专利名称：一种富含谷胱甘肽酵母的制备方法谷胱甘肽(GSH)是一种抗氧化肽，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种同时含有Y -谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物，具有清除自由基、解毒、抑制衰老、预防糖尿病和癌症、抑制艾滋病毒、提高人体免疫力等重要生理功能，在医学、食品、化妆品等领域具有广泛的市场前景。谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、酶法和发酵法。其中发酵法是最 具潜力的方法。但目前国内谷胱甘肽的发酵生产存在以下几个方面的问题1、产谷胱甘肽的微生物谷胱甘肽合成产率低；2、谷胱甘肽合成过程中的代谢调控不完善；3、谷胱甘肽在水溶液中极易被氧化，导致在谷胱甘肽提取过程中损失大。由于这些因素的制约，使谷胱甘肽的生产受到很大的影响。谷胱甘肽在水溶液中极易被氧化，因此微生物细胞合成的谷胱甘肽一般存在于细胞中。酵母是谷胱甘肽合成最具潜力的微生物，且酵母富含蛋白质，在食品和医药工业中具有广泛的用途，生产谷胱甘肽含量高的酵母既能作为食品和医药工业的原料，同时也可以提供丰富的功能性成分谷胱甘肽，对改善人体机能具有非常重要的作用。
本发明的目的在于提供一种富含谷胱甘肽酵母的制备方法，可以有效解决微生物谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的问题，拓宽富含谷胱甘肽干酵母在烘焙领域的应用范围，提闻广品附加价值。为了实现本发明，发明人通过大量试验反复研究，并终于获得了如下生产方法 一种富含谷胱甘肽酵母的制备方法，包括将酵母菌接种于培养基中进行培养的步骤，所述的酵母菌为酿酒酵母cerevisiae、CICC1532。所述富含谷胱甘肽酵母的制备方法，其中所述的酵母菌经多次培养、发酵、分离洗涤、干燥而成。所述富含谷胱甘肽酵母的制备方法，其中所述的多次培养分别为试管斜面活化培养和培养瓶液体种子培养。所述富含谷胱甘肽酵母的制备方法，其中所述的发酵步骤为摇瓶发酵，发酵工艺条件为28-32°C培养56-64小时，在培养18-20小时，一次性添加谷氨酸8-12mmol/L、半胱氛酸 8_12mmol/L、甘氛酸 5_7mol/L 和 ATP I. 6-1. 7mg/L。所述富含谷胱甘肽酵母的制备方法，在培养18-20小时，一次性添加谷氨酸10mmol/L、半胱;氛酸 10mmol/L、甘氛酸 6mol/L 和 ATP I. 67mg/L。所述富含谷胱甘肽酵母的制备方法，摇瓶发酵培养基含有葡萄糖25. 95g/L，酵母粉 11. 47g/L，硫酸铵 10. 16g/L，磷酸二氢钾 2g/L，硫酸镁 O. 2g/L，ρΗ5· 5-6. O。所述富含谷胱甘肽酵母的制备方法，其中所述的发酵步骤为发酵罐发酵，发酵工艺条件为采用流加碳源和氮源的方法，在30L发酵罐中发酵44 50h，发酵温度28 32°C，搅拌转速100 600rmp，通气量5 30L/min，碳源流加速度10mL/h-600mL/h，氮源流加速度10mL/h-50mL/h，发酵液中酒精的含量控制在O. 1% O. 5% (W/V)，在生物量达到一定时，一次性添加谷氨酸25 35mmol/L、半胱氨酸25 35mmol/L、甘氨酸15 20mol/L和ATP 3 8mg/L，调节转速和通气量使溶氧浓度控制在1X10_3 8X10_2 mmol · L—1，并流加20mL/h 50mL/h碳源到发酵结束。所述富含谷胱甘肽酵母的制备方法，在生物量达到一定时，一次性添加谷氨酸30mmol/L、半胱;氛酸 30mmol/L、甘氛酸 18mol/L 和 ATP 5mg/L。所述富含谷胱甘肽酵母的制备方法，其中发酵罐发酵培养基含有酵母粉100g/L，pH5. 5-6. O ;所述流加的碳源和氮源为含糖量29%的糖蜜(6L)、含糖量29%的葡萄糖(4L)、硫酸铵264g和磷酸二氢铵40g。 所述富含谷胱甘肽酵母的制备方法，其中所述干燥采用喷雾干燥或低温快速干燥；所述的喷雾干燥是在喷雾干燥塔中，控制进风温度130-150°C进行干燥。本发明涉及的富含谷胱甘肽酵母的制备方法具有如下优点和显著的进步酵母的胞内谷胱甘肽含量高达35-45mg/g，对面团改良效果好，解决了单独添加谷胱甘肽的改良面团存在的成本高及极易被氧化等问题，提高了产品附加价值。另外，本发明筛选并培养出富含谷胱甘肽酵母，无需进行谷胱甘肽的提取和纯化，还原型谷胱甘肽存在于酵母细胞内，在进行加工处理过程中避免还原型谷胱甘肽的氧化和降解。该发明使得还原型谷胱甘肽直接和酵母细胞一齐使用，通过细胞保护作用减少谷胱甘肽的氧化。由于不需要进行谷胱甘肽的提取和纯化，因此不存在谷胱甘肽的损失问题，产品的活性损失也小。 酿酒酵母cereFisiaeOCICCISS〗,湖北工业大学生物工程209实验室保藏。(2)培养基 每IL所述斜面培养基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，琼脂20g，所述斜面培养基 ρΗ5· 8-6. 2 ； 每IL所述种子培养基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，所述斜面培养基ρΗ5· 8~6. 2 ；
每IL所述摇瓶水平上发酵培养基含有葡萄糖25. 95g，酵母粉11.47g，硫酸铵
10.16g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁O. 2g，所述发酵培养基pH5. 5-6. O ；(3)种子扩大培养
斜面种子活化12-16小时后接入装入种子培养基的三角瓶中培养，装液量25-30mL，12-18小时即得一级种子；
(4)发酵培养
将一级种子接入 25mL/250mL 摇瓶中，在 28°C _30°C、转速 180rmp/min-200rmp/min 的条件下培养50-60h,在培养19小时,一次性添加谷氨酸10mmol/L、半胱氨酸10mmol/L、甘氨酸 6mol/L和 ATP I. 67mg/L。(5)胞内谷胱甘肽的提取
取一定体积的菌液于离心管中，5000rpm离心IOmin收集菌体，蒸馏水洗涤两次后，用蒸馏水悬浮，摇匀后放入冰箱冰冻过夜，将冰冻的菌体在95 100°C条件下水浴lOmin，取 出后在冰水中速冷，5000rpm离心lOmin，上清液作为测试样品。(6)细胞干重的测定
一定的发酵液离心后用蒸馏水洗涤2次，得到的新鲜细胞在105°C烘干至恒重。(7) 谷胱甘肽含量的测定 采用碘量法。(8) 粉质曲线
将300g面粉与富含谷胱甘肽的干酵母混合置于揉面钵中，用滴定管加定量的水，在定温下开机揉成面团。根据揉制面团过程中动力消耗情况，得到面团形成时间，面团稳定时间，弱化度等一系列参数，绘制粉质曲线。(9) 结果
发酵时间56小时；细胞干重12. 5g/L ；
胞内谷胱甘肽含量40mg/g ;谷胱甘肽产量500mg/L ；
0.3%的富含谷胱甘肽的干酵母添加面团形成时间5. 5min ;面团稳定时间5. 7 ;弱化度65 ；
0.5%的富含谷胱甘肽的干酵母添加面团形成时间4. 3min ;面团稳定时间4. 3min ;弱化度94 ；
1.0%的富含谷胱甘肽的干酵母添加面团形成时间3. 4min ;面团稳定时间2. 3min ;弱化度143。
实施例二 30L发酵罐上采用流加发酵培养制备富含谷胱甘肽酵母 Cl)菌株
酿酒酵母cereFisiaeOCICCISS〗,湖北工业大学生物工程209实验室保藏。(2)培养基
每IL所述斜面培养基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，琼脂20g，所述斜面培养基 ρΗ5· 8-6. 2 ；
每IL所述种子培养基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，所述斜面培养基ρΗ5· 8~6. 2 ；
每IL所述摇瓶上发酵培养基含有葡萄糖25. 95g，酵母粉11. 47g，硫酸铵10. 16g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁O. 2g，所述发酵培养基pH5. 5-6. O ；
每IL所述发酵罐水平上发酵培养基含有水9L，酵母粉100g，所述发酵培养基ρΗ5· 5-6. O ；
流加发酵培养基含糖量29%的糖蜜(6L)，含糖量29%的葡萄糖(4L)，硫酸铵264g，磷酸二氢铵40g.
(3)种子培养
斜面种子活化14小时后，接入装入25mL种子培养基的250mL三角瓶中培养12-18小时即得一级种子；之后再按10%(V/V)的接种量将一级种子接入相同发酵培养基培养12-18小时制备二级种子，培养温度28-32°C，恒温培养振荡器，转速200rpm ；
(4)发酵培养
变速流加发酵将准备好的二级种子按10%的接种量接入装有9L底水的全自动发酵罐中，发酵温度28-32°C，搅拌转速350rmp，通气量15L/min。通过控制碳源和氮源的流加速度(碳源流加速度10mL/h-600mL/h，氮源流加速度10mL/h_50mL/h)，同时发酵液中酒精的含量控制在O. 3%(ff/V),使菌体在较短时间内达到较高水平。在生物量达到一定时，一次性添加前体氨基酸，维持一定的转速和通气量，并流加35mL/h碳源到发酵结束。(5)胞内谷胱甘肽的提取
取一定体积的菌液于离心管中，5000rpm离心IOmin收集菌体，蒸馏水洗涤两次后，用蒸馏水悬浮，摇匀后放入冰箱冰冻过夜，将冰冻的菌体在95 100°C条件下水浴lOmin，取出后在冰水中速冷，5000rpm离心lOmin，上清液作为测试样品。(6)细胞干重的测定
一定的发酵液离心后用蒸馏水洗涤2次，得到的新鲜细胞在105°C烘干至恒重。(7)谷胱甘肽含量的测定 采用碘量法。(8)粉质曲线
将300g面粉与富含谷胱甘肽的干酵母混合置于揉面钵中，用滴定管加定量的水，在定温下开机揉成面团。根据揉制面团过程中动力消耗情况，得到面团形成时间，面团稳定时间，弱化度等一系列参数，绘制粉质曲线。(9)结果
发酵时间47小时；细胞干重46g/L ；
胞内谷胱甘肽含量35-40mg/g ;谷胱甘肽产量1814mg/L ；
O.3%的富含谷胱甘肽的干酵母添加面团形成时间5. 5min ;面团稳定时间5. 7 ;弱化度65 ；
0.5%的富含谷胱甘肽的干酵母添加面团形成时间4. 3min ;面团稳定时间4. 3min ；弱化度94 ；
1.0%的富含谷胱甘肽的干酵母添加面团形成时间3. 4min ;面团稳定时间2. 3min ；弱化度143。实施例三在60立方发酵罐上采用流加发酵培养 Cl)菌株
酿酒酵母cereFisiaeOCICClSSZ,湖北工业大学生物工程209实验室保藏。(2)培养基
每IL所述斜面培养基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，琼脂20g，所述斜面培养基 ρΗ5· 8-6. 2 ；
每IL所述一级种子培养基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，所述斜面培养基 pH5. 8-6. 2 ；
每IL所述二级种子培养基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，所述斜面培养基 pH5. 8-6. 2 ；
每IL所述三级种子培养基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，所述斜面培养 基 pH5. 8-6. 2 ；
每IL所述发酵罐水平上发酵培养基含有水16立方，酵母粉200kg，所述发酵培养基ρΗ5· 5-6. O ；
流加发酵培养基含糖量29%的糖蜜(10立方)，含糖量29%的葡萄糖(7立方)，硫酸铵528kg,磷酸二氢铵80kg ；
(3)种子培养
斜面种子活化12-16小时后，接入装入25mL种子培养基的250mL三角瓶中培养12-18小时即得一级种子；之后再按10% (V/V)的接种量将一级种子接入相同发酵培养基培养12-18小时制备二级种子，培养温度28-32°C，恒温培养振荡器，转速200rpm ;之后再按10%(V/V)的接种量将二级种子接入相同发酵培养基的2立方发酵罐中培养12-18小时制备三级种子；
(4)发酵培养基
变速流加发酵将准备好的三级种子全部接入装有35立方底水的60立方发酵罐中，发酵温度28-32 °C，通气量800-7000L/min。通过控制碳源和氮源的流加速度(碳源流加速度40mL/h-2000mL/h，氮源流加速度25mL/h_200mL/h)，同时发酵液中酒精的含量控制在
O.P/o-O. 5%(W/V)，使菌体在较短时间内达到较高水平。在生物量达到一定时，一次性添加前体氨基酸，维持500L/min-1000L/min的通气量，并流加50mL/h-100mL/h碳源到发酵结束。(5)胞内谷胱甘肽的提取
取一定体积的菌液于离心管中，5000rpm离心IOmin收集菌体，蒸馏水洗涤两次后，用蒸馏水悬浮，摇匀后放入冰箱冰冻过夜，将冰冻的菌体在95 100°C条件下水浴lOmin，取出后在冰水中速冷，5000rpm离心lOmin，上清液作为测试样品。(6)细胞干重的测定
一定的发酵液离心后用蒸馏水洗涤2次，得到的新鲜细胞在105°C烘干至恒重。(7)谷胱甘肽含量的测定 采用碘量法。(8)粉质曲线
将300g面粉与富含谷胱甘肽的干酵母混合置于揉面钵中，用滴定管加定量的水，在定温下开机揉成面团。根据揉制面团过程中动力消耗情况，得到面团形成时间，面团稳定时间，弱化度等一系列参数，绘制粉质曲线。(9)结果发酵时间44-50小时；细胞干重30-45g/L ；
胞内谷胱甘肽含量35-45mg/g ;谷胱甘肽产量1000mg/L-2000mg/L ；
O.3%的富含谷胱甘肽的干酵母添加面团形成时间5. 5min ;面团稳定时间5. 7 ;弱化度65 ；
0.5%的富含谷胱甘肽的干酵母添加面团形成时间4. 3min ;面团稳定时间4. 3min ；弱化度94 ；
1.0%的富含谷胱甘肽的干酵母添加面团形成时间3. 4min ;面团稳定时间2. 3min ；弱化度143。


本发明涉及一种富含谷胱甘肽酵母的制备方法，通过优化培养条件和流加策略以及相关工艺手段，可以获得一种富含谷胱甘肽的高效面团酵母的产品。本发明的方法可以有效解决普通干酵母中谷胱甘肽含量低，对面团改良效果差及单独添加谷胱甘肽改良面团成本高及极易被氧化等问题，提高产品附加价值的方法。