专利名称：突变δ9延伸酶和它们在制备多不饱和脂肪酸中的用途的制作方法人们正研究包括植物、藻类、真菌、原生藻菌和酵母在内的多种不同宿主作为商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产的手段。基因工程已表明，一些宿主(即使那些天然限于亚麻酸[“υν”；18:2Ω-6]和α-亚麻酸[“ALA” ； 18:3 ω-3]脂肪酸生产的宿主)可进行实质上的改造以产生对多种长链《-3/co-6PUFA的高水平生产。无论这是天然能力还是重组技术的结果，花生四烯酸[“ARA”;20:4gj-6]、二十碳五烯酸[“ΕΡΑ”;20:5ω-3]、二十二碳五烯酸[“DPA”;22:5gj-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”;22:6co-3]可能均需要Λ 9延伸酶基因的表达。特化的Λ 9延伸酶具有将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”;20:2 ω -6]，以及将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”；20:3co-3]的能力。然而，仅仅鉴定出少量的Λ9延伸酶。这些酶包括来自绿光等鞭金藻(Isochrysis galbana)的Δ9延伸酶[“IgD9e”] (SEQ IDNO:1 和 2 ；PCT 公开 W02002/077213、W02005/083093, W02005/012316 和 W02004/057001 ；GenBank登录号AAL37626、来自小型绿藻属(Eutr印tiella sp.) CCMP389的Λ9延伸酶[“E389D9e”] (SEQ ID NO: 3 和 4 ;美国专利 7，645，604)、来自小眼虫(Euglena gracilis)的 Λ9 延伸酶[“EgD9e”] (SEQ ID NO:7 和 8 ;美国专利 7，645，604)、以及来自 Euglenaanabaena 的 Λ 9 延伸酶[“EaD9e”] (SEQ ID NO: 11 和 12 ;美国专利 7，794，701)。尽管美国专利7，645，604鉴定出在EgD9e、E389D9e和IgD9e延伸酶之间保守的七种基序，但是仅仅使用IgD9e进行了一项研究来鉴定对于Λ9延伸酶功能性而言重要的氨基酸残基(Qi，B.等,FEBS Lett.,547:137-139 (2003))。不存在来自△ 9延伸酶的可用晶体结构以指导对所述蛋白质的基因进化，并且对于△ 9延伸酶序列、结构和功能之间的关系了解甚少。尽管缺乏了解，对于在能够制备PUFA的生产宿主细胞中以高酶活性进行有效表达的△ 9延伸酶基因仍然存在需求。已经发现了良好地适用于在商业可用的宿主细胞中整合进入PUFA生物合成途径的具有高活性的新型Λ9延伸酶突变体。令人惊异并且出乎意料的是，据发现，特定的点突变产生了 Λ 9延伸酶突变体，所述Λ 9延伸酶突变体的酶活性基于LA向EDA的转化是野生型酶的96%至145%。
在第一实施例中，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含:(a)编码突变多肽的核苷酸序列，所述突变多肽具有Λ 9延伸酶活性且具有如SEQID NO:22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID Ν0:22与SEQ ID NO: 10具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自:i)L35F 突变；ii)L35M 突变；iii)L35G 突变；iv)L35G突变和至少一种选自下列的其它突变:S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；v)L35G、W132T 和 I179R 突变;vi) L35G、S9D、Y84C 和 1179R 突变；vii)L35G、A21V、L108G 和 I179R 突变；viii)L35G、Y84C、I179R 和 Q244N 突变；ix)L35G、A21V、W132T、I179R 和 Q244N 突变；X) K58R 和 I257T 突变；xi)D98G 突变；xii)L130M 和 V243A 突变；以及xiii)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自:K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y 和 I257T ；(b)部分(a)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成且是100%互补的。所述分离的多核苷酸可具有选自下列的核苷酸序列:SEQ ID NO:28, SEQ IDN0:31、SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:58,SEQ ID N0:61、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQID NO:106 和 SEQ ID NO:109。在第二实施例中，本发明涉及具有Λ9延伸酶活性的突变多肽，所述突变多肽由权利要求1的分离的多核苷酸编码。所述突变多肽可具有选自下列的蛋白质序列:SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:59,SEQ IDNO:62,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO: 10USEQ ID NO: 104,SEQ ID NO: 107 和 SEQ ID NO: 110。在第三实施例中，所述突变多肽具有Λ 9延伸酶活性，所述Λ 9延伸酶活性至少大致在功能上等同于如SEQ ID NO: 10所示的多肽的Λ 9延伸酶活性。优选地，当与如SEQID NO: 10所示的多肽的亚油酸向二十碳二烯酸的底物转化百分比相比时，所述突变多肽的亚油酸向二十碳二烯酸的底物转化百分比为至少110% (B卩，对应于至少10%的活性改善)，并且更优选地，所述突变多肽的亚油酸向二十碳二烯酸的底物转化百分比为至少120%(SP，对应于至少20%的活性改善)。在第四实施例中，本发明涉及重组构建体，其包含权利要求1的分离的多核苷酸，所述重组构建体可操作地连接至少一种调控序列。在第五实施例中，本发明涉及转化的细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸。所述转化的细胞可优选地选自植物、细菌、酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌。在第六实施例中，本发明涉及转化的含油酵母，所述含油酵母产生其干细胞重量 的至少约25%的油，所述含油酵母包含(a)至少一种重组DNA构建体，其包含本发明的分离的多核苷酸；以及(b)至少一种重组DNA构建体，其包含可操作地连接至少一种调控序列的分离的 多核苷酸，所述构建体编码选自下列的多肽Δ4去饱和酶、Δ 5去饱和酶、Δ 8去饱和酶、 Δ 6去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ 12去饱和酶、Δ 15去饱和酶、17去饱和酶、C14/16延伸酶、 Cl6/186延伸酶、C18/2l延伸酶和C20/22 延伸酶；其中所述转化的含油酵母可产生选自下列的长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸、 二十碳二烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二高亚麻酸、二十二碳四 烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。更具体地,本发明的转基因含油酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在第七实施例中，本发明涉及生产多不饱和脂肪酸的方法，其包括a)提供含油酵母，所述含油酵母包含i)可操作地连接至少一种调控序列的重组构建体，其中所述重组构建体包含编码 突变多肽的分离的多核苷酸，所述突变多肽具有A 9延伸酶活性且具有如SEQ ID N0:22所 示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 22与SEQ ID NO: 10具有至少一个氨基酸突变的差异，所 述突变选自(a) L35F 突变；(b) L35M 突变；(c) L35G 突变；(d)L35G突变和至少一种选自下列的其它突变S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、 Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、 L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；(e)L35G、W132T 和 I179R 突变;(f) L35G、S9D、Y84C 和 I179R 突变；(g)L35G、A21V、L108G 和 I179R 突变； (h) L35G、Y84C、I179R 和 Q244N 突变；(i)L35G、A21V、W132T、I179R 和 Q244N 突变；(j) K58R 和 I25H 突变；(k) D98G 突变；(1) L130M 和 V243A 突变；以及(m)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自K58R、L35F、L35G、L35M、 S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、 L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、 A254W、A254Y 和 I257T ;以及ii)选自亚油酸和a-亚麻酸的底物脂肪酸来源；b)使步骤(a)的酵母在使编码具有A 9延伸酶活性的突变多肽的重组构建体表达 且使所述底物脂肪酸转化成产物脂肪酸的条件下生长，其中亚油酸转化成二十碳二烯酸并且α-亚麻酸转化成二十碳三烯酸；以及c)任选地回收步骤(b)的产物脂肪酸。在第八实施例中，本发明涉及微生物油，所述微生物油获自本发明的含油酵母。在第九实施例中，本发明涉及重组微生物宿主细胞，所述重组微生物宿主细胞产生油，所述油包含以干细胞重量的重量百分比测量的至少22.5重量％的二十碳五烯酸，所述重组微生物宿主细胞包含至少一种本发明的突变Δ9延伸酶多肽。牛物保藏下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA20110-2209),并具有下列名称、保藏号和保藏日期。

本文公开了具有将亚油酸[18:2，LA]转化成二十碳二烯酸[20:2，EDA]和/或将α-亚麻酸[18:3，ALA]转化成二十碳三烯酸[20:3，ETrA]的能力的突变Δ9延伸酶。本文还公开了分离的核酸片段和包含编码突变Δ9延伸酶的此类片段的重组构建体，以及用这些突变Δ9延伸酶在含油酵母中制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的方法。