，用胶回收试剂盒回收IS序列，同时将实验室构建的重组绿色荧光蛋白载体 pEGFP-recA-KET4用Not I和EcoR I双酶切，胶回收较大的DNA载体片段，然后用T4DNA 连接酶将IS序列和载体片段在12°C下进行过夜连接，转化。
[0060] ⑵将100 μ L感受态细胞（CaCl2法制备）加入到装有10 μ L连接产物的离心管 中，混匀，冰浴30min。
[0061] (3) 42°C热激90s，然后冰浴2min，加入400 μ L新鲜LB培养基，置37°C摇床复苏 4〇!1^11，取20(^1^涂平板（含4?10(^8/1111)。37°培养过夜。
[0062] (4)小量提取质粒进行酶切鉴定，获得预期片段。
[0063] 1. 3螺旋藻转座子介导质粒pEGFP-IS-IS-Km的构建
[0064] 用EcoR I和Cla I双酶切pEGFP-IS，电泳回收较大DNA片段，然后将以IS1-2， IS1-3为引物，PCR扩增中获得的IS序列用EcoR I和Cla I双酶切，回收DNA片段，然后将 两回收片段进行连接，连接产物转化E. coli DH5a，在具有氨苄青霉素和卡那霉素的培养 基上筛选出双抗的克隆子，并小量提取质粒进行鉴定，获得包含有两端有插入IS序列、gfp 基因、nptll标记基因的完整的螺旋藻转化子介导整合质粒pEGFP-IS-IS-Km。
[0065] 步骤二转座子介导系统转化螺旋藻及筛选。
[0066] 具体操作如下：
[0067] 在最适条件下培养螺旋藻869s至0D560 = 0. 5?I. 0,4000r/min离心收集藻细 胞，更换新鲜的无 Mg2+的Zarrouk培养基（并加入2mM/L EDTA)静置培养2?3天。取 20mL藻液，4000r/min离心IOmin,收集藻细胞，用新鲜Zarrouk培养基洗一次。再低速离心 并将藻细胞悬浮在原体积1/10的新鲜Zarrouk培养基中。分成4管（每管0. 5mL)。然后 将装有藻液的Eppendorf管置于冰水浴中，进行下列操作：
[0068] 管1 一 2 :将超声波破碎仪的探头插入Eppendorf管中离液面约Icm处，并使之居 中不接触管壁。超声波处理5?6次，输出功率为10W，每次10s，间隔20s，镜检观察藻丝断 裂为3?5个细胞的短藻丝段，立即加入2?3 μ g供体质粒（质粒pEGFP-IS-IS-Km预先 用EcoR I消化成线状片段），再用相同的参数超声处理两次，每次5?8s，间隔20s。
[0069] 管3 - 4 :用相同的参数超声波打断藻体，但不加质粒，作为空白对照。
[0070] 将处理后的管1 一 4置于冰浴Ih后，各转入2mL Zarrouk培养基中，避光孵育过 夜。将孵育后的藻液涂布于覆盖在Zarrouk固体培养基上的Millipore滤膜上（9cm，孔径 0. 45 μ m，Millipore滤膜先用紫外灯灭菌30min)，每个板涂100 μ L，正常生长条件下培养 48h。转移滤膜至含200 μ g/mL Amp和60 μ g/ml G418的Zarrouk固体培养基上，继续培养 10?15天后，未加供体质粒的对照板没有藻落出现，而转化组在含有G418和Amp的抗性平 板上长出绿色藻落，即为转化藻株。
[0071] 本发明依据数据库中已有的转座子IS序列，利用原核蓝藻染色体DNA为模板，用 PCR技术扩增出不同的转座子序列，构建了包含简单转座子IS序列、gfp基因、nptll标记 基因的供体质粒pEGFP-IS-IS-Km，建立了有效的螺旋藻外源基因整合平台和筛选系统，以 利用转座子随机插入突变来影响螺旋藻基因结构进而改变螺旋藻品质。该方法可以应用于 螺旋藻突变文库的构建，还可以进行外源基因的导入和表达，以及螺旋藻内源基因的反义 抑制调控。
[0072] 本发明利用转座子IS序列进行螺旋藻外源基因的整合插入，转座子IS序列包括 上述例子但不仅仅是上述序列，能在螺旋藻中进行转座的序列都包括其中。
[0073] 通过转座子介导系统获得的不同螺旋藻转化株（显示有绿色荧光蛋白表达的螺 旋藻丝状体）参见图1。通过转座子介导系统获得的不同螺旋藻转化株（显示形态发生改 变的另外一种螺旋藻转化株）参见图2。由图1和2可说明，转座子介导的转化系统可以在 螺旋藻转基因中发生非定点突变，可以应用于藻细胞突变库的构建和筛选。
[0074] 本发明构建了有效的螺旋藻转基因的方法。构建了包含gfp基因、nptll标记基 因及转座子序列的螺旋藻整合筛选系统，以利用转座子随机插入突变来影响螺旋藻基因结 构进而改变螺旋藻品质。本发明可以应用于螺旋藻突变文库的构建，还可以进行外源基因 的导入和表达，以及螺旋藻内源基因的反义抑制调控。