专利名称：猪4-1bb受体，编码其的基因及其应用的制作方法中国是一个猪肉生产和消费大国，然而目前猪瘟、繁殖和呼吸综合症(蓝耳病， PRRSV)等疫病严重流行是我国养猪行业面临的最大困难，因此疫病防控成为稳定和发展养猪业亟待解决的重大问题。然而，近年来猪病普遍呈现多病原交叉混合感染，猪的抗病能力和疫苗的防治效果明显降低。因此要做好疫病防控工作，需要寻找疫苗研发的新策略，或者寻求替代或辅助途径，如培育出具有抗病性的新品种猪。然而已有的研究成果多致力于利用特定疾病抗性基因培养单一抗病特性的家畜新品种。而这种策略显然与当前我国养猪业疫病多发的现实状况差距太大。因此，培育出具有广谱抗病性的新品种猪成为众多科研人员的理想。适应性免疫应答反应在动物抵抗病原体侵袭过程中发挥着至关重要的作用。T细胞的活化更是该反应的重中之重。近年来的研究证明，T细胞的有效激活需要双信号刺激。 一是MHC-抗原肽与TCR结合产生的第一信号，二是共刺激受体，主要是4-1BB等受体与其配体结合产生的第二信号。在正常的机体微环境下，抗原递呈细胞递呈出来的抗原肽往往数量较少，其与TCR的结合不足以活化T细胞，容易造成T细胞反应无能。而T细胞共刺激受体4-1BB等提供的共刺激信号通路可以弥补较弱的TCR信号，从而激活T细胞。再者，当 TCR与抗原肽的亲和不足时，往往难以活化T细胞，而足够的共刺激信号也能起到增强TCR 信号通路的作用，从而激活T细胞。总之，足够的共刺激信号，既可以克服TCR占有率较少的问题，还可以弥补TCR亲和力的不足。因此共刺激受体介导的信号能增强适应性免疫系统功能，从而具备成为广谱抗病基因候选的潜能。4-1BB分子(亦名⑶137)自1989年被发现以来，其在共刺激信号通路上所起的重要作用日趋明朗。与其配体4-1BBL相结合传递的信号主要作用是增强CD8T细胞的活性和记忆性T细胞的抗病毒活性，同时也加强了 T细胞功能信号的放大和对病原物的有效清除。 而4-1BB分子在记忆性T细胞对抗原再次产生作用时也介导传递必须的信号。另外，4-1BB 还在获得性免疫调控中同时扮演介导肿瘤清除和预防自身免疫疾病的双重角色。4-1BB受体对T细胞免疫反应的建立、增强及其维持都具有重要作用，这预示着他们作为靶基因在转基因育种研究及应用中具有良好的前景。但是目前绝大多数共刺激分子相关研究都是基于基因敲除或者是利用抗4-1BB的单抗来除去或者增强共刺激信号的方式进行的。这些策略明显不适于育种研究。再者，猪的4-1BB受体目前只有预测的基因序列信息被公布，其确切的编码序列及其蛋白功能在此之前均未有报道。
本发明的目的在于提供一种猪4-1BB受体，编码其的基因及其应用。为实现上述目的，本发明首先提供猪4-1BB受体分子，其为由SEQ ID NO. 3或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。这两个猪4-1BB受体分子的氨基酸长度分别为255 (变体1)和241 (变体2、，两者之间的同源性高达94. 5%，受体分子2仅比受体分子1在靠近羧基端缺少连续的14个氨基酸。SEQ ID NO. 3所示的为猪4-1BB变体1的氨基酸序列，SEQ ID NO. 4所示的为猪4-1BB 变体2的氨基酸序列。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明猪4-1BB受体还包括由SEQ ID NO. 3或4所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID NO. 3或4所示的蛋白质衍生的蛋白质。例如在 4-1BB两个变体的胞外区，将第79位的丝氨酸替换为苏氨酸，或是将第107位的谷氨酰胺缺失，或是在198位后面增加3个脯氨酸。优选的，衍生蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No. 3或4所示的氨基酸序列的同源性可为70%以上，优选80%以上，更优选90%以上。本发明还提供编码上述蛋白的基因。优选的，本发明提供的编码猪4-1BB受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1或2所示。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明还提供的含有猪4-1BB受体基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。本发明还提供所述的猪4-1BB受体在提高猪广谱抗病性中的应用。如通过制备抗猪4-1BB单抗来研制生物制剂，以口服或注射方式给药后，该单抗与4-1BB受体的结合可增强T细胞激活所需的第二信号，进而增强T细胞免疫反应，提高猪的抗病能力。本发明还提供上述的猪4-1BB受体基因在培育广谱抗病性猪中的应用。具体方法为1)将猪4-1BB受体基因克隆到真核表达载体上，或通过体外转录的方法获得猪 4-1BB受体基因mRNA ；2)利用电穿孔法将制备的重组载体或mRNA导入猪胚胎细胞；3)获得4-1BB表达水平上调，从而广谱性抗病性提高的转基因猪。本发明基于共刺激受体4-1BB的转基因策略是动物育种研究的一项新型策略。将共刺激受体4-1BB特异性地高表达于T细胞，可以增强T细胞在受到抗原刺激时的激活、增殖和细胞因子分泌活性，进而增强宿主后天性免疫应答、增强疫苗免疫效果。所以，本领域技术人员可以预见转基因动物个体培育成功后，在病原感染时的免疫功能及其抗病能力也将明显提高。基于高表达4-1BB的策略，与培养单一抗病特性的家畜新品种相比，可以更有效地地增强宿主在受到多病原交叉混合感染时的抗病能力，并提高疫苗效果。图1是载体pMax-4-ΙΒΒΗΑ构成模式图，其中pCMV 巨细胞病毒(CMV)启动子，可调控目的基因在真核细胞内表达的启动子；4-1BB-HA:猪4-1BB与HA标签的融合蛋白的基因编码区，HA标签是编码一个HA (流感病毒血细胞凝集素抗原决定簇)短肽的一段基因序4列，可用来检测所融合蛋白的表达情况；SV40:是是猴空泡病毒40mRNA末端的一段多聚腺苷酸残基，具有终止转录、增强RNA的稳定性的作用。图2是猪外周血单个核细胞(PBMC)转染pMax-4-ΙΒΒΗΑ质粒后，用Western blot 方法检测其外源蛋白表达情况。图3是猪外周血单个核细胞(PBMC)转染pMax-4-ΙΒΒΗΑ质粒后在受到抗原 (PRRSV)刺激24h后，其T细胞激活marker⑶25分子的转录水平明显提高。对照未经转染的猪PBMC经PRRSV感染后⑶25转录水平；空转染空转染的猪PBMC经PRRSV感染后 ⑶25转录水平；4-1BB 经pMax-4-ΙΒΒΗΑ质粒转然后的猪PBMC经PRRSV感染后⑶25转录水平)。图4是猪外周血单个核细胞(PBMC)转染pMax-4-ΙΒΒΗΑ质粒后在受到抗原 (PRRSV)刺激24h后，其PBMC细胞内IFN-γ转录水平明显提高。


本发明提供猪4-1BB受体分子，其为1)由SEQ ID NO.3或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或2)在SEQ ID NO.3或4所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明还提供编码其的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或2所示。本发明提供的共刺激受体4-1BB特异性地高表达于猪的外周血T细胞，可以增强转基因T细胞在受到抗原刺激时的激活、增殖和细胞因子分泌活性，进而增强宿主后天性免疫应答、增强疫苗免疫效果。