专利名称：用BsrFI鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的试剂盒的制作方法SNP(单核苷酸多态性)是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基的置换、插入和缺失等形式。SNP现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析、关联分析及疾病易感基因的定位，指导易感基因克隆。聚合酶链式反应-限制性片断长度多态(PCR-RFLP)技术是一种快速、简便、准确、低成本检测SNP基因型的经典方法。该方法原理是限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4 6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定DNA等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的替换或插入、缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切割后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。该方法主要优点在于操作简便，快速，终点判断准确。主要缺点在于酶切位点的选择，并不是所有的SNP位点都可以使用该方法来鉴别，且部分内切酶价格昂贵。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是一种重要的叶酸代谢酶，体内催化5，10-亚甲基四氢叶酸还原为体内最主要的甲基供体5-甲基四氢叶酸，具有重要的生理功能。目前研究发现编码该蛋白的基因缺陷与动脉硬化性血管阻塞性疾病密切相关，还是胎儿神经管畸形及癌症发生的遗传因素。人MTHFR基因定位于染色体1P36. 3，该基因第十二外显子A/G碱基变异可引起第594位氨基酸变异(Gln/Arg)，文献中常记为1793A/G多态，该多态可能影响MTHFR的功能。美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)可查阅MTHFR基因及其多态序列和相关信息，该多态在SNP数据库中编号为rs2274976。因此，通常该多态在人群中存在三种MTHFR基因的基因型GG型(人体基因组rs2274976多态位点的两个等位基因碱基均为G) ,AG型(人体基因组rs2274976多态位点的两个等位基因碱基分别为G和A)和AA型(人体基因组rs2274976多态位点的两个等位基因碱基均为A)。目前人MTHFR基因多态rs2274976的鉴定常采用PCR-RFLP方法。目前鉴定人MTHFR基因多态rs2274976时常使用内切酶BsrBI进行鉴定，该内切酶的价格昂贵(关于部分内切酶的参考价格可以参考后面的表I)，影响了实验的费用，难以在实验室中普及使用。并且由于传统PCR-RFLP方法的固有缺陷，本领域技术人员通常难以选择其他限制性内切酶对人MTHFR基因多态rs2274976进行鉴定。因此，本领域存在对操作简单，成本低，使用范围广的新型检测SNP的方法的需求。
本发明提供了一种操作简单，成本低，使用范围广的鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的方法，其包括以下步骤a)提供待测人基因组DNA ；b)使用扩增人MTHFR基因多态性rs2274976位点附近序列的正向引物和反向引物，以所述待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；c)使用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；以及d)对所述酶切产物进行电泳，以鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976，其中，所述 正向引物其3’末端倒数第一位碱基与多态rs2274976碱基相邻，倒数第二位碱基为错配碱基C，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成CCGG (第一个碱基C为错配碱基，第三个碱基G为多态等位基因)或ACCGGT (第二个碱基C为错配碱基，第四个碱基G为多态等位基因)结构，或者与多态A等位基因形成CCAGT (第一个碱基C为错配碱基，第三个碱基A为多态等位基因)结构。通过本发明的方法可以通过引物上的错配碱基将SNP附近的序列改变为可被预先确定的限制性内切酶识别的序列，因此，可以克服现有PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂贵内切酶的缺陷，进而大大降低了检测SNP的成本。具体而言，由于在该正向引物序列中倒数第二位碱基C为错配碱基(该碱基在人MTHFR基因序列中的相应位置为G)，因此，错配后PCR产物中多态附近序列由AGCGGT或AGCAGT更改为ACCGGT或ACCAGT (其中第二个碱基为错配碱基，第四个碱基为A/G多态位点)，因此扩增产物中G等位基因片段可被识别CCGG序列的限制性内切酶或者识别ACCGGT序列的限制性内切酶识别(即G等位基因片段可被内切酶切开)。同样错配后PCR产物中多态附近序列由GCGGT或GCAGT更改为CCAGT或CCGGT (其中第一个碱基为错配碱基，第四个碱基为A/G多态位点)，因此扩增产物中A等位基因片段可被识别CCAGT序列的限制性内切酶识别(即A等位基因片段可被内切酶切开)。进而，可以根据片段切开情况来判断多态基因型。更具体地，经序列分析可知，基因原始序列中A/G多态可由表I中前四种内切酶识别。如通过碱基错配PCR将多态位点前面第二位碱基G替换为C，则该多态为G等位基因时经PCR扩增后含CCGG序列可被识别CCGG序列的内切酶识别(如MspI、HpaII)，含有ACCGGT序列可被识别ACCGGT序列的内切酶识别(如BsrFI、BsaWI、AgeI)。同样可被上述内切酶的同裂酶(isoschizomer,来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶)识别并切开，而A等位基因不能切开。通过碱基错配PCR将多态位点前面第二位碱基G替换为C，则当该多态为A等位基因时该多态经PCR扩增后含CCAGT序列可被识别ACTGG序列(互补序列为CCAGT)的内切酶识别(如BsrI)。同样可被BsrI的同裂酶识别并切开，而G等位基因不能切开。下表I中提供了 NEB公司内切酶价格信息(从111^口://￥￥￥.11613-(311；[1^.(301]1获取)作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。表I NEB公司几种内切酶识别序列及其价格内切酶识别序列价格用BsrFI鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的试剂盒，包含扩增人MTHFR基因多态性rs2274976位点附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒数第一位碱基与rs2274976多态碱基相邻，倒数第二位为错配碱基C，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成ACCGGT结构，所述的正向引物为SEQ ID NO1或者SEQ NO11，反向引物为SEQ ID NO2、SEQ ID NO7或SEQ NO12；所述的试剂盒还包括选自BsrFI、BsaWI、AgeI的限制性内切酶；并且所述试剂盒还包括用于实施鉴定的说明书。该试剂盒操作简单，成本低，使用范围广。