专利名称：微生物发酵生产低温过氧化氢酶的方法过氧化氢酶(Catalase，EC I. 11. I. 6，简称为CAT)是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，广泛存在于各类动物、植物和微生物体内，它是ー类抗氧化剂，可以催化细胞内过氧化氢分解，防止膜脂过氧化(梁婵娟，中国农学通报，2005)。微生物发酵生产的CAT作为生物制剂，已经广泛应用干与之相关的食品与乳制品业、纸浆和造纸业、印染与纺织业以及农业环保产业中，但目前使用的CAT主要为中温CAT (刘灵芝等，化学与生物工程，2009)。有关微生物发酵生产的低温CAT的研究处于起步阶段，主要是菌种选育和产酶条件优化、生长特性和酶学性质，以及相关基因的克隆等基础研究(刘冰，梁婵娟，中国农学通报，2005 ；张坤生，食品科技，2007);微生物发酵生产的低温CAT产业化、规模化生产及应用还未见报道。微生物发酵生产的低温CAT与高温、中温CAT相比具有很大的应用优势，因为低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并节省昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质，这将有助于微生物发酵生产的低温CAT的推广和使用。微生物发酵生产的低温CAT的应用将对传统的农业、食品、化工、能源和环保等领域产生深远的影响，且可以从根本上摆脱中温、高温酶的加热、冷却设备和エ艺(南芝润，安徽农学通报，2008)。微生物发酵生产的低温CAT将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如饥饿、资源、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇。微生物发酵生产低温CAT具有非常广阔的开发潜力和应用前景(何照兴，印染，2001 ;薛细平，厦门大学学报，2003)。技术内容本发明的目的是提供ー种微生物发酵生产低温CAT的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在10 18°C液体发酵生产低温CAT的方法，这种生产方法可以获得较好的低温CAT粗酶液活性达到180U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低，可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和エ艺(孙谧等，海洋水产研究，2002)。本发明所述的ー种微生物发酵生产低温CAT的方法具体包括以下步骤(I)将产生CAT的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的CAT产生菌在10 16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(3)将液体一级种子或ニ级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养72 144h时，即微生物发酵生产低温CAT结束；(4)将(3)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为CAT粗酶液；(6)根据不同需要和使用对 象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。CAT产生菌(例如，CGMCC菌种编号23499)，菌种先活化、低温驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温CAT，低温驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在零下80°C条件下可以长期保藏。实施例ニ (I)培养基制备①菌种活化培养基马铃薯200. 0g，葡萄糖20. 0g，琼脂16. 0g，蒸馏水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基马铃薯40. 0 60. Og,葡萄糖3. 0 7. 0g，牛肉膏I. Og 3. Og,琼脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基玉米粉12. 0 17. 0g，酵母膏3.0 6. 0g，KH2PO4 0.7 1.3g，MgSO4 7H20 0.3 0. 7g，自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖15. 0 25. 0g，酵母膏3.0 5. 0g，KH2PO4 4.0 6. 0g，MgSO4 7H20 1.7 2.3g，自来水 I. 0L，pH 值 6. 0，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。(2)将产生CAT的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的CAT产生菌在10 16°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(5)将(4)制备的ニ级种子按发酵液体积5 7%的接种量接入50L的产酶培养基中，在12 17°C培养96 120h时，即微生物发酵生产低温CAT结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为CAT粗酶液；(8)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温CAT制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基马铃薯200. 0g，葡萄糖20. 0g，琼脂16. 0g，蒸馏水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基马铃薯40. 0 60. Og,葡萄糖3. 0 7. 0g，牛肉膏I. Og 3.Og,琼脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基玉米粉12. 0 17. 0g，酵母膏3.0 6. 0g，KH2PO4 0.7 1.3g，MgSO4 7H20 0.3 0. 7g，自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖15. 0 25. Og,酵母膏3. 0 5. 0g, KH2PO4 4. 0 6. Og,MgSO4 7H20 1.7 2.3g，自来水 I. 0L，pH 值 6. 0，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。(2)将产生CAT的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好； (4)按常规方法将低温驯化后的CAT产生菌在10 16°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(5)将(4)制备的ニ级种子按发酵液体积7 9%的接种量接入100L的产酶培养基中，在14 16°C培养72 96h吋，即微生物发酵生产低温CAT结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为CAT粗酶液；(8)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温CAT制剂。本发明所述的一种微生物发酵生产低温过氧化氢酶(简称为CAT)的方法是将产生CAT的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的CAT产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温CAT结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000～14,000rpm离心，收集到的上清为CAT粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。