专利名称：一种微生物转化苯甲酰甲酸乙酯制备(s)-(+)-扁桃酸乙酯的方法(S)_(+)_ 扁桃酸乙酯(Ethyl (S)-(+)_mandelate)，CAS 登录号13704-09-1，分子式CltlH12O3，分子量180. 2。它是一种重要的手性药物中间体，可以广泛地用于合成手性酸，手性醇，手性胺类化合物，手性氨基醇和手性硫醇等。(S)-(+)_扁桃酸乙酯水解后制备的(s)-(+)-扁桃酸在医药工业中可用于头孢羟唑、血管扩张药环扁桃酸酯、滴眼药羟苄唑等的中间体，也可作防腐剂。(S) - (+)-扁桃酸乙酯的合成途径主要有化学法和生物转化法。在化学催化剂或生物催化剂的作用下，还原苯甲酰甲酸乙酯可以获得(S)-(+)_扁桃酸乙酯。采用化学法不对称还原苯甲酰甲酸乙酯需要在价格昂贵的手性催化剂的催化下才能完成。化学还原过程中手性催化剂价格昂贵、制备过程繁琐。采用含有羰基还原酶的微生物细胞为生物催化剂不对称还原苯甲酰甲酸乙酯具有反应条件温和、立体选择性好、成本低廉的特点。生物转化过程可以在不同的反应体系中进行。最为传统的反应体系是水相体系，在水相体系中进行生物转化微生物的催化活性较高，但是有机底物浓度过高时生物转化效率会急剧下降。为了解决高底物浓度对细胞催化活性的抑制作用，采用生物相容性好的有机溶剂用于生物转化过程，在生物相容性较好的有机溶剂中微生物能够保持较好地催化活性，有机底物能够很好地分散于反应溶剂中，从而避免底物和产物在反应溶剂中局部浓度不均一而导致催化效率降低的现象。也可以采用水/有机溶剂两相体系作为反应介质，可以确保微生物在水溶液中具有良好的生物学活性。底物和产物在有机介质中具有较大的溶解度，有利于实现产物的分离提取。采用固定化细胞进行生物转化可以较大程度保护细胞的催化活性，同时有利于产物的分离提取，有利于微生物细胞的重复利用，提高生产效率。
本发明目的是提供一种以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC No. 2266为生物催化剂，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制备(S)-(+)_扁桃酸乙酯的方法。本发明采用的技术方案是—种苯甲酰甲酸乙酯微生物转化制备(S)_(+)_扁桃酸乙酯的方法，所述方法包括以苯甲酸甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266在发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在水和正己烷两相体系中，于2(T35°C下进行转化反应8 120小时，转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)_扁桃酸乙酯；所述水和正己烷两相体系中，水与正己烷体积比为1:0. 2飞(优选1:1)，在所述水和正己烷两相体系中，底物苯甲酰甲酸乙酯的初始浓度为l 200mmol/L (优选5 50mmol/L)。本发明中所用的菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCCNo. 2266是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到的，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2007年11月26日，已在CN101230319A中披露。该菌株菌落特征在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。所述含酶菌体细胞可直接以发酵液形式参与反应，也可经过滤后以湿菌体细胞形式参与反应，或者经固定化之后作为生物催化剂参与反应。优选的，所述含酶菌体细胞经固定化之后作为生物催化剂，其用量为每L水和正己烷两相体系中含有的生物催化剂相当于以包埋法将I. (Γ4. Og (以干重计)的含酶菌体细胞固定化后再经增殖培养16 72小时获得的固定化细胞颗粒。所述生物催化剂(固定化细胞颗粒)制备方法如下将酿酒酵母菌株CGMCCNo. 2266发酵培养获得的菌体浓度为3. (TlO. Og/L的发酵液与等体积质量浓度f 5%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入足量质量浓度为2. 5^4. 0%的氯化 钙溶液中，连续搅拌得到固定化悬浮液，放置于35 38°C条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤后，分散于发酵培养基中进行增殖培养16 72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，即为生物催化剂。所述的固定化细胞颗粒的直径可通过注射器的针头尺寸来控制，推荐为l、mm，最优选2mm。所述发酵培养基组成如下葡萄糖26 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸铵T6g/L，无水MgSO4 O. 2 O. 4g/L, K2HPO4 · 3H20 O. 5 I. 5g/L, KH2PO4O. 6 I. 5g/L, pH 自然，溶剂为水。所述分离纯化方法如下将转化液过滤除去生物催化剂，滤液静置分层后得到正己烷层，将正己烷减压蒸馏，分离得到产物(S)-(+)_扁桃酸乙酯。在包埋处理过程中，海藻酸钠的浓度推荐为1飞％，最优选2%。本发明所述的应用可按如下方法获得发酵液(I)斜面培养将酿酒酵母CGMCC No. 2266菌体接种到斜面培养基，26 35°C培养4飞天得到斜面培养的菌体；所述的斜面培养基组成如下麦芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，琼脂15 25g/L，自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min，灭囷后冷却制成斜面；(2)种子培养从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，26 35°C，摇床转速为15(T200r/min，培养18 26h得种子液；所述的种子培养基组成如下葡萄糖26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸铵 3 6g/L，无水 MgSO4 O. 2 O. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 005 I. 5g/L，KH2PO4O.6^1. 5g/L,自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却，即得种子培养基；(3)发酵培养取种子液，以1(Γ20%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26 35°C，摇床转速为15(T200r/min，培养18 30h得到发酵液；所述的发酵培养基的组成同种子培养基。具体推荐按照如下步骤获得生物催化剂将前面所得到的发酵液与等体积2%的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4. 30g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为3. 5%的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37°C条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h，得到增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。具体推荐所述的方法为以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以苯甲酰甲酸乙酯为底物，在水和正己烷两相体系(体积比I: I)中，于30°C、180r/min条件下转化反应72h，转化液经分离纯化得到产物(S)-(+)_扁桃酸乙酯；所述的分离纯化可采用如下步骤将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将反应液静置分层后得到正己烷层。将正己烷减压蒸馏，分离得到产物(S)_(+)_扁桃酸乙酯。在水和正己烷中，底物苯甲酰甲酸乙酯的初始浓度为广200. Ommol/L,每L水和正己烷两相体系中含有的生物催化剂相当于以包埋法将O. 330L菌体浓度为4. 3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒。得到的(S)_(+)_扁桃酸乙酯纯品用气相色谱一质谱联用仪进行检测确定产物的纯度和分子量。摩尔转化率和产物(S)_(+)_扁桃酸乙酯对映体过剩值(ee%)的确定 采用安捷伦7820气相色谱仪分析检测。色谱柱为手性柱，型号为ChiralCYCL0DEX-B (O. 25mmX30mX0. 25μπι)，载气为氮气，流速为lml/min。手性柱可以检测到(R)-(-)_扁桃酸乙酯和(S)-(+)_扁桃酸乙酯两种对映体的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率和(S)-(+)_扁桃酸乙酯的对映体过剩值(ee%)。过滤得到的固定化细胞颗粒可重复使用于微生物转化制备(S)_(+)_扁桃酸乙酯的反应。本发明采用固定化细胞在水和正己烷两相体系中催化苯甲酰甲酸乙酯转化制备(S)-⑴-扁桃酸乙酯，为(s)-(+)-扁桃酸乙酯的制备提供了一条经济有效的合成途径。利用本发明方法生产的(S)-(+)_扁桃酸乙酯对映体过剩值大于99. 0%，底物摩尔转化率可以达到99. 0%，产品纯度达到98. 0%，固定化细胞颗粒可以重复利用9次。本发明微生物转化法制备(S)_(+)_扁桃酸乙酯具有以下优点①生产所用的菌株安全无毒。②固定化细胞作为生物催化剂有利于实现产物的分离提取。③固定化细胞作为生物催化剂有利于实现催化剂的重复利用，节约成本。④生产操作简便，生物转化率较高。⑤生物催化剂比化学催化剂成本低廉。⑥不受季节影响，易于实现大规模工业化生产。⑦环境友好，反应条件温和，常温常压下即可顺利进行转化。⑧正己烷可以溶解大量的底物和产物，可以降低有机底物和产物对生物催化反应过程的抑制作用，提高底物的转化量，提高生物转化的生产效率。本发明提供了一种以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266为生物催化剂，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法。所述方法包括以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在水和正己烷两相体系中，于20~35℃下进行转化反应8~120小时，转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)-扁桃酸乙酯；该微生物转化方法反应条件温和，环境友好，产物光学纯度高，底物转化率高，分离纯化过程简单，催化剂可重复利用，适于工业化生产。