专利名称：扩增的核酸及其固定化制品的制作方法 已经开发了将核酸固定于其上的基质(例如DNA芯片)，作为用于快速促进基因功能分析计划的工具。它已经广泛地用于分析所有酵母基因以及培养细胞和组织中的基因的表达。用于制备DNA芯片(或DNA阵列)的已知方法包括例如其中在芯片固相上的预定区内合成单链DNA的方法、以及其中将预先制备的单链或双链DNA点样在芯片固相上的预定区内的方法。依照前一方法制备的DNA芯片的实例为美国专利第5,445,934、5,744,305和5,700,637号中描述的高密度寡核苷酸阵列。依照后一方面制备的DNA芯片的实例为美国专利5,807,522号和WO 98/18961中描述的点样阵列。可以采用这种方法，通过将DNA点样在芯片固相上的预定区内，制备DNA芯片。例如，用针尖将DNA片段物理点样在固相基质上，例如在已经经过特殊处理，例如多聚L-赖氨酸包被或硅烷化的玻片上。在这种情况下，所述DNA片段静电结合到所述固相基质上。因此，结合效率可能随包被到固相基质上的条件而改变。另一方面，制备上述高密度寡核苷酸阵列，需要高密度固相合成用的大规模装置。此外，由于其合成产量，依照该方法难以合成长的核苷酸链。在这两种制备方法中，必需大量合成待固定化的核酸。除短链DNA例如寡核苷酸的合成之外的大多数核酸扩增方法，用DNA聚合酶通过酶促方法来进行。所述方法的一个例子是美国专利第4,683,195、4,683,202和4,800,159号中详述的聚合酶链式反应(PCR)法。另一个例子是Trends in Biotechnology，10146-152(1992)中描述的逆转录-PCR(RT-PCR)法，它是PCR和逆转录酶反应的组合。上述方法的开发，使得能够从DNA或RNA扩增感兴趣的区。上述DNA合成法例如用由三个步骤组成的反应来进行。这三个步骤是使双链DNA解链(变性)为单链DNA的步骤、使引物退火至单链DNA上的步骤和从所述引物合成(延伸)互补链以便扩增感兴趣的DNA区的步骤。或者，它们用名为“穿梭PCR”的反应(Recent advancesin PCR methodology)Tanpakushitsu Kakusan Kouso，Bessatsu，(Protein，Nucleic Acid and Enzyme，Supplement)，41(5)425-428(1996))来进行，其中所述三个步骤的两个步骤，即引物退火步骤和延伸步骤在同一温度下进行。另一方面，可以使用1989年6月14日公开的EP 320,308中描述的连接酶链式反应(LCR)法、或者在PCR Protocols，Academic Press，Inc.，1990，pp.245-252中描述的基于转录的扩增系统(TAS)法。上述四种方法需要在高温和低温下重复反应数次，以便再生用于下一扩增循环的单链靶分子。所述反应系统应该采用不连续相或循环进行，因为如上所述，该反应受温度限制。因此，所述方法需要使用可以在规定时间内精确调节宽范围温度的昂贵的热循环仪。此外，所述反应需要时间以将温度调至两个或三个预定温度。时间的损失与循环数成比例增加。已经开发了可以等温进行的核酸扩增法，以解决所述问题。其实例包括在日本专利2,076,096和2,087,487号中描述的链置换扩增(SDA)法、自身支持性序列扩增(3SR)法、日本专利2,650,159号中描述的基于核酸序列的扩增(NASBA)法、转录介导的扩增(TMA)法、日本专利2,710,159号中描述的Qβ复制酶法和美国专利第5,824,517号、WO99/09211、WO 95/25180和WO 99/49081中描述的各种改进SDA法。寡核苷酸的等温酶促合成法描述于美国专利第5,916,777号中。在这些等温核酸扩增或寡核苷酸合成方法的反应中，从引物延伸和/或引物退火至单链延伸产物(或退火至原始靶序列上)、然后从引物延伸，在恒定温度下保温的反应混合物中平行进行。在等温核酸扩增法中，SDA法是最终扩增DNA的系统的例子。SDA法是用于通过用DNA聚合酶和限制性内切核酸酶置换双链而扩增样品中靶核酸序列(及其互补链)的方法。所述方法需要四种扩增用引物，其中两种应该设计为含有限制性内切核酸酶的识别位点。所述方法需要用经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸作为大量合成DNA的底物。所述经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的实例是(α-S)脱氧核糖核苷酸三磷酸，其中α位磷酸基团的氧原子被硫原子(S)所取代。如果该反应常规进行例如用于遗传检验，与使用所述经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸相关的操作费用的问题则变得严重。此外，在所述方法中，所述经修饰核苷酸例如(α-S)脱氧核糖核苷酸掺入到扩增的DNA片段中，当进行限制性酶片段长度多态(RFLP)分析时，可能消除了限制性酶对DNA扩增片段的可切割性。美国专利第5,824,517号中描述的改良SDA法，是一种使用由RNA和DNA组成并且其基本结构为DNA至少位于3’末端的嵌合引物的DNA扩增法。WO 99/09211中描述的改良SDA法需要使用产生3’突出端的限制性酶。WO 95/25180中描述的改良SDA法需要使用至少两对引物。WO 99/49081中描述的改良SDA法需要使用至少两对引物和至少一种经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。另一方面，在美国专利第5,916,777号中描述的寡核苷酸合成方法包括用在3’末端具有核糖核苷酸的引物合成DNA，用所述引物完成反应，用内切核酸酶在引物延伸的链中所述引物和延伸链之间引入切口以便将其分开，消化模板，并且回收引物以便再使用。在所述方法中，需要从反应系统中分离引物，然后让其再次退火至模板上，以便再利用所述引物。另外，WO 00/28082中描述的LAMP法需要四种扩增引物，并且用该方法扩增的产物是大小变化的DNA，其中扩增的靶区被重复。如上所述，依照常规核酸扩增法，难以大量生产和供应供具有固定化核酸的基质用的核酸。可以采用WO 00/56877中描述的ICAN法，来大量生产核酸以及低成本地生产具有固定化核酸的材料。然而，所述方法有如下问题。在依照该方法扩增的片段中，可以含有核糖核苷酸。如果将所述扩增片段固定到固相上，则所述固定化核酸在某些后处理时可能被降解和释放。
发明目的本发明的主要目的是制备核酸，所述核酸利用嵌合寡核苷酸引物通过核酸扩增反应来大量供应，使得所述核酸含有脱氧核糖核苷酸，所述脱氧核糖核苷酸经修饰以便固定到固相上和通过将所述核酸高效地固定到固相上而获得具有高质量固定化核酸的材料。
发明概述由于深入的研究，本发明人构建了一种利用等温嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)法生产用于制备具有固定化核酸的材料的核酸的方法。所述ICAN法是一种核酸扩增法，其中在其中核糖核苷酸位于3’末端或3’端一侧的嵌合寡核苷酸引物、内切核糖核酸酶和DNA聚合酶存在下，扩增DNA中的目标区。
此外，本发明人通过用引物或经修饰以供将扩增核酸固定到固相上的脱氧核糖核苷酸三磷酸进行所述ICAN法，可以获得含有经修饰的脱氧核糖核苷酸的ICAN反应产物。本发明人已经构建了一种通过将如此获得的含有经修饰的脱氧核糖核苷酸的ICAN反应产物固定到固相上，生产具有固定化核酸的材料的方法。因而完成了本发明。
本发明的第一个方面涉及一种含有经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的扩增核酸，所述扩增核酸通过包括下述步骤的核酸扩增法获得(a)通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合，制备反应混合物，其中所述引物是一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补并且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物的3’末端或者位于3’端一侧，其中所述脱氧核糖核苷酸三磷酸的一部分是经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸三磷酸和/或所述脱氧核糖核苷酸的一部分是经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸；和(b)将反应混合物保温足够的时间，以产生反应产物。
依照第一个方面，所述经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸可以是具有能够与固相上的官能团共价结合的官能团的经修饰的脱氧核糖核苷酸。所述反应混合物还可以含有一种嵌合寡核苷酸引物，所述嵌合寡核苷酸引物具有与作为模板的核酸的核苷酸序列基本同源的序列。用于第一个方面所述核酸扩增法可以包括(a)通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合，制备反应混合物，其中所述引物是一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补并且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物的3’末端或者位于3’端一侧，其中所述脱氧核糖核苷酸的一部分是经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸；和(b)将反应混合物保温足够的时间，以产生反应产物。
或者，用于第一个方面的核酸扩增法可以包括(a)通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合，制备反应混合物，其中所述引物是一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补并且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物的3’末端或者位于3’端一侧，其中所述脱氧核糖核苷酸三磷酸的一部分是经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸三磷酸；和(b)将反应混合物保温足够的时间，以产生反应产物。
含有或不含核糖核苷酸的扩增核酸可以优选依照第一个方面制备。
虽然并不打算限制本发明，但是在第一个方面使用的RNA酶H可以选自例如得自大肠杆菌(Escherichia coli)的RNA酶H、得自栖热袍菌属(Thermotoga)细菌的RNA酶H、得自栖热菌属(Thermus)细菌的RNA酶H、得自热球菌属(Pyrococcus)细菌的RNA酶H、得自芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的RNA酶H。其中，可以优选使用得自大肠杆菌的I型RNA酶H或得自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)或Pyrococcushorikoshii的II型RNA酶H。
本发明的第二个方面涉及具有固定化扩增核酸的材料，其中将依照第一个方面获得的扩增核酸在固相上的预定区中固定化和排布。在所述具有固定化扩增核酸的材料中，所述扩增核酸可以通过共价键固定在固相上的预定区中。
第二个方面的具有固定化扩增核酸的材料，可以是通过下述步骤获得的所述材料将第一个方面的扩增核酸在固相上的预定区中固定化和排布，其中所述第一个方面的扩增核酸运用一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补并且含有经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物、以及一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本同源但不含经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物；然后仅释放从所述嵌合寡核苷酸引物延伸的不含经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的链而获得。
第二个方面的具有固定化扩增核酸的材料，可以是通过下述步骤获得的所述材料将第一个方面的扩增核酸在固相上的预定区中通过共价键固定化和排布，其中所述第一个方面的扩增核酸运用一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补并且含有经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物、以及一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本同源但不含经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物；然后仅释放从所述嵌合寡核苷酸引物延伸的不含经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的链而获得。
本发明的第三个方面涉及一种由以下通式表示的嵌合寡核苷酸引物通式5’-dNa-Nb-dNc-3’(a11或11以上的整数；b1或1以上的整数；c0或者1或1以上的整数；dN脱氧核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸类似物，其中dN中的至少一个为经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸；N未经修饰的核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的某些dN可以被N取代)。
依照第三个方面，所述通式中的c可以是0，所述脱氧核糖核苷酸类似物可以是脱氧核糖肌苷核苷酸，而所述经修饰的核糖核苷酸可以是(α-S)核糖核苷酸。
本发明的第四个方面涉及第一个方面的扩增核酸的生产方法。
本发明的第五个方面涉及第二个方面的具有固定化扩增核酸的材料的生产方法。
发明详述此中所用的脱氧核糖核苷酸(也称为dN)是指其糖部分由D-2-脱氧核糖组成的核苷酸。所述脱氧核糖核苷酸包括例如具有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶作为碱基部分的脱氧核糖核苷酸。此外，所述脱氧核糖核苷酸也包括具有经修饰碱基如7-脱氮鸟苷的脱氧核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸类似物如脱氧肌苷核苷酸。
此中所用的经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸，是指具有适用于固定到固相上的额外修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸类似物。其实例包括通过加入官能团如氨基、醛基或酰基或者通过加入生物素而修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸类似物。所述脱氧核糖核苷酸包括这样的经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸。
此中所用的核糖核苷酸(也称为N)是指其糖部分由D-核糖组成的核苷酸。所述核糖核苷酸包括具有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶作为碱基部分的核糖核苷酸。所述核糖核苷酸也包括经修饰的核糖核苷酸如其中α位磷酸基团的氧原子被硫原子取代的经修饰的核糖核苷酸(也称为(α-S)核糖核苷酸或(α-S)N)或其它衍生物。
此中所用的嵌合寡核苷酸引物是指含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的引物。所述引物可以含有脱氧核糖核苷酸类似物和/或经修饰的脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸。
本发明中所使用的嵌合寡核苷酸引物包括具有位于引物的3’末端或3’端一侧的核糖核苷酸的任何嵌合寡核苷酸引物，所述嵌合寡核苷酸引物可以在本发明的方法中用来延伸核酸链，可以用内切核酸酶切割，并且可以用来实现链置换反应。
此中所用的3’端一侧是指从诸如引物的核酸中心至3’末端的部分。同样，5’端一侧是指从核酸中心至5’末端的部分。
此中所用的内切核酸酶可以是作用于通过从已退火到作为模板的核酸上的所述嵌合寡核苷酸引物延伸DNA所产生的双链DNA、并且在所述引物中含有核糖核苷酸的部分特异性切割所述核酸的任何内切核酸酶。
此中所用的DNA聚合酶是指用DNA链作为模板从头合成DNA链的酶。所述DNA聚合酶包括天然存在的DNA聚合酶和具有上述活性的变异型酶。例如，这样的酶包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶和具有逆转录酶活性或内切核酸酶活性的DNA聚合酶。
在下文将详细描述本发明。
(1)本发明中所用的嵌合寡核苷酸引物本发明方法中所用的引物是一种含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物。这样的引物也包括含有未经修饰的脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的脱氧核糖核苷酸和未经修饰的核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸的寡核糖核苷酸引物。此外，所述引物可以含有脱氧核糖核苷酸类似物。
本发明方法中所用的嵌合寡核苷酸引物是一种具有与作为模板的核酸的核苷酸序列的一部分基本互补的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。它可以从3’端延伸DNA链。此外，核糖核苷酸位于所述嵌合寡核苷酸引物的3’末端或3’端一侧。所述引物的设计通常使得它与待扩增区上游的部分即对应于作为模板的核酸中待扩增区的核苷酸序列3’的部分互补。此中所用的“基本互补的核苷酸序列”是指可以在所用的反应条件下退火到作为模板的核酸(DNA)上的核苷酸序列。
“基本同源的核苷酸序列”是指与作为模板的核酸(DNA)如此同源，以致于它可以在所用的反应条件下退火到作为模板的核酸(DNA)的互补链上的核苷酸序列。
本发明方法中所用的嵌合寡核苷酸引物可以含有一种或多种经修饰的核糖核苷酸。此中所用的核糖核苷酸可以是未经修饰的核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸，所述核糖核苷酸可以位于嵌合寡核苷酸引物的3’末端或3’端一侧并且被内切核酸酶所识别或切割。所述核糖核苷酸包括上述的未经修饰的核糖核苷酸和经修饰的核糖核苷酸。对于本发明的嵌合寡核苷酸引物，可以使用未经修饰的核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸或其组合，只要它不消除所述引物的功能。所述经修饰的核糖核苷酸的实例包括但不限于与磷酸基团连接的氧原子被硫原子取代的(α-S)核糖核苷酸、和核糖2位的羟基被甲氧基取代的核糖核苷酸。含有经修饰的核糖核苷酸的这样一种嵌合寡核苷酸引物，可以用例如(α-S)核糖核苷酸三磷酸来产生，所述(α-S)核糖核苷酸三磷酸例如用使用美国专利第5,003,097号中所述的硫化反应试剂(GlenResearch)或者2-OMe-RNA-CE亚磷酰胺试剂(Glen Research)的方法制备。
本发明方法中所用的嵌合寡核苷酸引物的长度并无具体限制，但优选为约12个核苷酸至约100个核苷酸，更优选约15个核苷酸至约40个核苷酸。优选所述嵌合寡核苷酸的核苷酸序列与作为模板的核酸基本互补，使得它在所用的反应条件下退火至所述作为模板的核酸上。所述引物在3’末端或3’端一侧含有在以下所述的步骤中使用的内切核酸酶所识别的序列。
本发明方法中所用的嵌合寡核苷酸引物具有这样一种结构其中内切核酸酶识别或切割在含有位于所述嵌合寡核苷酸引物3’末端或3’端一侧的核糖核苷酸的位点上从用DNA聚合酶从所述引物延伸的DNA链(引物延伸链)。虽然并不打算限制本发明，但是例如当RNA酶H作用于从已经退火到作为模板的核酸上的、由所述通式所示的嵌合寡核苷酸引物延伸DNA而产生的双链DNA时，所述嵌合寡核苷酸引物在所述核糖核苷酸部分被切割。则产生在所述寡核苷酸引物和经延伸合成的DNA链之间引入了切口的双链DNA。然后，DNA聚合酶的链置换反应从所述有切口的位点开始进行。因此，可以用来从所述引物的3’端延伸核酸链、可以被内切核酸酶切割并且DNA聚合酶可以用其实现链置换反应的任何嵌合寡核苷酸引物，都可以用于本发明的方法中。
此外，本发明方法中所用的嵌合寡核苷酸引物可以含有一个或多个位于所述核糖核苷酸位置5’的经修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸类似物。也就是说，在本发明的嵌合寡核苷酸引物中可以包含经修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸类似物，只要所述引物的功能不被消除。可以组合使用多种类型的所述经修饰的脱氧核糖核苷酸或所述脱氧核糖核苷酸类似物。所述经修饰的脱氧核糖核苷酸的实例包括但不限于具有掺入的氨基的经修饰的脱氧核糖核苷酸。所述脱氧核糖核苷酸类似物的实例包括但不限于脱氧肌苷核苷酸和具有经修饰碱基如7-脱氮鸟嘌呤的脱氧核糖核苷酸类似物。
例如，作为引物，优选用以下通式所示的嵌合寡核苷酸引物作为本发明的嵌合寡核苷酸引物，虽然并不打算限制本发明通式5’-dNa-Nb-dNc-3’
(a11或11以上的整数；b1或1以上的整数；c0或者1或1以上的整数；dN脱氧核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸类似物，其中dN中的至少一个为经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸；N未经修饰的核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的某些dN可以被N取代)。
虽然并不打算限制本发明，但是例如如果b为1或1以上的整数，且c为1或1以上的整数，则所述嵌合寡核苷酸引物为5’-DNA-RNA-DNA-3’的形式。
在所述嵌合寡核苷酸引物中，所述通式中的c可以是0，所述脱氧核糖核苷酸类似物可以是脱氧核糖肌苷核苷酸，而所述经修饰的核糖核苷酸可以是(α-S)核糖核苷酸。
dNa部分和/或dNc部分中具有官能团(例如氨基、醛基或酰基)或加入的生物素的核苷酸，可以优选用来加入用于固定到基质的官能团或生物素。虽然并不打算限制本发明，但是可以优选使用在5’一侧的dNa部分中任一个核苷酸中加入氨基的嵌合寡核苷酸引物、在3’一侧的dNc部分中任一个核苷酸中加入氨基的嵌合寡核苷酸引物、和在5’一侧的dNa部分中任一个核苷酸中和在3’一侧的dNc部分中任一个核苷酸中加入氨基的嵌合寡核苷酸引物。
可以用例如Applied Biosystems Inc.(ABI)的394型DNA合成仪，依照亚磷酰胺方法合成具有所需核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。或者，可以使用任何方法，包括磷酸三酯法、H-膦酸酯法和硫代膦酸酯法，合成所述嵌合寡核苷酸引物。
(2)本发明中所用的内切核酸酶在本发明中可以使用任何可以作用于通过从以上(1)中所述的已经退火到作为模板的核酸上的嵌合寡核苷酸引物延伸DNA而产生的双链DNA、并且切割所述延伸链以实现链置换反应的内切核酸酶。也就是说，所述内切核酸酶是可以在所述双链DNA的所述嵌合寡核苷酸引物部分中产生切口的酶。例如，可以使用核糖核酸酶。其中，可以优选使用作用于由DNA和RNA组成的双链核酸的RNA部分的内切核糖核酸酶H(RNA酶H)。在本发明中，可以优选使用具有上述活性的任何核糖核酸酶，包括嗜常温酶和耐热性酶。例如，可以优选使用得自大肠杆菌的RNA酶H、得自栖热袍菌属细菌、栖热菌属(Thermus)细菌、热球菌属(Pyrococcus)细菌或芽孢杆菌属细菌的耐热性核糖核酸酶例如RNA酶H。在本发明的方法中，可以使用I、II或III型RNA酶H。
虽然并不打算限制本发明，但是作为得自热球菌属细菌的示例性RNA酶H的激烈热球菌或Pyrococcus horikoshii的II型RNA酶H，甚至在RNA数目为1时，也在RNA-DNA接点的RNA 5’的一个位点特异性地切割嵌合双链核酸。通过使以上(1)中所述的嵌合寡核苷酸引物退火到基本互补的核酸上并且延伸，获得所述嵌合双链核酸。在以上(1)中所述的嵌合寡核苷酸引物中所含有的RNA，在ICAN反应中从3’末端被逐个切下，最终获得不含RNA的ICAN产物。所述扩增产物可以优选用作可供具有本发明固定化核酸的材料用的固定化用核酸。
(3)本发明中所用的DNA聚合酶在本发明中可以使用对DNA具有链置换活性的DNA聚合酶。特别是，可以优选使用基本上无5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
此中所用的“链置换活性”是指可以实现链置换的活性，也就是说可以基于作为模板的核酸的序列继续进行DNA复制、同时置换所述DNA链从而释放已经退火到模板链上的互补链。
在本发明中可以使用具有所述链置换活性的任何DNA聚合酶。其实例包括得自芽孢杆菌属嗜热菌如热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)(下文称为B.ca)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)(下文称为B.st)的缺乏其5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的变异体、以及得自大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)。嗜常温和耐热性DNA聚合酶都可以优选用于本发明。
B.ca是一种最适生长温度约70℃的嗜热菌。已知得自这种细菌的Bca DNA聚合酶具有依赖DNA的DNA聚合酶活性、依赖RNA的DNA聚合酶活性(逆转录活性)、5’→3’外切核酸酶活性和3’→5’外切核酸酶活性。所述酶可以或者是从其原始来源纯化的酶、或者是用基因工程技术产生的重组蛋白。所述酶可以经过修饰，例如通过使用基因工程技术或其它方法取代、缺失、添加或插入。这类酶的实例包括BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)，它是缺乏其5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶。
已知某些DNA聚合酶在特定条件下具有内切核酸酶活性，如RNA酶H活性。这样的DNA聚合酶可以用于本发明的方法中。一方面，可以在允许RNA酶H活性表达的条件下，例如在Mn2+存在下，使用所述DNA聚合酶。在这种情况下，可以无需加入RNA酶H，而进行本发明的方法。本发明人首次证明，Bca DNA聚合酶在含Mn2+的缓冲液中表现出RNA酶H活性，并且在不含BcaDNA聚合酶以外的酶的反应混合物中，可以进行本发明的核酸扩增法。上述方面并不限于使用Bca DNA聚合酶。已知具有RNA酶H活性的DNA聚合酶，例如得自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的Tth DNA聚合酶，可以用于本发明中。
(4)本发明中所用的脱氧核糖核苷酸三磷酸依照本发明，用于PCR法等的dNTPs(dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)，可以优选用作用作延伸反应底物的脱氧核糖核苷酸三磷酸。dNTPs可以含有dNTP类似物，例如7-脱氮-dGTP，只要它可用作所用的DNA聚合酶的底物。此外，可以含有经修饰以便将通过ICAN反应而获得的ICAN产物固定到固相上的脱氧核苷酸三磷酸，只要它可用作所用的DNA聚合酶的底物。其实例包括氨基烯丙基dUTP和生物素标记的脱氧核苷酸(都得自Sigma)。
(5)本发明的核酸扩增方法本发明的核酸扩增方法可以通过联合使用至少一种以上(1)中所述的寡核苷酸引物与以上(2)中所述的内切核酸酶、以上(3)中所述的DNA聚合酶和以上(4)中所述的脱氧核糖核苷酸三磷酸进行反应来完成。
在依照所述ICAN方法的反应中所使用的引物约100％被利用。靶扩增区的量可以数倍于常规扩增反应如PCR中所用的量。此外，本发明的方法并不需要可以在规定时间内调节温度的反应装置。因此，可以在大体积的反应混合物中进行扩增反应。
在本发明方法中用作模板的核酸(DNA或RNA)，可以从可能含有所述核酸的任何样品中制备或分离。另一方面，所述样品可以直接用于依照本发明的核酸扩增反应中。可能含有所述核酸的样品的实例包括但不限于得自生物体的样品，如全血、血清、血沉棕黄层、尿液、粪、脑脊髓液、精液、唾液、组织(例如癌组织或淋巴结)和细胞培养物(例如哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物)；含有核酸的样品，例如类病毒、病毒、细菌、真菌、酵母、植物和动物；怀疑污染或感染微生物如病毒或细菌的样品(例如食品或生物制剂)；和可能含有生物体的样品如土壤和废水。所述样品可以是含有通过依照已知方法加工上述样品而获得的核酸的制备物。可以用于本发明的制备物的实例包括细胞破碎产物或通过分级分离所述产物而获得的样品、所述样品中的核酸、或者其中富集了特定核酸分子如mRNA的样品。此外，可以优选使用通过用已知方法扩增所述样品中所含核酸而获得的核酸，如DNA或RNA。
通过运用例如用去垢剂、超声处理、振荡/用玻璃珠搅拌或弗氏压碎器来裂解，可以从上述材料中制备含核酸的制备物，但并不限于此。在某些情况下，最好进一步加工所述制备物，以纯化核酸(例如在存在内源核酸酶的情况下)。在这种情况下，采用已知方法，例如酚抽提、层析、离子交换、凝胶电泳或密度梯度离心，来纯化核酸。
如果需要扩增具有来源于RNA的序列的核酸时，则可以用通过用RNA作为模板的逆转录反应所合成的cDNA作为模板，进行本发明的所述方法。可以制备待用于逆转录反应的引物的任何RNA，都可以应用于本发明的方法，包括样品中的总RNA、RNA分子如mRNA、tRNA和rRNA以及特定的RNA分子种类。
在所用的反应条件下退火到作为模板的RNA上的任何引物，都可以用于逆转录反应中。所述引物可以是具有与作为模板的特定RNA互补的核苷酸序列的引物(特异性引物)、寡聚dT(脱氧胸腺嘧啶)引物和具有随机序列的引物(随机引物)。从特异性退火的观点来看，用于逆转录的引物的长度优选为6个或6个以上的核苷酸、更优选9个或9个以上的核苷酸。从寡核苷酸合成的观点来看，长度优选为100个或更少的核苷酸，更优选30个或更少的核苷酸。嵌合寡核苷酸引物可以用作逆转录的引物。所述嵌合寡核苷酸引物也可以在使用逆转录之后获得的cDNA作为模板的本发明的扩增核酸的方法中，用作链置换反应的引物。这样一种引物可以是具有以上(1)中所述特性并且可以用于从RNA进行的逆转录反应中的任一种引物。
具有用RNA作为模板合成cDNA的活性的任何酶，都可以用于逆转录反应中。其实例包括来源于各种来源的逆转录酶，例如禽类成髓细胞瘤病毒源性逆转录酶(AMV RTase)、莫洛尼鼠类白血病病毒源性逆转录酶(MMLV RTase)和劳斯相关病毒2逆转录酶(RAV-2RTase)。另外，可以使用也具有逆转录活性的DNA聚合酶。对于本发明，优选在高温下具有逆转录活性的酶，例如得自栖热菌属细菌的DNA聚合酶(例如Tth DNA聚合酶)和得自芽孢杆菌属嗜热菌的DNA聚合酶。虽然并不打算限制本发明，但是例如优选得自芽孢杆菌属嗜热菌的DNA聚合酶，例如得自B.st的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)和Bca DNA聚合酶。例如，Bca DNA聚合酶并不需要锰离子来进行逆转录反应。此外，它可以合成cDNA，而同时抑制作为模板的RNA在高温条件下形成二级结构。具有逆转录酶活性的天然存在的酶和所述酶的变异体都可以使用，只要它们具有所述活性。
另一方面，在预先复制含有待扩增核苷酸序列的DNA或RNA之后，所述复制产物可以在用于获得依照本发明扩增的核酸的方法中用作作为模板的核酸。用于复制的方法的实例包括但不限于这样一种方法，其中用插入了含待扩增核苷酸序列的核酸片段的载体转化合适宿主，培养所得的转化子，从中提取插入了所述含待扩增核苷酸序列的核酸片段的载体，并且使用所述载体。可以使用任何载体，只要它们在所述宿主中稳定地复制。例如，优选使用pUC系列、pBluescript系列、pGEM系列、粘粒型载体和噬菌体型载体。可以使用任何宿主，只要它们可以保持所用的载体。例如，例举容易培养的大肠杆菌。
在所述复制方法的另一方面，在用RNA聚合酶和用含待扩增核苷酸序列的核酸片段作为模板，转录具有所述序列的RNA之后，可以将所述RNA直接用作本发明方法的模板，或者在通过逆转录反应将所述RNA转变为cDNA后，用作本发明方法的模板。所述含待扩增核苷酸序列的核酸片段并不限于特定的核酸片段，只要它具有供RNA聚合酶用的启动子序列。可以将所述核酸片段插入到具有供RNA聚合酶用的启动子序列的载体中，与连接物或者在末端具有供RNA聚合酶用的启动子序列的盒连接，或者用具有供RNA聚合酶用的启动子序列的引物和合适的模板来酶促合成。因此，含有待扩增核苷酸序列的核酸片段，可以用如上所述定位的供RNA聚合酶用的启动子序列，以RNA形式复制或扩增。可以使用任何载体，只要它们具有供RNA聚合酶用的启动子序列。例如，优选使用pUC系列、pBluescript系列、pGEM系列、粘粒型载体和噬菌体型载体。所述载体可以优选以环状形式或者在线性化之后使用。对于所述复制或扩增方法，可以使用任何RNA聚合酶。例如，可以优选使用SP6 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3RNA聚合酶等。
通过制备如上所述形式的、待用来获得依照本发明扩增的核酸的作为模板的核酸，可以用有限数目的以上(1)中所述的寡核苷酸引物，来获得各种各样的扩增核酸。也就是说，可以大量获得各种各样的DNA片段，例如用于固定到DNA芯片上的DNA片段，作为依照本发明扩增的核酸。
所述模板的合适长度为由于在所述片段中存在所述完整的靶序列或至少所述靶序列的足够部分而达到使以上(1)中所述的寡核苷酸引物序列足够结合的长度。
双链DNA诸如基因组DNA或扩增核酸片段以及单链DNA如通过逆转录反应从总RNA或mRNA制备的cDNA，都可以优选用作模板DNA，用于获得依照本发明扩增的核酸。可以将所述双链DNA变性为单链DNA。另一方面，可以结合使用使变性步骤变为不必要的RNA酶H。这样的RNA酶H例如为P.fu或P.ho II型RNA酶H。
虽然并不打算限制本发明，但是如果作为待用于获得依照本发明扩增的核酸的模板的DNA为双链DNA，则可以将所述DNA变性为单链DNA，以便允许引物结合到作为模板的所述DNA链上。对于变性，优选将所述双链DNA在使其变性的温度(例如约95℃)下保温。其它方法包括使用提高的pH的方法。在这种情况下，所述pH在扩增反应时应该降低，以便允许寡核苷酸引物结合到靶上。在使双链DNA变性为单链DNA之后，或者如果用RNA作为模板，则通过逆转录反应制备cDNA(一种单链DNA)，在等温条件下可成功地扩增核酸。“成功地”是指在不改变反应温度或者反应混合物组成的情况下反应可进行。此中所用的“等温”是指在每个步骤中酶和核酸链可发挥功能的基本恒定温度的条件。
用于获得依照本发明扩增的核酸的核酸扩增反应，可以通过采用嗜常温DNA聚合酶如Klenow片段，在常温(例如37℃)下进行。通过采用耐热性酶(内切核酸酶和DNA聚合酶)，它也可以在高温(例如50℃或50℃以上，或者60℃或60℃以上)下进行。在这种情况下，引物的非特异性退火被抑制，导致DNA扩增的特异性提高。此外，作为模板的DNA形成二级结构的问题得到了解决，导致DNA聚合酶的延伸能力增强。在所述方法中，可以成功地进行逆转录反应和核酸扩增。这样，通过联合应用逆转录酶和上述反应，或者通过采用具有逆转录活性的DNA聚合酶，可以扩增具有从RNA衍生的序列的DNA。
虽然并不打算限制本发明，但是在用于获得依照本发明扩增的核酸的反应的每个方面，与作为模板的单链DNA互补的嵌合寡核苷酸引物，首先退火至所述DNA上。由于DNA聚合酶的作用，与作为模板的DNA互补的DNA(引物延伸链)然后沿着作为模板的DNA的其余序列，从引物的3’末端开始延伸，合成双链DNA。内切核酸酶作用于所述双链DNA，开始从所述引物延伸链的引物部分从头延伸DNA。虽然本发明并不受理论的限制，但是内切核酸酶起切割酶的作用，在双链DNA中引入一个切口，或者它改变由所述嵌合寡核苷酸引物和作为模板的DNA组成的双链DNA的结构。具有链置换活性的DNA聚合酶，从所述双链DNA中所引入的切口的3’末端开始，重新延伸DNA链，产生一条新的引物延伸链，同时释放所述切口的3’末端下游的DNA。
用于获得依照本发明扩增的核酸的核酸扩增法，可以用两种引物进行，即一种与作为模板的核酸互补的嵌合寡核苷酸引物和与被置换链互补的另一嵌合寡核苷酸引物。在这种情况下，一种引物结合于作为模板的DNA链，引起链置换反应，而另一种引物结合于由于链置换反应而被释放的被置换链，起始另一个链置换反应。显然，如果应用这一方面，则用一种引物获得的反应产物可以用作另一种引物的模板。因此，由于模板的量增加，所以扩增产物的量以非线性方式增加。可以通过用经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸作为嵌合寡核苷酸的一部分，可以获得依照本发明扩增的核酸。
当用双链DNA作为模板，进行用于获得依照本发明扩增的核酸的核酸扩增法时，通过使用分别退火到两条链上的嵌合寡核苷酸引物，两条链都可以用作扩增反应中的模板。如果所述反应在使双链DNA变性后起始，则在使双链DNA变性之前或之后，将一种嵌合寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和内切核酸酶加入到反应混合物中。如果用热处理使双链DNA变性，并且不使用耐热性酶，则优选在变性之后加入所述酶。用经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸三磷酸作为脱氧核糖核苷酸三磷酸的一部分，可以获得依照本发明扩增的核酸。
在使用作为模板的双链DNA和两个嵌合寡核苷酸引物的用于获得依照本发明扩增的核酸的核酸扩增法这一方面，模板的转换可以在从所述引物产生由合成的引物延伸链组成的、待相互退火的双链核酸的延伸反应期间，在模板延伸链中间体中发生，虽然这取决于反应条件等。所述双链核酸在两端具有嵌合寡核苷酸引物。然后，包括链置换的延伸互补链的反应，可以再次从两端起始。作为该反应的结果，产生在一端具有引物序列的扩增产物。此外，如果模板转换在所述反应期间发生，则又产生与上述相似的双链核酸。
能够在链置换反应期间实现模板转换反应的DNA聚合酶，可以优选用来获得依照本发明扩增的核酸。例如，特别优选使用缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶的变异型酶。这样一种酶在市场上可作为BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)获得。它也可以依照日本专利2978001号中所述的方法，从含有所述酶的基因的大肠杆菌HB101/pUI205(FERM BP-3720)制备。大肠杆菌HB101/pUI205(FERMBP-3720)从1991年5月10日(原始保藏日)起保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Intemational Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)。
在用于获得依照本发明扩增的核酸的扩增法中，所述嵌合寡核苷酸引物延伸链，可以在含有所述核糖核苷酸的位点被切割，因此所述切割产生的5’片段(引物部分)不含所述核糖核苷酸。从如此产生的引物部分延伸的引物延伸链，不再被内切核酸酶切割。结果，产生在末端具有引物序列的扩增产物。
如上所述，在用于获得依照本发明扩增的核酸的核酸扩增法中，可能产生无引物序列的扩增产物和在一端或两端具有引物序列的产物。这些产物包括在依照本发明扩增的核酸中。
在用于获得依照本发明扩增的核酸的方法中所使用的DNA聚合酶，应该从引物部分的3’末端开始，朝下游方向合成延伸链，同时置换先前延伸的DNA链。重要的是，所述DNA聚合酶应该不表现出可以消化被置换链的5’→3’外切核酸酶活性。例如，作为得自大肠杆菌的DNA聚合酶I的外切核酸酶缺陷型变异体的Klenow片段、一种来源于Bst DNA聚合酶的相似片段(New England Biolabs)和得自B.ca的BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)可用作这样的DNA聚合酶。也可以使用Sequenase 1.0和Sequenase 2.0(United States Biochemical)以及Gene，9713-19(1991)中所述的T5 DNA聚合酶和?29 DNA聚合酶。如果加入合适的抑制剂可以抑制5’→3’外切核酸酶活性，则通常具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶也可以用于用来获得依照本发明扩增的核酸的DNA合成法中。
用来获得依照本发明扩增的核酸的核酸扩增方法，可以在变化的温度下进行，或者它可以等温进行。变化的温度是指对于相应的步骤改变反应温度，使得所述改变不干扰所述步骤中的反应。具体地说，变化的温度是指温度改变到适合于例如引物退火、互补链的合成反应、在互补链中产生切口和置换反应中的每个反应的温度。
另一方面，等温是指每个步骤的反应温度不改变，每个步骤在基本恒定的温度下进行。自然，在两个情况下选择使反应条件最优的温度。
用来获得依照本发明扩增的核酸的扩增法的一个特征是，所述方法并不需要在核酸合成期间对温度作上下调节。许多常规核酸扩增方法需要对温度作上下调节，以便使靶与合成链分离。这些方法为此需要特殊的反应设备，例如热循环仪。然而，本发明的所述方法可以仅用可以保持恒温的设备来进行。如上所述，本发明的所述方法可以在单一的温度下进行。优选通过选择反应温度和严谨性水平来进行，使得引物的非特异性退火被减少，并且引物特异性地退火到作为模板的核酸上。虽然并不打算限制本发明，但是本发明的所述方法可以通过用上述耐热性酶，在高温条件下进行。另外，优选在适合于足以保留所用酶的活性以便维持高水平反应效率的温度下，进行本发明的所述方法。因此，反应温度优选为约20℃至约80℃，更优选约30℃至约75℃，最优选约50℃至约70℃，虽然这视所用的酶而变。特别是当反应在高温条件下进行时，优选使用比常温下进行反应所用的引物更长的引物。适合于反应温度的引物的序列和长度可以例如参考其Tm值来确定。另一方面，可以使用用于设计引物的市售软件如OLIGOTMPrimer Analysis软件(Takara Shuzo)。例如，当使用55℃至60℃或65℃的反应温度时，用于所述方法的引物可以例如但不限于长度为12-100个核苷酸，优选长度为14-50个核苷酸，更优选长度为15-40个核苷酸。反应温度升高所产生的效应的实例是解决了作为模板的DNA形成二级结构的问题。反应温度升高，使得即使用具有高GC含量的核酸作为模板也能够扩增所需核酸。此外，在扩增长链长度的区方面同样有效。在约60bp-20kbp、特别是约110bp-4.3kbp、更特别是约130bp-1500bp的范围内，可观察到这样的效应。
通过根据作为模板的核酸的GC含量来调节反应温度，可以提高扩增效率。例如，如果用具有低GC含量的核酸作为模板，可以在50℃至55℃下进行扩增反应，虽然所述温度取决于待扩增的链长度和引物的Tm值。
在所述方法中应用具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(例如BcaBEST DNA聚合酶)，可以从RNA扩增核酸，这包括常规进行的从RNA制备cDNA的步骤(逆转录反应)。另一方面，通过独立进行从RNA制备cDNA的步骤所获得的产物-即一种cDNA，可以在用于获得依照本发明扩增的核酸的方法中用作作为模板的DNA。
通过在磷酸、Bicine、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris缓冲液中进行用于获得依照本发明扩增的核酸的方法，可以扩增感兴趣的核酸序列区。
此外，所述核酸扩增方法不需要使用可以随时间调节温度的反应设备。因此，可以在大体积的反应混合物中进行扩增反应。因此，可以大量地工业化生产依照本发明扩增的核酸。
在用于获得依照本发明扩增的核酸的扩增法中所用的引物的利用效率约为100％，这可能5倍于至10倍于常规方法例如PCR中的利用效率。
(6)用于生产本发明扩增核酸的方法如上所述，通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸包括经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合，制备反应混合物；并且将反应混合物保温足够的时间以产生反应产物，可以获得依照本发明扩增的核酸。
换句话说，关于所述经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸三磷酸并无具体限制，只要可以用在本发明所述方法中所使用的DNA聚合酶将其掺入作为底物即可。具有能够将依照本发明方法制备的核酸固定化的官能团的脱氧核糖核苷酸三磷酸，可以优选用作所述经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。所述经修饰的脱氧核糖核苷酸磷酸的实例包括但不限于具有羟基、氨基、巯基、醛基、羧基、环氧基或酰基的经修饰的脱氧核糖核苷酸磷酸、以及生物素标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸。氨基烯丙基dUTP可以优选用作这样的经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。
在本发明的另一实施方案中，所述用于生产扩增核酸的方法的特征可以是使用含有经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，掺入经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸。因此，一个示例性的用于生产扩增核酸的方法包括通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合，制备反应混合物；并且将所述反应混合物保温足够的时间以产生反应产物。在这种情况下，所述引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补的嵌合寡核苷酸引物，并且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于所述引物的3’末端或3’端一侧，其中所述脱氧核糖核苷酸的一部分是经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸。
虽然并不打算限制本发明，但是例如待用于所述方法中的嵌合寡核苷酸引物可以在引物的5’端一侧和/或3’端一侧具有一个供固定到固相上用的官能团。在这种情况下，所述嵌合寡核苷酸引物可以在所述官能团与引物的5’端一侧和/或3’端一侧之间具有一个间隔区。关于所述官能团并无具体限制，只要它能够固定到固相上，并且不抑制依照本发明方法的扩增。具有一个能够将依照本发明方法制备的核酸固定化的官能团的嵌合寡核苷酸引物，可以优选用作这样的经修饰的引物。虽然并不打算限制本发明，但是其实例包括在5’末端具有羟基、氨基、巯基、醛基、羧基、环氧基或酰基的经修饰引物。使用用于引入氨基的试剂(Perkin Elmer)获得的5’氨基连接的引物，可以优选用作这样的经修饰引物。
由于PCR法需要在规定时间内改变反应混合物的温度，所以反应体积限于可以控制温度的体积(通常为200μl或更少)。因此，难以按比例增加体积。另一方面，在本发明的方法中没有这种限制。增加反应混合物的体积，可以生产大量的核酸。在本发明的所述方法中，从一个模板分子合成大量的互补链分子。此外，可以用这些互补链分子作为模板来合成核酸。因此，通过适当选择模板和引物，可以有效地生产大量的所需核酸。另外，与PCR不同，本发明的所述方法并不需要特殊装置或复杂的温度改变，这一事实使得从设备和能量成本的观点来看有优势。因此，所述方法是一种优异的大量生产核酸的工业方法。
本发明的生产方法可用作大量供应各种各样DNA片段的方法，所述DNA片段例如待固定到DNA芯片上的DNA片段。具体地说，在一个实施方案中，可以用简单的反应步骤大量获得DNA片段。
(7)具有本发明的固定化扩增核酸的材料虽然并不打算限制本发明，但是DNA芯片例举具有固定化核酸的材料。DNA芯片(也称为DNA微阵列或DNA阵列)是一种具有固定化核酸的材料，其中各种各样的基因或DNA片段排列并且固定化在固相基质如玻片上的预定区或预定位置中。术语预定区(predefmedregion)、预定位置或预定区(predetermined region)，是指在该区或该位置上固定化的扩增核酸是已知的。在这种情况下，在该位置固定化的扩增核酸是已知的，而无论所述扩增核酸的核苷酸序列是否已知。
用所述DNA芯片来检查核酸样品中具有与DNA芯片上预定区中排列和固定化的DNA互补的序列的核酸的存在情况。通过使DNA芯片与从样品中制备的核酸样品、优选标记的核酸样品接触以便杂交，来进行所述检查。由于可以用所述DNA芯片在一个步骤中检测或定量样品中的核酸数量，所以它是一种非常有用的方法，可显著促进基因表达分析、或者突变或多态性的分析。使用其中双链核酸在预定区中排列和固定化的DNA芯片，在经过适当变性后进行杂交。其中与待测靶核酸互补的单链DNA在预定区中排列和固定化的DNA.芯片，特别优选用于检测靶核酸。
可以用任何不溶性基质，作为如此获得的DNA排列和固定于其上预定区中的基质，但优选使用由玻璃或塑料制成的板状基质和由硝化纤维素或尼龙制成的膜状基质。可以使用用于将核酸固定化的已知方法来进行固定化。可以将所述DNA直接固定到基质上。或者，可以通过合适的接头或者在连接多种DNA分子之后，将所述DNA固定化。
虽然并不打算限制本发明，但是如果使用玻璃基质，则它可以在经过包被之后使用，因为玻璃本身所带的电荷较少，与DNA的结合较弱。可以使用多聚L-赖氨酸包被、亚甲硅基包被、硅烷化、戊二醛包被、胺化等进行包被，但不限于此。可以将DNA通过静电力，固定到如上所述包被的玻璃基质上。
依照本发明扩增的核酸含有经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸。因此，可以将其例如以不同于如上所述通过静电力固定到玻璃基质上的方式，固定到基质上。具体地说，有可能利用包被在玻璃基质上的官能团与依照本发明扩增的核酸中所含有的经修饰的脱氧核糖核苷酸之间的化学反应所产生的共价键来进行固定化。
利用这样的共价结合，可以如下获得其中单链DNA结合于基质上的具有固定化核酸的材料。使用与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补并且含有经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物、和与作为模板的核酸的核苷酸序列基本同源但不含经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，制备依照本发明扩增的核酸。通过经化学反应产生共价键，将所述扩增核酸固定化和排列在包被有官能团的玻璃基质的预定区中。然后，通过变性，仅释放不含所述经修饰的脱氧核糖核苷酸引物的延伸链。
例如，由于核糖核苷酸部分保留在用得自大肠杆菌的RNA酶H获得的依照本发明扩增的核酸中，因此在变性后仅释放不含所述经修饰的脱氧核糖核苷酸引物的延伸链时，所述核糖核苷酸键可能被切割。然而，可以进行所述变性，使得双链核酸中的氢键被切割，而通过在如下所述依照本发明的变性条件下进行变性，同一条链中所述核糖核苷酸的键不被切割。结果，可以获得其中利用由于所扩增核酸中经修饰的脱氧核糖核苷酸所产生的共价键将含核糖核苷酸的单链核酸结合于基质上的、具有固定化核酸的材料。
虽然对于使所述扩增核酸变性的条件并无具体限制，但是优选在含有浓度为0.1N-2.0N的碱的溶液中于10℃至65℃的温度下变性5-30分钟。特别是，如果扩增核酸以其末端固定于固相上，则优选在0.2NNaOH中于20℃变性5分钟，或者在0.5N NaOH中于20℃变性5分钟。
例如，如果利用扩增核酸中的经修饰脱氧核糖核苷酸将扩增核酸固定到固相上，则优选在0.2N NaOH中于60℃变性30分钟。
如果用得自激烈热球菌或Pyrococcus horikoshii的II型RNA酶H获得依照本发明扩增的核酸，则由于所述酶的特性，可以获得不含核糖核苷酸部分的扩增核酸。因此，在这种情况下，即使使用比双链核酸中的氢键被切割、而同一条链中核糖核苷酸的键不被切割的变性条件更强的变性条件，也可以获得其中单链核酸结合于基质上的、具有固定化核酸的材料。
例如，优选这种扩增核酸在0.2N NaOH中于60℃变性30分钟。
虽然并不打算限制本发明，但是可以进行除上述碱变性以外的方法，例如热变性。例如，可以于95℃进行3分钟的热变性。
使用得自大肠杆菌、激烈热球菌或Pyrococcus horikoshii的II型RNA酶H，可以获得其中单链核酸以其末端或者在所述核酸中所含的经修饰核酸的位点上固定到固相上的、具有本发明的固定化扩增核酸的材料。
如果将双链核酸排列和固定化到具有固定化核酸的材料中的预定区中，则所述材料在经过适当变性之后用于杂交。另一方面，由于与待测靶核酸互补的单链DNA排列和固定化到本发明材料的预定区中，所以它可以无需进行这种变性而用来检测靶核酸。因此，与常规DNA芯片相比，用依照本发明扩增的产物制备的、其中单链DNA结合于基质上的DNA芯片，可以用来更方便地、以更高的灵敏度和更高的再现性检测靶核酸。
另外，可以依照本发明使用5’-DNA-RNA-DNA-3’形式的嵌合寡核苷酸引物。在这种情况下，通过在5’端一侧和/或3’端一侧的DNA部分的任一个核苷酸中引入官能团以供固定到基质上用，可以提高待固定化核酸的利用率。换句话说，可以降低待固定化核酸利用上的损失。
实施例以下实施例更详细地说明本发明，但不应解释为限制本发明的范围。
参比实施例1(1)从激烈热球菌制备基因组DNA将含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母膏(DifcoLaboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarin S Solid(Jamarin Laboratory)、0.5％Jamarin S Liquid(Jamarin Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppm H3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2L培养基置于2L培养瓶中，于120℃灭菌20分钟，通入氮气，以除去溶解氧，然后在培养基中接种激烈热球菌(从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(德意志微生物保藏中心)购买；DSM3638)，于95℃不振荡培养16小时。培养后，通过离心收集细胞。然后将所得细胞悬浮于4ml25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。加入0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶(lysozyme chloride)(Nacalai Tesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的24ml混合物、0.2ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和2ml 10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃温育1小时。反应后，混合物经过苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，制备约1mg基因组DNA。
(2)RNA酶HII基因的克隆Pyrococcus horikoshii的完整基因组序列已经发表[DNA Research，555-76(1998)]。已知在基因组中存在一个编码RNA酶HII的同源物的基因(PH1650)(SEQ ID NO1，National Institute of Technology andEvaluation，Ministry of Economy，Trade and Industryhttp//www.nite.gojp/的主页)。
搜索了PH1650基因和激烈热球菌的部分发表的基因组序列(University of Utah，Utah Genome Centerhttp//www.genome.utah.edu/sequence.html的主页)之间的同源性。结果，发现一个高度同源的序列。根据所述同源序列，合成引物1650Nde(SEQ ID NO2)和1650Bam(SEQ ID NO3)。
用在以上(1)中获得的200ng激烈热球菌DNA作为模板，用20pmol 1650Nde和20pmol 1650Bam作为引物，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行30个循环。约0.7kb的扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。将所得的DNA片段插入到质粒载体pET3a(Novagen)的NdeI位点和BamHI位点之间，制备质粒pPFU220。
(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定按照双脱氧法，测定在以上(2)中获得的插入到pPFU220中的所述DNA片段的核苷酸序列。所测定的核苷酸序列的分析揭示出存在一个推定编码RNA酶HII的可读框。所述可读框的核苷酸序列示于SEQ IDNO4中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQID NO5中。
用质粒pPFU220转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pPFU220，并且于2000年9月5日(原始保藏日)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM P-18020，并且于2001年7月9日转至国际保藏单位，保藏号为FERM BP-7654。
(4)经纯化的RNA酶HII制剂的制备用以上(2)中获得的pPFU220转化大肠杆菌HMS174(DE3)(Novagen)。将所得的带有pPFU220的大肠杆菌HMS174(DE3)接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于66.0ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟(PMSF)]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12000rpm离心10分钟而获得的上清液于60℃加热15分钟。然后再次以12000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得61.5ml热处理上清液。
将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。将60.0ml所述流通RNA酶HII流分经过用缓冲液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以0-500mM NaCl线性梯度洗脱。获得用约150mMNaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。用Centricon-10(Amicon)，通过超滤浓缩2.0ml所述RNA酶HII流分。将250μl所述浓缩液经过用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH 8.0)平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于17千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。将如此洗脱出的RNA酶HII用作PfuRNA酶HII制剂。
如参比实施例3中所述，测定RNA酶H活性。结果，观察到所述Pfu RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。
参比实施例2从Pyrococcus horikoshii克隆RNA酶HII基因(1)从Pyrococcus horikoshii制备基因组DNA将含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母膏(DifcoLaboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarin S Solid(Jamarin Laboratory)、0.5％Jamarin S Liquid(Jamarin Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppm H3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2L培养基置于2L培养瓶中，于120℃灭菌20分钟，通入氮气，以除去溶解氧，然后在培养基中接种Pyrococcus horikoshiiOT3(从the Institute of Physical and Chemical Research(RIKEN)购买；JCM9974)，于95℃不振荡培养16小时。培养后，通过离心收集细胞。
然后将所述细胞悬浮于4ml 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH 8.0)中。加入0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶(Nacalai Tesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mMNaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH 8.0)的24ml混合物、0.2ml20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和2ml 10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃温育1小时。
反应后，混合物经过苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，制备约1mg基因组DNA。
(2)RNA酶HII基因的克隆Pyrococcus horikoshii的完整基因组序列已经发表[DNA Research，555-76(1998)]。已知存在一个编码RNA酶HII的同源物的基因(PH1650)(SEQ ID NO1，National Institute of Technology and Evaluationhttp//www.nite.gojp/的主页)。
根据PH1650基因(SEQ ID NO51)的序列，合成引物PhoNde(SEQID NO2)和PhoBam(SEQ ID NO3)。
用参比实施例2-(1)中制备的100ng Pyrococcus horikoshii DNA作为模板，用PhoNde和PhoBam各20pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行40个循环。约0.7kb的扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。然后通过将所得的DNA片段加入到质粒载体pET3a(Novagen)的NdeI位点和BamHI位点之间，构建质粒pPHO238。
(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定按照双脱氧法，测定在参比实施例2-(2)中获得的插入到pPHO238中的所述DNA片段的核苷酸序列。
所测定的核苷酸序列的分析揭示出一个推定编码RNA酶HII的可读框。所述可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO51中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO52中。
用质粒pPHO238转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pPHO238，并且于2001年2月22日(原始保藏日)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM P-18222，并且于2001年8月2日转至国际保藏单位，保藏号为FERM BP-7692。
(4)经纯化的RNA酶HII制剂的制备用参比实施例2-(2)中获得的pPHO238转化大肠杆菌HMS174(DE3)(Novagen)。将所得的带有pPHO238的大肠杆菌HMS174(DE3)接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的1L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于34.3ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12000rpm离心10分钟而获得的上清液于80℃加热15分钟。然后再次以12000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得33.5ml热处理上清液。
将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。
将35.0ml所述流通RNA酶HII流分用2L