专利名称：一个人肝癌相关基因及其编码产物与应用的制作方法 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是严重危害人民健康的重大疾病，据报道，全世界原发性肝癌每年的新病人数超过100万人，其中70％集中在亚洲。我国肝癌约占全世界肝癌的40-45％，每年新生肝癌患者45万，并且呈不断上升趋势。肝癌不仅发病率高，而且隐匿、进展快、复发率和死亡率高，被称为“癌中之王”。到医院就诊的肝癌患者大多为中或晚期，若不治疗自然病程仅3-6个月。阐明肝癌的发病机制将有助于肝癌的预防、诊断和治疗。早期诊断是提高疗效、降低死亡率的关键。目前所用的肝癌诊断标志物AFP在约30％肝癌患者为阴性，而在一些良性肝病患者又可以出现AFP的大幅度升高，造成鉴别诊断的困难。肿瘤在本质上是细胞的遗传性疾病。与肝癌相关的基因虽已发现很多，但肝癌发生、发展的机制仍然不甚明了。目前发现的原癌基因按其编码产物在细胞的定位及功能大体可以归为四类，一类是编码生长因子的基因，包括sis、int-2、hst、fgf-5；第二类是编码生长因子受体的基因，包括erbB、erbB-2、fms、met、ros等；第三类是编码细胞质中信号传导分子的基因，包括abl、src、ras、raf、yes、fgr、fes、lck、mos等；第四类是编码细胞增殖与凋亡调控分子的基因，包括，bcl-1、bcl-2等；第五类是编码细胞核里同DNA相结合的蛋白质(转录因子)的基因，例如myc、myb、fos、jun、B-lym、ski、ets、rel等基因。研究证实，和HCC的发生密切相关的主要有ras、src、myc、met、p53等基因。
本发明的目的是提供一个新的人肝癌相关基因及其编码产物。本发明所提供的人肝癌相关基因名称为LAPTM4B，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №4或SEQ ID №5蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №2或3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。所述序列表中的SEQ ID №1由954个碱基组成，是一个完整的读码框，SEQ ID№1具有两个起始位点，一个是自5’端1-3位碱基，另一个是自5’端274-276位碱基。序列SEQ ID №1的完整cDNA有两个，具有不同的加尾信号，当SEQ ID №1的5’向外延伸85个碱基，3’ 向外延伸401个碱基，即得到序列表中的SEQ ID №2，该基因由1440个碱基组成；当SEQ ID №1的5’向外延伸85个碱基，3’ 向外延伸1130个碱基，即得到序列表中的SEQ ID №3，该基因由2169个碱基组成。基因LAPTM4B定位于染色体8q22.1。人肝癌相关蛋白LAPTM4B，是具有序列表中序列4或/和序列5氨基酸序列的蛋白质，或者是将序列4或/和序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列4或/和序列5的氨基酸序列相同活性的由序列4或/和序列5衍生的蛋白质。
序列表中的序列4由317个氨基酸残基组成，由SEQ ID №1的全序列编码，分子量35kDa，推定等电点为9.05；序列表中的序列5由226个氨基酸残基组成，由SEQ ID №1中第274-954位碱基编码，分子量为24kDa，推定等电点为4.65。
SEQ ID №4及SEQ ID №5两种蛋白质均具有四段穿膜序列，一个可能的N糖基化位点和典型的溶酶体定位信号，皆属于四次穿膜的蛋白质超家族，但分别具有不等的磷酸化位点。实验表明，SEQ ID №4 LAPTM4B可能与质膜中的生长因子受体(如EGF-R)及整合素α6亚单位(细胞外基质层粘连蛋白的特异性受体)形成复合物，可能具有将来自于生长因子及细胞外基质两方面的增殖信号在质膜偶联在一起的功能。这将进一步阐明正常真核细胞生长的定着依赖性 (即除需要来自于生长因子的刺激信号之外，还需要来自于一定的细胞外基质的刺激信号才能启动细胞增殖)的分子机制，在阐明细胞增殖的调控机制上具有突破性意义。实验证明，LAPTM4B蛋白C端的酪氨酸残基可发生磷酸化，从而可形成与胞内信号分子SH2结构域结合的位点；同时，N端序列具有Pro富集区及典型的SH3结构域的结合位点。指明SEQ ID №4 LAPTM4B蛋白可能是一个在信号转导中具有重要作用的停靠蛋白，可以召集相关的信号分子来完成细胞增殖的信号转导。实验证明，以SEQ ID №4的cDNA转染小鼠NIH3T3细胞系，结果转染细胞的增殖加速，对血清的依赖性降低，并可在NIH小鼠生成恶性纤维肉瘤。以SEQ ID №5的cDNA转染人肝癌细胞HLE细胞系，转染细胞难以形成克隆，而以SEQ ID №4的cDNA转染的同一细胞系则可形成大量的大个克隆。这些结果表明SEQ ID №5 LAPTM4B蛋白与SEQ ID №4 LAPTM4B蛋白具有相脖的不同功能。
基因LAPTM4B在正常肝组织低表达，而在96.88％(31/32)人肝癌组织中表达显著上调，在部分配对非癌肝组织中可见表达轻度升高。在大多数肝癌细胞系的表达水平也较高。此外，LAPTM4B在某些肿瘤细胞系及人体某些正常组织也有不同程度的广泛表达，其中以睾丸、心肌及骨骼肌的表达较高。含有SEQ ID №1、2、3所述序列的表达载体及含有SEQ ID №1、2、3序列的转染细胞系均属于本发明的保护范围。
本发明的蛋白质可作为肝癌早期诊断的新指标，通过采用适于在临床上广泛应用的ELISA法，以及所制备的相关检测试剂盒，可以提高原发性肝癌的早期诊断率及诊断的准确率。还可将LAPTM4B基因作为肝癌治疗的靶基因，例如可通过最新发展的siRNA干扰技术阻抑LAPTM4B基因的表达；还可将LAPTM4B蛋白作为药物作用的新靶点，研制以LAPTM4B蛋白为靶点的新药。因而据此，有可能开发出抗肝癌的新途径，这是一项将产生重大社会效益的工程。
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步说明。


图1为Nortern Blot分析图谱。
图2为免疫细胞化学分析的切片图。
图3为Western Blot分析图谱。
图4为Western Blot分析图谱。
图5为细胞生长曲线。
图6为细胞生长曲线。
图7为本发明cDNA转染的细胞对小鼠的致瘤作用。
图8为肝癌患者血清中的LAPTM4B抗原水平直方图。

实施例1、Nortern Blot分析LAPTM4B在增殖/分化状态不同的四种肝组织中的表达选择增殖/分化状态不同的四种肝组织，即正常成年肝(极少增殖，终末分化)、胎肝(旺盛增殖，低度分化)、肝癌(失控增殖，异常分化)及配对非癌肝组织(活跃增殖的癌前肝细胞)进行Nortern Blot分析，从5例正常成年肝，5例胎肝，32例肝癌，32例配对非癌肝组织的新鲜标本提取RNA，经电泳分离、转移至尼龙膜，以Dig标记的探针进行杂交，于68℃洗膜，按说明书显示杂交信号。结果如图1所示，其中泳道1是胎肝，泳道2是正常成年肝，泳道3、5、7、9是肝癌，泳道4、6、8、10是配对非癌肝组织，结果表明，LAPTM4B在各种肝组织的表达水平依次为肝癌＞配对非癌肝组织和胎肝＞正常成年肝。
实施例2、LAPTM4B的克隆选择增殖/分化状态不同的四种人类肝组织，即正常成年肝(NL)、胎肝(FL)、肝癌(HCC)及配对非癌肝组织(PNL)，通过荧光差异显示技术得到了未知基因的cDNA片段(LC27)，以LC27片断(426bp)为基础向5’方向进行EST同源序列拼接，并通过RACE及高温RT-PCR实验得到基因的全长cDNA序列，即为SEQ ID №2和3。
实施例3、免疫细胞化学分析LAPTM4B的定位将生长良好的人肝癌细胞系BEL-7402细胞用4％多聚甲醛固定在载玻片上，室温30分钟。PBS洗后为了消除内源性过氧化物酶在含3％过氧化氢的甲醇溶液中作用15分钟。经0.05％Tween 20/PBS漂洗后，加10％牛血清白蛋白温育切片37℃30分钟。加适当稀释的特异性抗体(抗LAPTM4B之10肽的多克隆抗体，1100)，4℃湿盒内孵育过夜，PBS漂洗后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，于37℃湿盒内孵育30分钟。PBS漂洗，依次用DAB显色，用Meyer’s苏木精复染核，常规脱水、透明、封固，镜下观察。结果如图2所示，表明LAPTM4B定位于细胞的膜结构，包括细胞内膜，可能还有质膜。
实施例4、亚细胞组分的Western Blot分析分别将HCC，、PNL和NL组织在匀浆液中(150mM NaCl，10mM Tris PH7.4，0.5％Triton X-100，5mM EDTA，1mM PMSF)充分匀浆，经差速离心分离细胞核、线粒体和膜组分。将三个组分分别进行SDS-PAGE电泳，以LAPTM4B的多克隆抗体进行杂交。结果如图3所示，其中N是细胞核，M是细胞膜，Mit是线粒体，图中泳道1、2、3为肝癌；泳道4、5、6为配对非癌肝组织，泳道7、8、9为正常成年肝，结果表明，LAPTM4B存在于细胞的膜组分，而不存在于细胞核及线粒体。
实施例5、TritonX114分级萃取物的Western Blot分析将外科手术切除的人HCC，PNL和NL组织在匀浆液中(150mM NaCl，10mM TrisPH7.4，1％Triton X-114，5mM EDTA，1mM PMSF)充分匀浆，离心去除残渣。于200μl上清液中加入300μl含6％蔗糖，0.06％Triton X-114的TBS液，37℃孵育5分钟。离心后分为水相(上层)和去垢相(下层)，在水相中加入1％Triton X-114在冰上作用10分钟，37℃孵育5分钟，离心后收集水相并与前一次水相合并，重复操作一次。向水相和去垢相分别加入含2％Triton X-114的TBS液洗涤两次。然后分别加入两倍体积的冷无水乙醇沉淀蛋白质，离心后将沉淀的蛋白质溶解于上样缓冲液中，进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测。结果如图4所示，图中泳道A是分相前的匀浆液，泳道B是分相后的水相。泳道C是分相后的去垢相，结果表明LAPTM4B存在于去垢剂相，说明TAPTM4B蛋白存在于细胞的膜性结构。
实施例6、全长cDNA转染实验证明本发明基因对细胞增殖的调控作用构建含LAPTM4B基因全长cDNA序列(2.16kb)的表达载体pcDNA-LAPTM4B，转染小鼠NIH3T3细胞，筛选稳定高效表达LAPTM4B的克隆，通过酸性磷酸酶法测定细胞数，绘制细胞生长曲线；通过流式细胞术检测细胞周期；以Western Blot检测细胞周期蛋白的表达水平。结果表明，以含其全长cDNA的表达质粒转染的NIH3T3细胞，细胞增殖加速，如图5所示，表明细胞周期蛋白cyclinE的表达明显增强；同时，转染细胞的增殖对血清(生长因子)的依赖性降低，如图6所示，表明该基因可能参与细胞增殖的调控，其过表达(活化)可能与细胞的增殖失控有关。
实施例7、cDNA转染的细胞对小鼠的致瘤作用随机取6周龄NIH雄性小鼠分为三组生理盐水注射的对照组，空载质粒转染的MOCK细胞接种的对照组和含全长cDNA质粒转染的细胞接种的实验组。每只小鼠于右腋皮下接种2×106细胞。每组4-6只。21天后断颈处死，进行解剖。结果如图7所示，可以看到实验组有两只小鼠形成了明显的中等恶性度的纤维肉瘤(A、B)，另两只的接种部位为淋巴组织(C、D)。而两个对照组的12只小鼠至接种86天后均无肿瘤生成。
实施例6及例7的结果及其表达谱表明，LAPTM4B可能是一个新的原癌基因。
实施例8、以ELISA初步分析肝癌患者血清中的LAPTM4B抗原水平将96孔板每孔加入不同稀释倍数的HCC患者血清或正常人血清包被，4℃过夜。各孔用含0.5％Tween-20的PBS液漂洗后，加入2％BSA液于室温封闭1hr。加入不同稀释倍数的兔抗LAPTM4810肽抗体，于室温孵育2hr，用PBS液漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶1000倍稀释)于室温孵育2hr。经PBS漂洗，加入1μg/ml邻苯二胺显色10-15分钟后，加入H2SO4终止反应，用酶标仪于490nm波长下读数，检测抗原。结果如图8所示，表明，肝癌患者血清中存在较正常人水平高的LAPTM4B抗原。指明LAPTM4B有望成为肝癌诊断的新指标。
序列表<160>5<210>1<211>954<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>1atgacgtcac ggactcgggt cacatggccg agtccgcccc gccccctccc cgtccccgcc60gctgcagccg tcgccttcgg agcgaagggt accgacccgg cagaagctcg gagctctcgg120ggtatcgagg aggcaggccc gcgggcgcac gggcgagcgg gccgggagcc ggagcggcgg180aggagccggc agcagcggcg cggcgggctc caggcgaggc ggtcgacgct cctgaaaact240tgcgcgcgcg ctcgcgccac tgcgcccgga gcgatgaaga tggtcgcgcc ctggacgcgg300ttctactcca acagctgctg cttgtgctgc catgtccgca ccggcaccat cctgctcggc360gtctggtatc tgatcatcaa tgctgtggta ctgttgattt tattgagtgc cctggctgat420ccggatcagt ataacttttc aagttctgaa ctgggaggtg actttgagtt catggatgat480gccaacatgt gcattgccat tgcgatttct cttctcatga tcctgatatg tgctatggct540acttacggag cgtacaagca acgcgcagcc tggatcatcc cattcttctg ttaccagatc600tttgactttg ccctgaacat gttggttgca atcactgtgc ttatttatcc aaactccatt660caggaataca tacggcaact gcctcctaat tttccctaca gagatgatgt catgtcagtg720aatcctacct gtttggtcct tattattctt ctgtttatta gcattatctt gacttttaag780ggttacttga ttagctgtgt ttggaactgc taccgataca tcaatggtag gaactcctct840gatgtcctgg tttatgttac cagcaatgac actacggtgc tgctaccccc gtatgatgat900gccactgtga atggtgctgc caaggagcca ccgccacctt acgtgtctgc ctaa 954<210>2<211>1440<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>2gccgactagg ggactggcgg agggtgcacg ctgatggatt tactcaccgg gtgcttggag60ctccagcagc tggctggagc ccgcgatgac gtcacggact cgggtcacat ggccgagtcc120gccccgcccc ctccccgtcc ccgccgctgc agccgtcgcc ttcggagcga agggtaccga180cccggcagaa gctcggagct ctcggggtat cgaggaggca ggcccgcggg cgcacgggcg240
agcgggccgg gagccggagc ggcggaggag ccggcagcag cggcgcggcg ggctccaggc300gaggcggtcg acgctcctga aaacttgcgc gcgcgctcgc gccactgcgc ccggagcgat360gaagatggtc gcgccctgga cgcggttcta ctccaacagc tgctgcttgt gctgccatgt420ccgcaccggc accatcctgc tcggcgtctg gtatctgatc atcaatgctg tggtactgtt480gattttattg agtgccctgg ctgatccgga tcagtataac ttttcaagtt ctgaactggg540aggtgacttt gagttcatgg atgatgccaa catgtgcatt gccattgcga tttctcttct600catgatcctg atatgtgcta tggctactta cggagcgtac aagcaacgcg cagcctggat660catcccattc ttctgttacc agatctttga ctttgccctg aacatgttgg ttgcaatcac720tgtgcttatt tatccaaact ccattcagga atacatacgg caactgcctc ctaattttcc780ctacagagat gatgtcatgt cagtgaatcc tacctgtttg gtccttatta ttcttctgtt840tattagcatt atcttgactt ttaagggtta cttgattagc tgtgtttgga actgctaccg900atacatcaat ggtaggaact cctctgatgt cctggtttat gttaccagca atgacactac960ggtgctgcta cccccgtatg atgatgccac tgtgaatggt gctgccaagg agccaccgcc1020accttacgtg tctgcctaag ccttcaagtg ggcggagctg agggcagcag cttgactttg1080cagacatctg agcaatagtt ctgttatttc acttttgcca tgagcctctc tgagcttgtt1140tgttgctgaa atgctacttt ttaaaattta gatgttagat tgaaaactgt agttttcaac1200atatgctttg ctggaacact gtgatagatt aactgtagaa ttcttcctgt acgattgggg1260atataatggg cttcactaac cttccctagg cattgaaact tcccccaaat ctgatggacc1320tagaagtctg cttttgtacc tgctgggccc caaagttggg catttttctc tctgttccct1380ctcttttgaa aatgtaaaat aaaaccaaaa atagaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1440<210>3<211>2169<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>3gccgactagg ggactggcgg agggtgcacg ctgatggatt tactcaccgg gtgcttggag60ctccagcagc tggctggagc ccgcgatgac gtcacggact cgggtcacat ggccgagtcc120gccccgcccc ctccccgtcc ccgccgctgc agccgtcgcc ttcggagcga agggtaccga180cccggcagaa gctcggagct ctcggggtat cgaggaggca ggcccgcggg cgcacgggcg240agcgggccgg gagccggagc ggcggaggag ccggcagcag cggcgcggcg ggctccaggc300gaggcggtcg acgctcctga aaacttgcgc gcgcgctcgc gccactgcgc ccggagcgat360gaagatggtc gcgccctgga cgcggttcta ctccaacagc tgctgcttgt gctgccatgt420ccgcaccggc accatcctgc tcggcgtctg gtatctgatc atcaatgctg tggtactgtt480
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本发明公开了一个人肝癌相关基因及其编码产物，该基因为是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2或SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。可以将本发明的蛋白质做为肝癌早期诊断的新指标，利用适于在临床上广泛应用的ELISA法和所制备的检测试剂盒，可以提高原发性肝癌的早期诊断率及诊断的准确率。并可将LAPTM4B基因作为肝癌治疗的靶基因，例如可通过最新发展的siRNA干扰技术阻抑LAPTM4B基因的表达；还可将LAPTM4B蛋白作为药物作用的新靶点，研制以LAPTM4B蛋白为靶点的新药。因而，有可能开发出抗肝癌的新途径，这是一项将产生重大社会效益的工程。