专利名称：一种s-木薯羟腈裂解酶的提取方法及其在手性合成乙酸氰醇酯中的应用的制作方法手性氰醇及其酯是一类具有重要价值的手性源。它可以方便地转化为具有 构型的羟基酮、羟基醇、P-胺基醇、氨腈、氮啶、咪唑杂环等重要的合成手性药物及中间体的重要原料。在非手性催化剂或无催化剂的条件下，醛与HCN的加成一般只能得到外消旋的氰醇产物；所以，需要使用拆分或手性催化剂才能得到S-手性氰醇及其酯。S-氰醇的生物催化合成，一般使用S-羟氰裂解酶作为手性催化剂。而S-羟氰裂解酶分布不如羟氰裂解酶那样广泛，目前发现它只存在于橡胶、木薯和高粱嫩叶等少数几种植物组织中，并且丰度较低，纯化难度大。其中，木薯是一种在100多个国家广泛被种植的重要农作物° Effenberg 等(Wajant, H. ; Forster, S. ; Bottinger, H. ; Effenberger, F.;Pfizenmaier, K. Plant sci. , 1995, 108, I.)发现木薯中含有的51-木薯轻腈裂解酶(S-MeHNL),可催化醒或酮和HCN合成手性氰醇。Effenberg等并通过五步法分离得到了木薯羟腈裂解酶，分别为粗酶液的提取；凝胶层析；阴离子交换层析(pH 5. 8);凝胶过滤层析；再次阴离子交换层析(pH 7. 5)。然后将获得的木薯羟腈裂解酶固定在硝基纤维上作为催化剂，催化芳醛、脂肪醛和杂环醛与HCN加成合成手性氰醇，苯甲醛的氰醇产物ee值较高(90%)，但收率只有34% ;其它产物的ee值和收率都不理想(Scheme I)。I+ c,S-MeHyi I JHR H— O 02 M acttait buffer R, iCH^diisspfopyt etherR Vi?d eeR Vielcl ae81V1 34% 30% -Pr 70% 83%
I n d 70% }j 9-0% 38%
Sckfin# IWhite等也尝试了用三步法从木薯叶中提取了木薯羟腈裂解酶即先从木薯叶中提取了粗酶液，再用盐析法(50%硫酸铵水溶液)析出5·-木薯羟腈裂粗酶，并透析24 h以除去粗酶中含有的盐(硫酸铵)。在此基础上White等对木薯羟腈裂解酶部分酶学性质进行了研究，但没有达到催化合成手性氰醇的要求(White, ff. L. B. ; Arias-Garzon, D.
I.; McMahon, J. Μ. ; Sayre, R. Τ. Plant Phsiol. 1998, 116, 1219·)。
以上这些木薯羟腈裂解酶提取方法存在酶的收率低、纯度低、酶催化反应效果差等问题。因此,科学家们将希望寄于基因工程的方法上。如Effenberger等(Forster S.，Roos J. , Effenberger F·，et al . Angew Chem. Int. Ed. Engl. , 1996, 35: 437.)将
木薯羟氰裂解酶(S-MeHNL)在大肠杆菌等中成功表达，通过基因重组的方法获得MeHNL，并将其作为催化剂应用到5·-氰醇的合成上，取得了较好的效果。程树华等(程树华，严共鸿，吴襟，孙万儒，生物工程学报，2001，17 (1)，78.)也成功地将S-木薯羟氰裂解酶克隆于质粒PPIC9K，在大肠杆菌获得高效表达。重组羟腈酶的催化活性较高。虽然木薯羟氰裂解酶在基因工程的研究取得了较大的进展，但由于获得的重组酶活性通常稳定性差，浓度低，到目前为止，该技术还难以达到实际应用的阶段。如上所述，S-木薯羟氰裂解酶在木薯叶中丰度虽然低，但由于木薯叶是一种来源 丰富的可再生资源，价廉易得。若能研究开发出一种能简易、经济、有效地从木薯叶中提取具有高催化活性的S-羟氰裂解酶的方法，并将其作为手性催化剂直接应用于氰醇及其乙酸酯的手性加成反应，则实际应用价值很大。


本发明的目的在于提供一种直接使用有机溶剂沉淀法从木薯叶中分离提取木薯羟腈裂解酶(S-MeHNL)的简单、高效的方法，并将其应用为手性催化剂催化醛与各种氰源的手性加成反应，高收率、获得高光学纯度手性氰醇及其乙酸酯。本发明的目的是通过如图I所示的操作程序实现的
SP，将木薯叶作为酶源，经破碎，加入一定浓度盐水溶液作为粗酶的提取液，经过滤除去滤渣后，再加入有机溶剂析出固体，经过滤获得S-木薯羟腈裂解酶，并置于冰箱中贮存。木薯esculenta, cassava)又称树薯或木番薯,是广为种植的农作物之一。所述木薯叶指其新鲜叶子。所述的盐水溶液可以是(NH4)2SO4, Na2SO4, K2SO4, NH4Cl和NaCl等盐中的一种盐的水溶液，浓度为O. 02 O. I mol/L。所选用的有机溶剂可以是甲醇，乙醇，异丙醇，丙酮，四氢呋喃和乙腈中的一种，其用量为提取液体积的Γ5倍区间。上述方法获的木薯羟腈裂解酶可以直接作为手性催化剂，应用于催化醛与氢氰酸、丙酮氰醇、KCN或NaCN等各种氰源的手性加成反应，可高收率地获得高光学纯的氰醇产物，通过简单连续的乙酰化反应，生成较稳定的各种手性乙酰氰醇酯。该反应可连续操作，方法简便和高效。


本发明公开了一种S-木薯羟腈裂解酶的提取方法及其在手性合成乙酸氰醇酯中的应用，其方法是将木薯叶作为酶源，经破碎，加入一定浓度盐水溶液作为粗酶的提取液，经过滤除去滤渣后，再加入有机溶剂析出固体，经过滤获得S-木薯羟腈裂解酶；进一步，将该方法得到S-羟腈裂解酶作为手性催化剂，催化醛与氢氰酸、丙酮氰醇、KCN或NaCN等氰源的手性加成反应，可高收率地获得高光学纯的氰醇产物，通过简单连续的乙酰化反应，生成较稳定的各种手性乙酰氰醇酯，避免手性氰醇的外消旋化。本发明方法简单、高效,可高收率获得高光学纯度的手性氰醇及其O-乙酸氰醇酯，具有较高的工业应用价值。