分泌抗血管生成抗体支架和可溶性受体的细胞系及其用途[0001]相关申请 本申请要求2010年12月2日提交的U.S.S.N.61/419，138的优先权，所述申请通过引用以其整体结合到本文中。发明领域[0002]本发明总的来说涉及包封细胞疗法(encapsulated cell therapy)领域。[0003]发明背景 可以通过向患者供应由活细胞产生的一种或多种生物活性分子或通过从患者中除去由活细胞代谢的有害因子来医治或减轻许多临床病况、缺陷和疾病状态。在许多情况下，这些分子可恢复或抵偿器官或组织功能的损害或损失。因此，许多研究人员试图通过移植提供分泌产物或影响代谢功能的完整器官、器官组织和/或细胞，来重构器官或组织功能。然而，虽然这类移植可提供显著益处，但是在其应用中受到限制，因为对于移植是合适且是可得到的器官数目相对较少。此外，移植患者一般必须受免疫抑制以避免移植物的免疫排斥，免疫排斥引起移植物功能丧失和移植组织或细胞最终坏死。同样地，在许多情况下，移植必须长期保持功能，甚至是患者有生之年。保持患者处于免疫抑制状态持续相当的时间既是不希望的又是昂贵的。[0004]在一个实例中，其中仍需要其它有效疗法的是危及视力的眼部病症。在治疗这类疾病中的一个主要问题是因存在血-视网膜屏障而无法将治疗剂递送至眼部，以及以治疗有效浓度将其保持在眼部。[0005]许多生长因子在眼部疾病的治疗中已显示出希望。例如，已表明在各种动物模型中，BDNF和CNTF减缓视网膜神经节细胞的变性并减少光感受器的退化。参见例如GeneticTechnology News,第13卷,第I期(1993年I月)。另外，已表明神经生长因子在视神经切开术后提高视网膜神经节细胞存活，并且还表明在缺血后促进视网膜神经元恢复。参见例如 Siliprandi 等，Invest.0phthalmol.& Vis.Sc1., 34,第 3232-3245 页(1993)。最近，设计出基于抗体支架(antibody scaffold)的生物制剂，并用于眼病症,包括例如完全抗体(例如贝伐单抗)和抗体支架Fab片段(例如雷珠单抗(Ranibizumab))和免疫球蛋白Fc (例如阿柏西普(Aflibercept))。
[0006]移植程序的一个可取的替代方式是植入物理屏障(physical barrier)内的细胞或组织，所述物理屏障允许营养物、代谢物和分泌产物扩散，但将阻断免疫排斥的细胞和分子效应物。已研究了保护产生所选产物的组织或细胞免于免疫系统的各种装置。参见例如美国专利号5，158，881、W092/03327、W091/00119和W093/00128，所述每个专利均通过引用以其整体结合到本文中。这些装置包括例如血管外扩散室(extravascular diffusionchamber)、血管内扩散室、血管内超滤室和微囊化细胞植入。参见Scharp, D.W.等，WorldJ.Surg., 8，第 221-9 页(1984)。参见例如 Lim 等，Science 210: 908-910 (1980)；Sun, A.Μ., Methods in Enzymology 137: 575-579 (1988) ；W0 93/03901 和美国专利号5，002，661。这类装置的使用可减少保持患者处于免疫抑制状态的需要。然而，对于提供长期移植物功能，这些方法无一是令人满意的。
[0007]因此，需要在延长的时间将合适量的所需物质递送(或提供其它所需代谢功能)至眼或身体其它部位的方法，所需物质例如神经营养因子、抗血管生成因子、抗炎因子、酶、激素或其它因子。
[0008]发明概述
本文提供编码包括抗体-支架、可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体和/或血小板衍生生长因子(TOGF)受体在内的抗血管生成蛋白的分离核酸，其中所述核酸包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成:SEQ ID N0:USEQ ID NO:3,SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:19,SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID N0:29 和 SEQ IDN0:31。本发明还提供编码包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的多肽的核酸分子:SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:
22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30 和 SEQ IDN0:32。
[0009]还提供编码具有与SEQID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或
32的任一个有至少95%同一性的序列的多肽的核酸分子。或者，所述核酸分子可为这类核酸分子的互补序列。本文所用术语“核酸分子”欲包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物及其衍生物、片段和同源物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。
[0010]本文所用“分离的”核酸分子是与存在于核酸来源的其它核酸分子分离的核酸分子。优选“分离的”核酸不含位于该核酸来源于其中的生物基因组DNA的该核酸侧翼的序列(即位于该核酸5’和3’端的序列)。例如，在不同的实施方案中，本发明的核酸分子可含有小于约5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、l kb、0.5 kb或0.1 kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于所述核酸来源于其中的细胞基因组DNA的该核酸分子的侧翼。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时，可基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学物质。例如，本领域技术人员应认识到，“分离的”核酸可以是最初来自噬菌体展示筛选的完全合成的分子。因此，在这种情况下，“分离的”核酸可以是基本上不含其它细胞物质、培养基、化学前体、化学物质等的合成分子。
[0011]可采用标准分子生物技术和本文提供的序列信息来制备本发明的核酸分子(例如具有选自以下核苷酸序列的核酸分子:SEQ ID NO: USEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5,SEQID NO: 7,SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQID NO: 19,SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29 和SEQ ID N0:31 ;编码具有选自以下序列的多肽的核酸分子:SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO: 16、SEQID NO:18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID N0:30和SEQ ID NO:32或这些核苷酸序列任一个的互补序列)。使用这些核酸序列的全部或部分，可采用标准杂交和克隆技术分离杂交探针或可溶性VEGF受体或TOGF受体分子(例如描述于 Sambrook 等(主编)，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY, 1989 ;以及Ausubel等(主编)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,NY,1993)。
[0012]可按照标准PCR扩增和装配技术，使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物，来扩增本发明的任何核酸。可将如此扩增的核酸克隆至合适的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。此外，可通过标准合成技术，例如使用自动化DNA合成仪，来制备对应于抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR核苷酸序列的寡核苷酸。
[0013]本文所用术语“寡核苷酸”是指一系列连接的核苷酸残基，所述寡核苷酸具有足够数目的核苷酸碱基用于PCR反应。短的寡核苷酸序列可以基因组或cDNA序列为基础，或者由基因组或cDNA序列设计，并且用来扩增、证实或揭示特定细胞或组织中相同、相似或互补DNA或RNA的存在情况。寡核苷酸包含长度为约10 nt、50 nt或100 nt，优选长度约15nt-30 nt的核酸序列的部分。在一个实施方案中，包含长度小于100 nt的核酸分子的寡核苷酸还可包含 SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 或 31 或其互补序列的至少6个连续核苷酸。寡核苷酸可以是化学合成的，并且可用作探针。
[0014]在其它实施方案中，本发明的分离核酸分子包含是SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、
13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示核苷酸序列的互补序列的核酸分子。与这些核苷酸序列互补的核酸分子是这样的核酸分子:与其可氢键结合的核苷酸序列充分互补且几乎没有错配或没有错配，从而形成稳定的双链体。
[0015]本文所用术语“互补”是指核酸分子的核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”意指两个多肽或化合物或相关多肽或化合物或其组合之间的物理或化学相互作用。结合包括离子、非离子、范德瓦尔斯、疏水相互作用等。物理相互作用可以是直接或间接的。间接相互作用可通过另一种多肽或化合物的作用产生或由另一种多肽或化合物的作用所致。直接结合是指相互作用不通过另一种多肽或化合物的作用而产生或者不因另一种多肽或化合物的作用所致而产生，而取而代之的是没有其它显著的化学中间体。
[0016]此外，本发明的核酸分子可只包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、
23、25、2、29或31的核酸序列的一部分，例如可用作探针或引物的片段或编码本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或I3DGF受体的任一种的生物活性部分的片段。本文提供的片段分别定义为至少6个(连续)核酸或至少4个(连续)氨基酸的序列，该长度分别在核酸的情况下足以允许特异性杂交或在氨基酸的情况下足以允许表位的特异性识别，并且比全长序列至多少一些部分。片段可来源于所选核酸或氨基酸序列的任何连续部分。衍生物是直接地或通过修饰或部分取代由天然化合物形成的核酸序列或氨基酸序列。类似物是具有类似(但又不同于)天然化合物的结构却在某些组分或侧链方面不同的核酸序列或氨基酸序列。类似物可以是合成的或来自不同的进化起源，并且与野生型相比，可具有类似或相反的代谢活性。同源物是来源于不同物种的特定基因的核酸序列或氨基酸序列。
[0017]如果衍生物或类似物含有修饰的核酸或氨基酸，则衍生物和类似物可以是全长的或非全长的。本发明的核酸或蛋白质的衍生物或类似物包括但不限于以下分子:包含在相同大小的核酸或氨基酸序列内或当与其中通过本领域已知计算机同源性程序进行比对的比对序列比较时，与本发明的核酸或蛋白质基本同源、在不同实施方案达至少约30%、50%、70%、80%或95%同一性(优选50-95%同一性)的区域，或者其编码核酸能够与编码上述蛋白质的序列的互补序列在严格、中等严格或低严格条件下杂交。参见例如AusubeI等，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993 和下文。
[0018]本发明还包括因遗传密码的简并性所致而不同于SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、
15、17、19、21、23、25、27、29或31所示核苷酸序列、但因此编码与由SEQ ID NO: 1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示核苷酸序列所编码的相同的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR蛋白的核酸分子。
[0019]在另一个实施方案中，本发明的分离核酸分子的长度为至少6个核苷酸，并在严格条件下与包含 SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 或 31 的核苷酸序列的核酸分子杂交。在另一个实施方案中，核酸的长度为至少10、25、50、100、250、500、1000,1500,2000个或更多个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的分离核酸分子与编码区例如 SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 或 31 杂交。[0020]本文所用术语“在严格条件下杂交”旨在描述彼此至少60%同源的核苷酸序列通常彼此保持杂交的杂交和洗涤条件。此外，本文所用短语“严格杂交条件”是指探针、引物或寡核苷酸将与其靶序列但不与其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同环境下将不同。与较短的序列相比，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。一般来讲，选择在规定离子强度和PH下低于特定序列热熔点(Tm)约5°C的严格条件。Tm是与靶序列互补的探针的50%与靶序列杂交达到平衡时的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)。由于靶序列一般过量存在，因此在Tm下，在平衡下50%的探针被占据。严格条件通常是以下条件:其中在PH 7.0-8.3下，盐浓度小于约1.0 M钠离子、通常约0.01-1.0 M钠离子(或其它盐)，且对于短的探针、引物或寡核苷酸(例如10 nt-50 nt)，温度为至少约30°C，而对较长的探针、引物和寡核苷酸，温度为至少约60°C。严格条件还可通过加入去稳定剂(例如甲酰胺)实现。
[0021]严格条件是本领域技术人员已知的，可见于Ausubel等(主编)，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6。优选所述条件使得彼此至少约65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%同源的序列通常保持彼此杂交。严格杂交条件的非限制性实例是在65°C下在包含6X SSC、50 mM Tris-HCl (pH7.5)、I mM EDTA、0.02% PVP、0.02% 菲可(Ficoll)、0.02% BSA 和 500 mg/ml 变性鲑精 DNA的高盐缓冲液中杂交，接着在50°C下在0.2X SSC,0.01% BSA—次或多次洗涤。中等严格杂交条件的非限制性实例是在55°C下在6X SSC、5X Denhardt溶液、0.5% SDS和100 mg/ml变性鲑精DNA中杂交，接着在37°C下在IX SSC、0.1% SDS中一次或多次洗涤。可采用的其它中等严格条件是本领域众所周知的。参见例如Ausubel等(主编)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 和 Kriegler, 1990, GeneTransfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY。低严格性杂交条件的非限制性实例是在40°C下在35%甲酰胺、5X SSC、50 mM Tris-HCl (pH 7.5),5mM EDTA、0.02% PVP、0.02% 菲可、0.2% BSAU00 mg/ml 变性鲑精 DNA、10% (wt/vol)硫酸葡聚糖中杂交，接着在 50°C下在 2X SSC,25 mM Tris-HCl (pH 7.4)、5 mM EDTA 和 0.1% SDS中一次或多次洗涤。可采用的其它低严格性条件是本领域众所周知的(例如物种间杂交所用的条件)。参见例如 Ausubel 等(主编)，1993, Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, NY和Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual, Stockton Press, NY ;Shilo和Weinberg, 1981, Proc Natl AcadSci USA 78 6789-6792。
[0022]还提供本文所述的任何核酸分子编码的多肽。例如，这些多肽可以是抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体或TOGF受体。在一些实施方案中，本文所述抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体或TOGF受体(例如优先)与VEGF结合。这些抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体与VEGF的结合或与TOGF受体联合与TOGF的结合抑制内皮细胞增殖和血管通透性。
[0023]本发明还包括与具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽有至少80%同一性的分离多肽。或者，分离多肽与具有SEQ IDNO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 或 32 的氨基酸序列的多肽的片段(即至少6个连续氨基酸)为至少80%同源。此外，本发明还包括与具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、
10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽的衍生物、类似物或同源物至少80%同源的分离多肽。同样地，本发明还提供与具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、
14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽的等位基因变体有至少80%同一性的分离多肽。本领域技术人员应认识到，这类多肽应由能够与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、
13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的核酸分子在严格条件下杂交的核酸分子编码。
[0024]本文所用术语“蛋白质”和“多肽”旨在可互换的。本发明的新多肽包括抗血管生成抗体支架和可溶性VEGF受体或TOGF受体多肽，其序列以SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、
14、16、18、20、22、24、26、28、30或32提供。本发明还包括突变或变异多肽或其功能性片段，所述多肽残基的任一个可自 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示相应残基改变而来，同时仍编码保持其抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体或TOGF受体活性和生理功能的 多肽。在突变或变异蛋白质中，多达20%或以上的残基可被如此改变。
[0025]总的来说，保持抗血管生成或可溶性VEGFR样或I3DGFR样功能的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体变体包括其中序列中特定位置上的残基被其它氨基酸取代的任何变体，并且还包括亲代蛋白质的两个残基之间插入一个或多个额外残基的可能性以及自亲代序列缺失一个或多个残基的可能性。本发明包括任何氨基酸取代、插入或缺失。在有利的情况下，取代是保守取代。
[0026]本领域技术人员应认识到，本发明还涉及分离的抗血管生成抗体支架和可溶性VEGFR或TOGFR多肽及其生物活性部分或其衍生物、片段、类似物或同源物。可采用标准蛋白质纯化技术，通过合适的纯化方案，从细胞或组织来源中分离本文所述抗血管生成抗体支架和可溶性VEGFR或TOGFR构建体。在另一个实施方案中，本发明的抗血管生成抗体支架和可溶性VEGFR或TOGFR多肽通过重组DNA技术产生。作为重组表达的备选方法，可采用标准肽合成技术，以化学方法合成抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR蛋白或多肽。
[0027]“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分基本上不含抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽来源于其中的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染性蛋白质或多肽，或者基本上不含化学合成时的化学前体或其它化学物质。用语“基本上不含细胞物质”包括抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的制备物，其中将多肽与其分离或重组产生于其中的细胞的细胞组分分离。例如，用语“基本上不含细胞物质”包括抗血管生成抗体支架或VEGFR或TOGFR多肽的制备物，所述制备物具有小于约30% (以干重计)的非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或TOGFR蛋白(本文亦称为“污染性蛋白质”)，更优选小于约20%的非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非I3DGFR蛋白，还更优选小于约10%的非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非TOGFR蛋白，最优选小于约5%非抗血管生成抗体支架或非VEGFR非TOGFR蛋白。如果抗血管生成抗体支架或VEGFR或TOGFR多肽或其生物活性部分是重组产生的，则还优选基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制备物体积的小于约20%，更优选小于约10%，最优选小于约5%。
[0028]同样地，用语“基本上不含化学前体或其它化学物质”包括抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的制备物，其中将多肽与参与多肽合成的化学前体或其它化学物质分离。例如，用语“基本上不含化学前体或其它化学物质”包括抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的制备物，其具有小于约30% (以干重计)的化学前体或非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非TOGFR化学物质，更优选小于约20%化学前体或非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非I3DGFR化学物质，还更优选小于约10%化学前体或非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非TOGFR化学物质，最优选小于约5%化学前体或非抗血管生成抗体支架或非VEGFR非TOGFR化学物质。
[0029]本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽构建体的生物活性部分包括这样的肽，其包含与抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的氨基酸序列充分同源或来源于抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，与本文所述全长抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR构建体相比包括较少氨基酸并显示本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的至少一种活性的 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 或 32 所示的氨基酸序列。通常，生物活性部分包含具有抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的至少一种活性的结构域或基序。
[0030]为了确定2个氨基酸序列或2个核酸的百分比同源性，将序列进行比对以用于最佳比较目的(例如可将空位引入第一氨基酸或核酸序列的序列中用于与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。如果第一序列的位置被与第二序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据，则该分子在该位置上是同源的(即本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。
[0031]核酸序列同源性可作为2个序列间的同一性程度来确定。同源性可应用本领域已知计算机程序确定，例如GCG程序包所提供的GAP软件。参见Needleman和Wunsch 1970J Mol Biol 48: 443-453。术语“序列同一性”是指在特定比较区内在逐个残基的基础上2个多核苷酸或多肽序列是相同的程度。术语“序列同一性百分比”如下计算:通过比较在该比较区内的2个最优比对序列，确定在2个序列中出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I，在核酸的情况下)的位置数以得到匹配位置数，将该匹配位置数除以该比较区的位置总数(即窗口大小)，将结果乘以100，得到序列同一性百分比。本文所用术语“基本同一性”表示多核苷酸序列的特性，其中多核苷酸包含在比较区内与参比序列相比具有至少80%序列同一性、优选至少85%同一性、常常90-95%序列同一性、更通常至少99%序列同一性的序列。
[0032]本发明还提供抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF或TOGFR受体嵌合或融合蛋白。本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或I3DGFR嵌合或融合蛋白可通过标准重组DNA技术产生。例如，按照常规技术，例如通过利用用于连接的平端或交错端、提供合适末端的限制性内切酶消化、适当时补平黏端、避免不需要的连接的碱性磷酸酶处理和酶促连接，将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接起来。在另一个实施方案中，可通过常规技术包括自动化DNA合成仪合成融合基因。或者，基因片段的PCR扩增可使用在两个连续的基因片段间产生互补突出端的锚定引物进行，所述基因片段可随后退火并再扩增以产生嵌合基因序列(参见例如 Ausubel 等(主编)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, 1992)。此外，许多已编码某一融合部分(例如GST多肽)的表达载体是市售可获得的。
[0033]本发明还提供含有本发明的任何核酸分子的载体。具体地讲，本发明还涉及载体、优选表达载体，其含有编码本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物的核酸。本文所用术语“载体”是指能够将另一个核酸转运到其与之连接的核酸分子上。载体的一种类型是“质粒”，其是指其中可连接额外DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中额外的DNA区段可连接至病毒基因组。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点和附加型哺乳动物载体的细菌载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与之有效连接的基因的表达。这类载体在本文称为“表达载体”。一般来讲，重组DNA技术中应用的表达载体常常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明欲包括提供等同功能的表达载体的这类其它形式，例如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和基于转座子的重组系统)。
[0034]本发明的重组表达载体包含呈适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的任何核酸，这意味着重组表达载 体包括根据待用于表达的宿主细胞选择的与待表达的核酸序列有效连接的一个或多个调节序列。在重组表达载体内，“有效连接”欲指以允许核苷酸序列表达的方式与一个或多个调节序列连接的目标核苷酸序列(例如在体外转录/翻译系统中或当载体导入宿主细胞时在宿主细胞中)。
[0035]术语“调节序列”欲包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这类调节序列描述于例如 Goeddel ;Gene Expression Technology: Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)。调节序列包括在许多宿主细胞类型中指导核苷酸序列组成型表达的调节序列和只在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应了解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。可将本发明的表达载体导入宿主细胞，从而产生蛋白质或肽，包括本文所述核酸编码的融合蛋白或肽(例如抗血管生成抗体支架、可溶性VEGFR或TOGFR多肽、抗血管生成抗体支架的突变体形式、可溶性VEGFR或TOGFR多肽的突变体形式、融合蛋白等)。
[0036]可设计本发明的重组表达载体用于在原核或真核细胞中表达本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR构建体。用于原核和真核细胞两者中的其它合适表达系统是本领域已知的(参见例如Sambrook等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.，1989,第 16 和 17 章)。
[0037]另外，本发明还提供含有这类载体(或本文所述任何核酸分子)的宿主细胞或细胞系。本文所用术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。要了解这类术语不仅仅指特定的主题细胞，而且还指这类细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰因突变或环境影响所致可出现在随后的子代中，事实上，这类子代可能并不与亲代细胞相同，但仍包括在本文所用的该术语的范围内。
[0038]宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。以非限制性实例为例，宿主细胞可以是ARPE-19细胞。然而，其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
[0039]可通过常规转化或转染技术，将载体DNA导入原核或真核细胞中。本文所述术语“转化”和“转染”欲指用于将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的各种公认技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可见于 Sambrook 等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y., 1989)和其它实验室指南。
[0040]对于哺乳动物细胞的稳定转染，要了解，根据所用的表达载体和转染技术，仅一小部分细胞可将外源DNA整合至其基因组。为了鉴定和选择这些整合子(integrant)，一般将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目标基因一起导入宿主细胞中。各种选择标记包括赋予药物(例如G418、潮霉素、甲氨蝶呤和/或杀稻瘟素)抗性的选择标记。可将位于与编码抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF或TOGF受体构建体的相同载体上的编码选择标记的核酸导入宿主细胞，或者可引入各自的载体中。用导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如掺入选择标记基因`的细胞将存活，而其它细胞则死亡)。
[0041]可使用本发明的宿主细胞，例如培养中的原核或真核宿主细胞，以产生(即表达)本文所述的任何抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽构建体。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞产生这些抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将本发明的宿主细胞(已向其中导入编码抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR的重组表达载体)在合适的培养基中培养，使得产生抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽。在另一个实施方案中，所述方法还包括从培养基或宿主细胞中分离抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或TOGFR。
[0042]同样地，本发明还提供经遗传工程改造以产生治疗量的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体的ARPE-19细胞的细胞系，其中抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或I3DGF受体由选自以下的核酸序列编码:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ IDN0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQID NO: 29和SEQ ID NO: 31。同样地，本发明还提供经遗传工程改造以产生包含选自以下氨基酸序列的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF或TOGF受体的ARPE-19细胞的细胞系:SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:32。
[0043]优选治疗量为至少I pg-1000 μ g/天/6mm装置。本领域技术人员应认识到，治疗量可以是落入该范围(包括性的)的任何量。此外，本发明的细胞系和装置能够表达该治疗量持续至少三周的一段时间。在一些实施方案中，治疗量为至少100-10,000 ng/天。在一个非限制性的实施方案中，该量为至少4 yg/天。
[0044]本文还描述了可植入细胞培养装置，所述装置含有本发明的一个或多个细胞系(即经遗传工程改造以产生治疗量的本文所述抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体或TOGFR受体的任一种的ARPE-19细胞)和围绕核心(core)的半透膜，其中所述膜允许其中的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体扩散通过。术语“囊(capsule)”和“装置”在本文可互换使用，是指含有经遗传工程改造的细胞和细胞系(例如ARPE-19细胞或细胞系)的任何生物人工器官。
[0045]在一些实施方案中，核心另外含有配置在半透膜内的基质。以非限制性实例为例，基质可包括水凝胶或胞外基质组分。例如，水凝胶可含有与多价离子交联的藻酸盐。在其它实施方案中，基质包括大量单丝，其中单丝被捻成纱或被织成网或被捻成呈无纺线的纱，且其中细胞或组织分布在上面。本领域技术人员应认识到，丝状细胞支持性基质可由选自以下的生物相容性材料制造:丙烯酸类、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙腈、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯(polybutester)、丝、棉、壳多糖、碳和/或生物相容性金属。本文所用“内部支架(internal scaffold) ”是一种适用于本发明任何装置的“基质”的非限制性实例。
[0046]在一些实施方案中，本文所述细胞包封装置还具有系链锚(tether anchor)。例如，系链锚可以是适于将所述囊锚定在眼结构上的锚环。本文所述的任何装置适于植入眼部或选自以下的另一个身体靶区:脾、耳、心脏、结肠、肝、肾、乳腺、关节、骨髓、皮下和腹膜间隙。以非限制性实例为例，可将囊植入玻璃体、水样液、眼球筋膜下间隙(Subtenon’ sspace)、眼周间隙、眼后房和/或眼前房。
[0047]本文所述装置的外罩(jacket)优选由选择性渗透的免疫隔离膜(immunoisolatory membrane)制成。例如，外罩由超滤膜或微滤膜制成。本领域技术人员应认识到，超滤膜通常具有1-100 nm的孔径大小，而微滤膜通常具有0.1-10 μ m的孔径大小。在其它实施方案中，外罩可由无孔膜材料(例如水凝胶或聚氨酯)制成。术语“外罩”和“半透膜”在本文可互换使用。
[0048]在本文所述任何装置中，可使囊成形为中空纤维或平片(flat sheet)。此外，在不同的实施方案中，至少一种额外的生物活性分子可从这些装置中共同递送。例如,至少一种额外的生物活性分子可来自非细胞或细胞源(即至少一种额外的生物活性分子由核心中的一种或多种经遗传工程改造的ARPE-19细胞产生)。
[0049]本文还提供用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患者眼部来治疗眼科病症并允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散和与眼中的VEGF和/或TOGF结合从而治疗眼科病症的方法。例如，待治疗的眼科病症可选自早产儿视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病视网膜病、年龄相关性黄斑变性、青光眼、色素性视网膜炎、白内障形成、成视网膜细胞瘤和视网膜缺血。在一个优选的实施方案中，年龄相关性黄斑变性是湿性年龄相关性黄斑变性。在另一个优选的实施方案中，眼科病症是糖尿病视网膜病。
[0050]本发明还提供用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者中并且允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与VEGF或TOGF结合来抑制内皮细胞增殖的方法，其中所述结合抑制患者的内皮细胞增殖。例如，所述病症选自血液学病症、动脉粥样硬化、炎症、血管通透性增加和恶性肿瘤。
[0051]还提供通过将本文所述可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区来将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体递送给接受宿主的方法，其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体。优选的靶区包括中枢神经系统，包括脑、脑室、脊髓或眼的水样液和玻璃体液。其它靶区可包括但不限于用于全身递送的整个身体和/或身体器官内或附近的局部靶区，例如乳腺、结肠、脾、卵巢、睾丸和/或骨髓。
[0052]本领域技术人员应认识到，在本文所述的有关眼植入和/或眼病症的任何方法中，介于0.1 Pg和1000 μ g/患者/天的本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体可从可植入细胞培养装置中扩散。然而，对于至身体其它靶区的全身植入，治疗有效量可为1000 mg/患者/天以上。本领域技术人员应认识到，对于这类全身适应症，将必须采用大得多的ECT装置。
[0053]对于眼植入,优选治疗量是介于I pg与1000 μ g/天/6 mm装置(包括性的)之间的任何量。在一些实施方案中，治疗量为至少1000 ng/天(1.0 pcd)。此外，本发明的细胞系和装置能够表达该治疗量持续至少三周的一段时间。
[0054]另外，本发明还提供用于制备本发明的可植入细胞培养装置的方法。在一种方法中，至少一种ARPE-19细胞经遗传工程改造以分泌由选自以下核酸序列编码的抗血管生成抗体支架或可溶性 VEGF 受体或 PDGF 受体:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17,SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29 和 SEQID NO: 31，且遗传修饰的ARPE-19细胞被包封在半透膜内，其中所述膜允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从中扩散通过。在另一种方法中，至少一种ARPE-19细胞经遗传工程改造以分泌包含选自以下氨基酸序列的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或 PDGF 受体:SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID N0:30 和 SEQ ID N0:32，且遗传修饰的ARPE-19细胞被包封在半透膜内，其中所述膜允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或I3DGF受体从中扩散通过。
[0055]本发明还描述了经遗传工程改造以产生本发明的任何多肽(例如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32)的一种或多种ARPE-19细胞在制备本发明的任何可植入细胞培养装置中的用途，所述装置用于治疗血管病症包括眼的血管病症，例如通过将装置植入患者眼中或在其它患病部位用于局部的和靶向的抗血管生成因子递送。
[0056]此外，可通过将装置植入患者眼中并且通过允许本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或TOGF结合，来使用本文所述的任何可植入细胞培养装置用于治疗眼科病症。
[0057]还提供经遗传工程改造以产生本发明的任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞，用于通过将本发明的任何可植入细胞培养装置植入患者眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF或TOGF结合来治疗眼科病症。
[0058]还可将本文所述的任何分离的核酸分子用于制备经遗传工程改造以产生本发明的多肽之一的一种或多种ARPE-19细胞，用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患者眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF或TOGF结合来治疗眼科病症。此外，本发明的任何分离的核酸分子也可用于治疗眼科病症，其中治疗包括将本发明的可植入细胞培养装置植入患者眼中并且允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或PDGF结合，其中所述装置中的所述一种或多种ARPE-19细胞已用所述分离的核酸分子进行遗传工程改造从而产生本文所述的任何分离的多肽。
[0059]在本文所述的任何实施方案中，血管病症选自但不限于例如早产儿视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病视网膜病、年龄相关性黄斑变性(例如湿性年龄相关性黄斑变性)、青光眼、色素性视网膜炎、白内障形成、成视网膜细胞瘤和视网膜缺血。本领域技术人员应认识到，本文所述任何装置还可用来治疗各种非眼部的血管病症。
[0060]本发明还提供经遗传工程改造以产生本发明的多肽(例如抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子)的一种或多种ARPE-19细胞在制备本发明的可植入细胞培养装置中的用途，用于通过将装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或TOGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，来抑制内皮细胞增殖。同样地，本发明还提供本发明的可植入细胞培养装置，用于通过将装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或PDGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，来抑制内皮细胞增殖。
[0061]在其它实施方案中，本发明提供经遗传工程改造以产生本发明的任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞，用于通过将本文所述的任何可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF或TOGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，来抑制内皮细胞增殖。
[0062]还考虑了本文所述的任何分离的核酸分子在制备经遗传工程改造以产生本发明的一种或多种多肽的一种或多种ARPE-19细胞中的用途，用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF或TOGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，来抑制内皮细胞增殖。
[0063]此外，本发明还提供用于抑制内皮细胞增殖的本发明的任何分离的核酸分子，治疗包括将本发明的可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或roGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，且其中所述装置中的所述一种或多种ARPE-19细胞已用所述分离的核酸分子进行遗传工程改造从而产生本发明的多肽。
[0064]本领域技术人员应认识到，细胞增殖病症可选自血液学病症、动脉粥样硬化、炎症、血管通透性增加和恶性肿瘤，并可局限于身体的各个部分，包括但不限于眼。因此，可将ECT装置置于这些局部区域附近以治疗所提及的病症。
[0065]本文还提供经遗传工程改造以产生本文所述任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞在制备本发明的可植入细胞培养装置中的用途，用于通过将装置植入接受宿主的靶区且其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或F1DGF受体,而将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或F1DGF受体递送给接受宿主。同样地，本发明的任何可植入细胞培养装置可用于通过将装置植入接受宿主的靶区，且其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体，而将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体递送给接受宿主。
[0066]此外，经遗传工程改造以产生本文所述任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞可用于通过将任何本发明的可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区，且其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体，而将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或F1DGF受体递送给接受宿主。
[0067]同样地，本文所述的任何分离的核酸分子可用于经遗传工程改造以产生本文所述任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞的制备，用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区，且其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体，而将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体递送给接受宿主。
`[0068]本文所述的任何分离的核酸分子还可用于将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或roGF受体递送给接受宿主，所述递送包括将本发明的可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区，其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体，且其中所述装置中的所述一种或多种ARPE-19细胞已用所述分离的核酸分子进行遗传工程改造从而产生本发明的任何多肽。
[0069]本领域技术人员应认识到，靶区选自中枢神经系统，包括脑、脑室、脊髓及眼的水样液和玻璃体液。其它靶区可位于身体的其它部位，并把ECT装置置于那些部位附近。各部位可包括但不限于脾、耳、心脏、结肠、肝、肾、乳腺、关节、骨髓、皮下和腹膜间隙。
[0070]另外，本发明还提供产生分离多肽的方法，所述方法包括表达本文所述的任何分离的核酸分子并收获所表达的多肽。
[0071]本发明还提供包含经遗传工程改造以产生治疗有效量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子(例如至少10，000 ng/天/IO6个细胞)的ARPE-19细胞的细胞系。优选细胞系产生治疗有效量持续至少3个月的一段时间(即3、6、9、12、15、18、21、24个月或更多个月)。
[0072]在一些非限制性的实施方案中，可采用重复转染方法，将一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子导入ARPE-19细胞。具体地讲，重复转染可以是I次转染、2次转染、3次转染或更多次转染(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次转染)。如果重复转染方法为I次转染，则细胞系将含有一种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。如果重复转染方法为2次转染，则细胞系将含有2种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。这些可以是相同或不同的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。如果重复转染方法为3次转染，将细胞系将含有3种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。这些可以是相同或不同的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。本领域技术人员应认识到，重复转染方法中的转染数将决定所得细胞系中的(相同或不同)抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的数目。
[0073]在一些实施方案中，如果重复转染为I次转染，则细胞系产生介于10,000与30，000 ng/天/IO6个细胞之间的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。优选细胞系产生大约或至少15,000 ng/天/IO6个细胞的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。在其它实施方案中，如果重复转染为2次转染，则细胞系产生介于30，000与50，000 ng/天/IO6个细胞之间的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。优选细胞系产生大约或至少35，000 ng/天/IO6个细胞的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。在另外其它的实施方案中，如果重复转染为3次转染，则细胞系产生介于50，000与75，000 ng/天/IO6个细胞之间的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。优选细胞系产生大约或至少70，000 ng/天/IO6个细胞的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。
[0074]抗血管生成分子可以是例如可溶性VEGF受体和/或可溶性TOGF受体。
[0075]可采用重复转染方法将相同的抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的多个拷贝导入ARPE-19细胞。或者，还可采用重复转染方法将不同的抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的多个拷贝导入ARPE-19细胞。
[0076]在一个实施方案 中，ARPE-19细胞是使用包含由SEQ ID N0.1的核酸序列编码的可溶性VEGF受体或含有SEQ ID N0.2的氨基酸序列的可溶性VEGF受体的载体经过遗传工程改造的。
[0077]本发明还提供包含经遗传工程改造以产生治疗有效量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子的ARPE-19细胞的任何细胞系，其中治疗有效量为至少10，000ng/ 天 /IO6 个细胞(例如至少 15，000,20, 000,25, 000,30, 000,35, 000,40, 000,45, 000、50，000,55, 000,60, 000,65, 000,70, 000,75, 000 或更多 ng/ 天 /IO6 个细胞。这类细胞系能够产生这种治疗有效量持续至少3个月(例如至少6、9、12、15、18、21或24个月)或更长。本领域技术人员应认识到，在一些实施方案中，这类细胞系可采用本文所述重复转染方法产生。然而，还可采用本领域已知的其它方法以获得治疗有效量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子的产生。
[0078]本文所述的任何细胞系可经遗传工程改造以分泌由选自以下核酸序列编码的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或I3DGF受体:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ IDN0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO: 17,SEQ ID NO: 19,SEQ ID N0:2USEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ IDN0:29和SEQ ID NO:31。同样地，本文所述的任何细胞系可经遗传工程改造以分泌包含选自以下氨基酸序列的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或TOGF受体:SEQ ID NO:2,SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:32。
[0079]本文还描述了含有核心的可植入细胞培养装置，所述核心含有本发明的一个或多个细胞系(即采用重复转染方法经遗传工程改造产生治疗有效量的本文所述的任何抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的ARPE-19细胞或经遗传工程改造以分泌至少10,000 ng/天/IO6个细胞的ARPE-19细胞)和包绕核心的半透膜，其中所述膜允许一种或多种抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子从中扩散通过。
[0080]在一些实施方案中，核心含有0.5-1.0 X IO6个细胞。
[0081]核心还可含有配置在半透膜内的基质。在其它实施方案中，基质包括大量单丝，其中单丝被捻成纱或被织成网或被捻成呈无纺线的纱，且其中细胞或组织分布在上面。本领域技术人员应认识到，单丝可由选自以下的生物相容性材料制成:丙烯酸类、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙腈、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯、丝、棉、壳多糖、碳和/或生物相容性金属。例如，单丝为包含介于装置内体积的40-85%的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维。
[0082]本文所述细胞包封装置还可具有系链锚。例如，系链锚可以是适于将装置锚定在眼结构上的锚环。[0083]可将本文所述的任何装置植入(或用于植入)眼或身体的另一个靶区，例如脾、耳、心脏、结肠、肝、肾、乳腺、关节、骨髓、皮下和/或腹膜间隙。以非限制性实例为例，可将装置植入(或用于植入)玻璃体、水样液、眼球筋膜下间隙、眼周间隙、眼后房和/或眼前房。
[0084]本文所述装置的半透膜优选由选择性渗透的免疫保护膜(immunoprotectivemembrane)制成。在其它实施方案中，半透膜由超滤膜或微滤膜制成。本领域技术人员应认识到，半透膜通常具有约100 nm的中值孔径大小。
[0085]在另外其它的实施方案中，半透膜由无孔膜材料(例如水凝胶或聚氨酯)制成。在本文所述的任何装置中，半透膜的标称分子量截止值(MWCO)为500 kD。优选半透膜厚度为约90-120 um之间。本文所述的任何装置可配置成中空纤维或平片。装置的长度可为约4mm-11 mm之间。在一些实施方案中，装置具有介于约0.9 mm-1.2 mm之间的内径。在一个优选的实施方案中，装置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封。
[0086]本发明的任何装置可包括以下额外特性的1、2、3、4、5、6、7个或全部:
a.核心含有介于0.5-1.0 X IO6个之间的ARPE-19细胞；
b.装置的长度为4mm-11 mm之间；
c.装置的内径为0.9-1.2 mm之间；
d.装置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封；
e.半透膜具有约100nm的中值孔径大小；
f.半透膜的标称分子量截止值(MWCO)为500kD ；
g.半透膜的厚度为90-120μπι之间；
h.核心含有内部支架，其中支架包含占装置内体积40-85%的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维；和
1.其任何组合。
[0087]此外，在不同的实施方案中，至少一种额外的生物活性分子可从这些装置中共同递送。例如，至少一种额外的生物活性分子可来自非细胞或细胞源(即至少一种额外的生物活性分子由核心中的一种或多种经遗传工程改造的ARPE-19细胞产生)。
[0088]本发明还提供本发明的任何可植入细胞培养装置将合适治疗剂量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子递送至受试者眼中的用途，其中治疗剂量为至少 100 ng/天 / 眼(例如至少 100、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000ng/天/眼或更多)。同样地，本发明还提供一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子，用于通过将合适治疗剂量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子递送到受试者眼中来治疗需要治疗的受试者，其中治疗剂量为至少100 ng/天/眼(例如至少 100、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000 ng/天 / 眼或更多)。
[0089]本文还提供用于治疗眼科病症的方法，所述方法通过将本发明的任何可植入细胞培养装置植入患者眼中并且允许抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或TOGF结合，从而治疗眼科病症。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗眼科病症的细胞系(即本文所述的任何细胞系)，其中将细胞系掺入可植入细胞培养装置中、其中将装置植入患者眼中，且其中抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或TOGF结合，从而治疗眼科病症。
[0090]例如，待治疗的眼科病症可选自早产儿视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病视网膜病、年龄相关性黄斑变性、青光眼、色素性视网膜炎、白内障形成、成视网膜细胞瘤和视网膜缺血。在一个优选的实施方案中，年龄相关性黄斑变性是湿性年龄相关性黄斑变性。在一个优选的实施方案中，眼科病症是糖尿病视网膜病。
[0091]本发明还提供用于抑制内皮细胞增殖或血管形成的方法，所述方法通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者中，并且允许抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从装置中扩散并与VEGF和/或TOGF结合，其中所述结合抑制患者的内皮细胞增殖或血管形成。例如，所述病症可选自血液学病症、动脉粥样硬化、炎症、血管通透性增加和恶性肿瘤。在这类方法中，每天每患者的治疗有效量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从装置中扩散。`
[0092]还提供将抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子递送给接受宿主的方法，所述方法如下进行:通过将本文所述的任何可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区，其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。优选的靶区可包括但不限于中枢神经系统，包括脑、脑室、脊髓、眼的水样液和玻璃体液、脾、耳、心脏、结肠、肝、肾、乳腺、关节、骨髓、皮下和/或腹膜间隙。其它靶区可包括但不限于用于全身递送的整个身体和/或身体器官内或附近的局部靶位点，例如乳腺、结肠、脾、卵巢、睾丸和/或骨髓。在这类方法中，每天每患者的治疗有效量的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子扩散至靶区。
[0093]本领域技术人员应认识到，在本文所述的有关眼植入和/或眼病症的任何方法中，每天每患者的治疗有效量的本发明的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从可植入细胞培养装置中扩散。例如，介于0.1 Pg与1000 μ g/患者/天之间的本发明的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子可从可植入细胞培养装置中扩散(例如进入一个或多个靶区)。
[0094]本发明还提供用于制备本发明的可植入细胞培养装置的方法。例如，通过遗传工程改造至少一种ARPE-19细胞以分泌一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子(例如由选自以下核酸序列编码的那些:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29 和 SEQID NO: 31)，并将遗传修饰的ARPE-19细胞包封在半透膜内，其中所述膜允许抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从中扩散通过。在一个优选的实例中，本发明的抗血管生成分子是可溶性VEGF受体和/或可溶性I3DGF受体。
[0095]除非另有限定，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述方法与材料类似或等同的方法与材料可用于实施或测试本发明，但下面描述了合适的方法与材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用以其整体予以结合。在有冲突的情况下，将以本申请(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例只是说明性的，并非旨在限制性的。
[0096]根据下列详述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显然的。
[0097]附图简述
图1是显示pCpGfree-vitro表达载体(InvivoGen)图谱的示意图。
[0098]图2显示用表达分子p834的细胞进行的细胞系筛选和命中测定(hitdetermination)的实例。
[0099]图3显示分子p834和p873的蛋白质印迹结果和分子p834的SDS-PAGE结果。
[0100]图4显示p834和p8 38的HUVEC生物测定。
[0101]图5显示p834的溶液结合测定。
[0102]图6显示表达p834的细胞系的稳定性。
[0103]图7显示保存在容器中4周后p834 ECT装置的组织切片。
[0104]图8显示植入新西兰白兔眼中3个月后移出的p834 ECT装置的组织学。
[0105]图9显示质量与效能图中产生834蛋白的细胞系的P⑶。对第一、第二和第三转染/重复细胞系作图。
[0106]图10显示通过用p963和p964转染的细胞产生的TOGFR β Fe融合蛋白的检测ELISA。
[0107]图11显示产生roGFR-Dl-D5_hIgGl Fe的克隆细胞系的实例。
[0108]图12显示分泌抗血管生成分子包括单克隆抗体、Fab片段、单链抗体和受体Fe的代表性细胞系。
[0109]图13显示体外ECT方式中代表性Mab、ScFv、Fab和受体Fe细胞系的装置蛋白质产量。
[0110]图14是显示p834、p873和P917的相对结构的示意图。
[0111]图15是p834、p873和p917的序列比对。
[0112]图16是p834和阿柏西普的序列比对。
[0113]图17是显示自组合荷载装置分泌的I3DGFR-Fc和VEGFR-Fc的抗TOGFR加上抗Fe检测的蛋白质印迹。
[0114]发明详述
蛋白质是用于治疗眼疾病的治疗剂的主要类别。然而，基于大的抗体的蛋白质药物不能够旁路通过(bypass)血-视网膜屏障，因此，需要重复眼内给药进行治疗。之前已表明在人的临床试验中，包封细胞技术(encapsulated cell technology,ECT)眼内装置可在2年的进程中将生物治疗剂持续递送到眼，从而表明该项技术也可扩展到其它眼用生物制剂中，例如与湿性AMD有关的眼用生物制剂。
[0115]合成了代表抗体支架生物制剂的主要类别的cDNA序列，包括例如完全抗体、抗体Fab片段、单链(ScFv)抗体和融合受体-Fe分子。使用cDNA表达载体以产生分泌基于所需抗体的生物制剂的稳定的人细胞系。随后将细胞系包封，以产生眼用ECT植入物。通过ELISA测定蛋白质分泌的速率。
[0116]培养的克隆细胞系分泌抗体支架蛋白质的全部类别，许多与基于CHO-细胞系的制造系统等同。克隆细胞系显示稳固的重组蛋白分泌，一些细胞系的水平接近200-20，000ng/100万个细胞/天(20 pcd)。在一些实施方案中，可采用1、2、3次或更多次转染的重复转染方法对细胞进行遗传工程改造。出乎意料的是，重复DNA转染和选择显著增加细胞系产生重组蛋白的能力，所述重组蛋白分泌50，000 ng/100万个细胞/天至大于70，000 ng/100万个细胞/天(70 pcd)。可采用重复转染方法将相同或不同的抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的多个拷贝导入细胞(例如ARPE-19细胞)。用包括I次转染的重复转染方法产生的分子可称为“第一代”分子。用包括2次转染的重复转染方法产生的分子可称为“第二代”分子。用包括3次转染的重复转染方法产生的分子可称为“第三代”分子。
[0117]已成功地将产生基于活性抗体支架的生物制剂和受体融合蛋白的细胞系包封，且最初以高达50-1000 ng/天的水平检出来自单个ECT装置的重组蛋白的初期产量。随后重复DNA转染的细胞系联合培养基优化，提高眼用ECT装置水平直到4，000-10，000 ng/天。
[0118]因此，这些ECT装置可为用于大的生物分子的有效药物递送平台，所述生物分子包括用于眼部适应症以及局部和/或全身适应症的抗体、抗体支架和/或受体融合蛋白。
[0119]血管内皮生长因子(VEGF)是参与血管发生(胚胎循环系统形成)和血管生成(自预先存在的血管系统的血管生长)两者的信号转导蛋白。虽然VEGF主要以其对血管内皮的作用而著称，但它还影响各种各样的其它细胞类型，例如刺激单核细胞/巨噬细胞迁移、神经元、癌细胞、肾上皮细胞等。
[0120]在VEGF家族内有许多蛋白质，这是由于mRNA可变剪接的结果而引起。各种剪接变体影响VEGF的功能，因为它们决定所得蛋白质是促血管生成还是抗血管生成。另外，剪接变体还影响VEGF与细胞表面上的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)和neuripilin共同受体的相互作用，这进而提高VEGF结合并激活VEGF信号转导受体(VEGFR)的能力。
[0121]VEGF剪接变体作为糖基化二硫键结合的二聚体从细胞中释放。在结构上，VEGF属于半胱氨酸结(cysteine-knot)生长因子的F1DGF家族，因此,存在几种密切相关的蛋白质，即胎盘生长因子(P1GF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D，它们一起构成生长因子的VEGF亚家族。VEGF本身常被称为VEGF-A，从而与这些其它的相关生长因子区分开来。
[0122]蛋白质的VEGF