专利名称：重组可溶性组织因子及其制备方法和应用的制作方法 组织因子(Tissue Factor，TF)是凝血因子VII(VIIa)的受体和催化协同因子，TF与凝血因子VIIa形成二元复合物，可以激活凝血因子X和凝血因子IX，从而启动外源性凝血途径。TF是唯一不存在于血液循环中的凝血因子，在血管内皮细胞内含量丰富，一旦血管壁损伤，便释放入血液循环中，与凝血因子VII(因子VIIa)结合后共同启动凝血，发挥凝血和止血功能。由于TF是外源性凝血途径中唯一的外源因子，因此临床检验中通过加入TF启动凝血以判断凝血功能，即凝血酶原时间(简称PT)测定。PT测定广泛应用于口服抗凝治疗的监测、术前常规检测、先天性凝血因子缺乏等疾病的诊断，还可以用于肝脏合成功能的评价。由于TF来源缺乏，临床检验中常用兔脑粉替代TF。随着重组DNA技术的发展，本发明用基因工程生产重组TF，经磷脂化后替代兔脑粉用于PT检测，而且重组TF的应用有利于PT试验的标准化[TripodiA.，et al(1992)Thromb-Haemost.67(1)，41-45.]。全长TF是分子量为47kD的糖蛋白，由263个氨基酸组成；为跨膜受体蛋白质，分子中有三个结构域，1-219残基为胞外区，229-242残基为疏水的跨膜区，243-263残基为胞内区。TF胞外区为可溶性TF，(简称sTF)与因子VIIa高亲和地结合，并作为因子VIIa的辅助因子，增强其对因子X转化为.因子Xa的酶解激活作用[Rehemetulla A.et a1.(1991)J.Biol.Chem.266(16)10294-10299.Stone M.J.，et al(1995)Biochem.J.310，605-614.]。
本发明的目的是提供一种重组可溶性组织因子，即将组织因子C-末端缺失突变后，去除其跨膜区与胞内区，只保留了胞外区编码顺序，得到具有与组织因子同样活性的突变体，命名为重组可溶性组织因子(简称r-sTF)。本发明还提供置备r-sTF的方法，包括制备能表达具有生物活性的r-sTF cDNA基因；与表达载体重组；用该载体转染宿主细胞；培养该宿主细胞；以及纯化r-sTF。本发明应用基因工程方法对可溶性组织因子进行生产，所得产品具有高效的促凝血功能，并且制备工艺简便、安全。本发明还提供了利用重组可溶性组织因子r-sTF与磷脂进行磷脂化后，制备新型凝血酶原时间PT检测试剂盒本发明中从胎盘组织中分离胎盘总RNA，并且用RT-PCR的方法克隆缺失突变的可溶性组织因子cDNA。获得的cDNA与质粒pUC19重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证cDNA基因。然后与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体，例如pLY-4等。上述重组表达载体按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述基因。在一优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌JF1125等。本发明的表达产物以包涵体的形式存在于菌体中，匀浆机破菌后分离包涵体。包涵体溶解后，复性并分离和纯化所需产品。
本发明采用所得r-sTF在Cd2+的存在下磷脂化后冻干，加Ca2+制成PT检测试剂盒。
本发明中重组可溶性组织因子的磷脂化，并不限于某种磷脂或生物组织磷脂制剂，在一优选实施方案中，本发明使用了卵磷脂和磷脂酰丝氨酸。

实施例1 设计、制备r-sTF(1)克隆r-sTF基因、构建表达质粒r-sTF-pLY-4按照sTF的氨基酸顺序，依照大肠杆菌偏好密码子设计引物序列。采用RT-PCR的方法扩增该基因并与pUC19重组，转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片断，证实获得阳性克隆。核苷酸序列分析证实基因序列正确。然后将sTF基因切出，并与大肠杆菌表达载体pLY-4重组，构建原核表达质粒r-sTF-pLY-4。质粒r-sTF-pLY-4转化大肠杆菌JF1125，抽提质粒并做相应的酶切分析。质粒片段与理论片段一致者为阳性克隆。本发明所采用限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、JF-1125，质粒pUC19，pLY-4为本室保存。
(2)筛选高效表达r-sTF的菌株挑取上述阳性克隆接种于5ml LBA培液中，30℃快速振摇(250RPM)，培养过夜。次日按1∶50接种于5ml M9CA培液中，30℃继续振摇培养约3小时，使其测定光密度OD600达到1.00左右，留样后将培养温度升高至42℃，继续振摇培养3小时，离心收集细菌。
诱导前后的细菌分别用1x上样缓冲液悬浮后，沸水浴煮5分钟，20ul上样，作还原性SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia Imagenaster VDS扫描定纯度、分子量。结果显示诱导后的细菌裂解液在相应分子量处有一浓集的条带，而诱导前的细菌裂解液没有。经扫描，目的蛋白约占菌体总蛋白的40％左右。以表达水平高的克隆为工程菌株。
诱导后的细菌，用超声破菌并离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定，结果表明，表达产物是以非活性的包涵体的形式存在于菌体中。
用变性剂溶解包涵体，并稀释后，表达产物表现出TF活性。
上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行。
(3)发酵工程菌取上述筛选高表达菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划LBA平板，30℃温箱培养过夜。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于50ml LBA培养液中，30℃振摇培养8小时。此为一级种子液，再将一级种子液按1∶10接种于500ml LBA中，30℃振摇培养8小时，，此为二级种子液。种子菌按1∶10比例接种于4L M9CA培液中，调节发酵参数，温度30℃，pH6.9溶解氧保持在50％以上，并与搅拌连动。继续培养6小时，将培养温度提高到42℃，继续诱导培养3小时，停止发酵，离心收集细菌。发酵工程菌的表达水平大于40％。
(4)破菌制备包涵体将发酵工程菌按湿重体积以1∶20的比例，用0.02M PB(pH 8.0)悬浮，高压匀浆泵破菌，压力保持在45-50MP，离心收集沉淀即为包涵体。用洗涤液洗涤包涵体。
(5)r-sTF复性。
洗涤后的包涵体用8M尿素溶解，用含有谷胱甘肽的复性液，稀释20倍。4℃搅拌复性过夜。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，以10倍体积的20mmol/LPB(pH 8.0，0.5M尿素)平衡，复性后的r-sTF离心后上清，直接上柱，上柱结束后，用20mmol/L PB(pH 8.0)继续洗脱至基线，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB，pH 8.0)线性梯度洗脱，收集有r-sTF活性组分，并进行纯度分析。
所有色谱操作均为常规操作。
(7)纯度鉴定及分子量测定取纯化样品进行12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia Inagemaster?VDS扫描测定纯度，所得产品纯度95％以上。
5L发酵罐可生产r-sTF 2克，比活性大于5万单位/mg，纯度大于95％。
实施例2 制备PT检测试剂盒(1)r-sTF磷脂化取卵磷脂和磷脂酰丝氨酸溶于0.25％脱氧胆酸溶液中，浓度为5mg/ml，然后与100mM CdCl2和TBSA(0.05MTris，0.1MnaCl，0.1％BSA，pH7.5)按1∶10比例混合，配成磷脂化溶液。r-sTF溶液适当稀释后加入等体积的磷脂化液，使终浓度达到10万单位/ml。37℃保温2小时后，按3万单位/每瓶分装，冻干，-40℃保存。
(2)Ca2+溶液0.5ml 50mMCaCl2溶液/瓶。
(3)1瓶冻干的磷脂化sTF与1瓶Ca2+溶液包装成PT检测试剂盒，每盒为30人份。
(4)PT检测冻干的磷脂化TF 37℃ 1.5ml注射用水复溶，继续保温30分钟以上，经适当稀释后取50ul加入硅化过的玻璃试管内，加入正常人血浆100ul，37℃保温1分钟，加入50ul 50mM CaCl2，测定凝血时间。
30人份正常人血浆测定结果表明，本发明所生产的PT检测试剂盒国际灵敏度指数(简称ISI)值为1.07，而对照的兔脑粉ISI值为1.27。标准ISI值为1.00。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。所有这些变更和改进均包括在所附权利要求的保护范围之内。
重组可溶性组织因子的核甘酸序列和氨基酸序列TCA GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GCA TAT AAT TTA ACTSer Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu ThrTGG AAA TCA ACT AAT TTC AAG ACA ATT TTG GAG TGG GAATrp Lys Ser Thr Asn phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp GluCCC AAA CCC GTC AAT CAA GTC TAC ACT GTT CAA ATA AGCPro Lys Pro Val Asn Gln Val Thr Thr Val Gln Ile SerACT AAG TCA GGA GAT TGG AAA AGC AAA TGC TTT TAC ACAThr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr ThrACA GAC ACA GAG TGT GAC CTC ACC GAC GAG ATT GTG AAGThr Lys Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val LysGAT GTG AAG CAG ACG TAC TTG GCA CGG GTC TTC TCC TACAsp Val Lys Gln Thr Thr Leu Ala Arg Val Phe Ser TyrCCG GCA GGG AAT GTG GAG AGC ACC GGT TCT GCT GGGPro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala GlyGAG CCT CTG TAT GAG AAC TCC CCA GAG TTC ACA CCT TACGlu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro TyrCTG GAG ACA AAC CTC GGA CAG CCA ACA ATT CAG AGT TTTLeu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser PheGAA CAG GTG GGA ACA AAA GTG AAT GTG ACC GTA GAAGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
GAT GAA CGG ACT TTA GTC AGA AGG AAC AAC ACT TTC CTAAsp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe LeuAGC CTC CGG GAT GTT TTT GGC AAG GAC TTA ATT TAT ACASer Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr ThrCTT TAT TAT TGG AAA TCT TCA AGT TCA GGA AAG AAA ACALeu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys ThrGCC AAA ACA AAC ACT AAT GAG TTT TTG ATT GAT GTG GATAla Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val AspAAA GGA GAA AAC TAC TGT TTC AGT GTT CAA GCA GTG ATTLys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val IleCCC TCC CGA ACA GTT AAC CGG AAG AGT ACA GAC AGCPro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp SerCCG GTA GAG TGT ATG GGC CAG GAG AAA GGG GAA TTTPro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu PheAGAArg


本发明属生物技术领域，涉及重组可溶性组织因子(r－sTF)及其制备方法，和采用.r－sTF与磷脂等制备成新型凝血酶原时间(PT)检测试剂盒。本发明根据对全长组织因子的结构及其生化特性的分析，设计了新型r－sTF。将突变后可溶性组织因子基因与原核表达载体重组，转化大肠杆菌，筛选高表达工程菌，经发酵扩增，离心收集发酵工程菌后，匀浆泵破菌，离心收集包涵体，包涵体溶解，r－sTF复性后经一步法纯化r－sTF。所得产品与磷脂及Cd