专利名称：小肠结肠炎耶尔森氏菌的滚环扩增快速检测引物及试剂盒的制作方法小肠结肠炎耶尔森氏菌是引起急性胃肠炎型食物中毒的病原菌，为人畜共患病。 其潜伏期约摄食后3-7天，病程一般为1-3天，但有些病例持续5-14天或更长。小肠结肠炎耶尔森氏菌感染后的主要症状表现为发热、腹痛、腹泻、呕吐、关节炎、败血症等。本菌的易染人群为婴幼儿，常引起发热、腹痛和带血的腹泻。而且小肠结肠炎耶尔森氏菌分布很广， 可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙拉、牡蛎、蛤蜊和虾中。也存在于野生环境中，如湖泊、河流、土壤和植被。因此，有效的检测出小肠结肠炎耶尔森氏菌对于食品安全是非常重要的。目前小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、荧光定量PCR检测法等。但上述的方法或是存在耗时过长、或是应用仪器昂贵，难以在实际中推展。因此，需要开发出另一种能够有效的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法及其相应的引物，以及包含该引物的试剂盒。
本发明的目的是提供一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的滚环扩增快速检测引物及试剂盒，以克服现有技术的不足。本发明的主要原理如下(1)设计一条两端能够与目标序列特异性结合的锁式探针，与目标序列结合时可以形成一个闭合环状。(2)设计两条引物，一条(引物)(CR)可以与锁式探针形成的环特异性结合，另一条 (引物XCF)可以与以锁式探针为模板所扩增的片段相结合。(3)将探针和目标菌的模板DNA加入到模板预处理反应液，在DNA连接酶作用下， 通过几个预变性和连接的循环过程，锁式探针与目标菌DNA特异性结合，并形成环状。(4)核酸外切酶I及其缓冲液加入连接后的混合液中，降解未形成环状的锁式探针。(5)在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，引物Pl扩增环状锁式探针，在延伸至探针与靶序列结合处时把靶序列置换下来进入滚环指数扩增；(6)待置换出环形DNA模板的互补单链(第一次线性RCA产物)后，引物P2与其结合并进行酶促延伸反应。随着线性RCA的进行，由与环状DNA完全互补的重复序列组成的线性单链不断延长，同时更多的引物P2结合上去进行延伸合成，后结合的引物P2的延伸置换先结合的引物P2的延伸产物，被置换下的P2延伸产物再与Pl结合，进行Pl延伸合成；(7)最终扩增出的产物为以环形探针为单位的不同长度的双链DNA(8)扩增产物利用电泳方法检测。本发明的一个方面涉及用于恒温扩增快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物及探针，其中与探针特异性结合的引物序列O(CR)为SEQ ID NO 1 XCR 5-CAATAGGTCCAGAATGTCAG-3 ；与探针为模板所扩增的片段相结合的引物序列(XCF)为SEQ ID NO 2 XCF 5-GGAAAGCAAATGTCGCACCT-3 ；探针序列为SEQ ID NO 3 (XCPLP)5-GGACCATCAGGTGCGACATTTGCTTTCCCAATAGGTCCAGAATGTCAGCCGTTCCTCACACCAGACT GCCATTCATCCGCTTATTATCACCGTTTGTCCTAATCTATG-3,探针的5 ’端进行磷酸化修饰。本发明的另一个方面涉及一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下的组分(1)探针结合反应液其中包括IOXTaq DNA连接酶缓冲液，200pmol · Γ1锁式探针，40U · μ L-1TaqDNA 连接酶；所述的IOXiTaq DNA连接酶缓冲液成分为20mmol/L Tris-HCl，25mmol/L乙酸钾，10mmol/L 乙酸镁，lmmol/L NAD, 10mmol/L Dithiothreitol ( 二巯基苏糖醇)，0· 1 % Triton X-IOOpH 7.6。(2)外切处理反应液包括 10XExonuclease I 缓冲液,5U· μ L_1Exonuclease I。所述的 10XExonuclease I 缓冲液成分为67mmol/L Glycine-KOH,6. 7mmol/ LMgCl2,10mmol/L 2-巯基乙醇，pH 9.5。(3) RCA恒温扩增反应液包括IOXBst DNA聚合酶缓冲液，10 μ mol · Γ1引物序列XCF，10 μ mol · Γ1引物序列 XCR, IOmmol · L_1dNTPs,8U · μ L-1Bst DNA 聚合酶。所述的IOXBst DNA聚合酶缓冲液成分为20mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L(NH4)2SO4,10mmol/L KCl,2mmol/L MgSO4,0. 1 % Triton X-100，pH 8. 8。上述试剂盒应用于检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌，其使用方法，依次包括下列步骤(1)-(5)(1)待检样品或细菌DNA模板的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1. 6 2. 0范围内，浓度在 IOng/ μ L IOOng/ μ L 范围内；(2)探针结合反应将装有8yL探针结合反应管中加入2yL待检模板DNA，94°C 4min ；94°C 30s, 60°C 5min, 15个循环；95°C变性15min，并快速置于冰上冰浴5min ；(3)外切处理反应在装有10 μ L外切处理反应液的反应管中加入10 μ L步骤(2)所得的产物，37°C温浴2. ^i，80°C 15min。反应结束后取出；(4) RCA恒温扩增反应在装有21 μ L RCA恒温扩增反应液的反应管中加入4 μ L步骤(3)所得的产物， 60°C反应60min，反应结束后取出；(5)反应结果的检测使用凝胶电泳的方法检测反应产物，取5μ L产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳的结果判断检测物是否为阳性。本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计锁式探针，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的滚环扩增(RCA)技术，该技术特异性强，具有比PCR检测方法更高的灵敏度，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。将装有8yL探针结合反应管中加入2yL待检模板DNA，94°C 4min ；94°C 30s, 60°C 5min, 15个循环；95°C变性15min，并快速置于冰上冰浴5min ；(3)外切处理反应在装有10 μ L外切处理反应液的反应管中加入10 μ L步骤(2)所得的产物，37°C 温浴2. ^i，80°C 15min。反应结束后取出；(4) RCA恒温扩增反应在装有21 μ L RCA恒温扩增反应液的反应管中加入4 μ L步骤(3)所得的产物， 60°C反应60min，反应结束后取出；(5)反应结果的检测取5μ L产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果显示条带由小到大的大小是 108,216,324以增加IOSbp的速度递增，测序结果也表明所扩增的片段是目的片段，说明待检样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌。这也表明本发明所涉及的引物和探针在对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测的时候不会产生假阴性的结果。实施例2 大肠埃希氏菌(ATCC 15922)标准菌株的检测1)探针结合反应液每8μ L含有IOXTaq DNA连接酶缓冲液1 μ L，200pmol · Γ1锁式探针0. 2 μ L， 40U · μ T1Taq DNA 连接酶 0. 1 μ L,无菌双蒸水 6. 7 μ L。其中所述的锁式探针为SEQ ID NO 3 5-GGACCATCAGGTGCGACATTTGCTTTCCCAATAGGTCCAGAATGTCAGCCGTTCCTCACACCAGACT GCCATTCATCCGCTTATTATCACCGTTTGTCCTAATCTATG-3, 5 ‘端磷酸化修饰；2)外切处理反应液每 10 μ L 含有 10 X Exonuclease I 缓冲液 2 μ L，5U · μ L-1Exonuclease I 3 μ L, 无菌双蒸水5 μ L。3) RCA恒温扩增反应液每21μ L含有 IOXBst DNA聚合酶缓冲液2. 5 μ L，10 μ mol .171 引物)(CF 1. 25 μ L, 10 μ mol · L-1 弓 I 物 XCR 1. 25 μ L, IOmmol · L_1dNTPs 0· 6 μ L，8U · μ L-1Bst DNA 聚合酶 0. 4 μ L，无菌双蒸水15 μ L。其中所述的引物SEQ ID NO 1 =XCR 5-CAATAGGTCCAGAATGTC AG-3。其中所述的引物SEQ ID NO 2 =XCF 5-GGAAAGCAAATGTCGCAC CT-3 ；4) 2 %琼脂糖凝胶电泳；按照以下(1)- )程序进行检测(1)大肠埃希氏菌DNA的提取将大肠埃希氏菌(ATCC 15922)增菌培养后，提取待检样品核酸，其中提取的样品 DNA OD260/OD280 在 1.6 2. 0 范围内，浓度在 IOng/ μ L IOOng/ μ L 范围内。(2)探针结合反应将装有8yL探针结合反应管中加入2yL待检模板DNA，94°C 4min ；94°C 30s, 60°C 5min, 15个循环；95°C变性15min，并快速置于冰上冰浴5min ；(3)外切处理反应在装有10 μ L外切处理反应液的反应管中加入10 μ L步骤(2)所得的产物，37°C温浴2. ^i，80°C 15min。反应结束后取出；(4) RCA恒温扩增反应在装有21 μ L RCA恒温扩增反应液的反应管中加入4 μ L步骤(3)所得的产物， 60°C反应60min，反应结束后取出；(5)反应结果的检测取5μ L产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果显示无条带出现，说明待检样品不是小肠结肠炎耶尔森氏菌。这个结果也证实了本发明的引物和检测试剂盒在应用的时候不会产生假阳性。实施例3 对疑似感染小肠结肠炎耶尔森氏菌食品样品的检测将食品样品按照实施例1描述的方法进行DNA的提取和扩增检测，电泳结果显示条带由小到大的大小是108、216、324以增加IOSbp的速度递增，说明待检样品受到了小肠结肠炎耶尔森氏菌的感染。本发明的引物、探针和试剂盒还可以对其它的样品进行小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测。
本发明涉及一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的滚环扩增快速检测引物及试剂盒，其中与探针特异性结合的引物序列为SEQ ID NO1；与以探针为模板所扩增的片段相结合的引物序列为SEQ ID NO2；探针的序列为SEQ ID NO3。本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计锁式探针，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的滚环扩增(RCA)技术，该技术特异性强，具有比PCR检测方法更高的灵敏度，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。