一种包裹双生长因子的核壳结构微球及其用途【技术领域】，具体涉及一种包裹双生长因子的核壳结构微球及其用途。[0002]骨折愈合或修复是一个受多种生长因子(Growth factor, GF)综合调控的过程，其中，成纤维细胞生长因子-2 (Fibroblast growth factor, FGF-2)与血小板衍生生长因子(PLLAtelet-derived growth factor, F1DGF-BB)等调节细胞增长与分裂,骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMPs)等能够诱导间间充质干细胞分化为成骨细胞前体。已有研究表明，在骨缺损修复过程中，两种或多种生长因子联用比单用一种生长因子的效果要好。然而，在骨缺损自然修复过程中，成纤维细胞生长因子_2(FGF-2)及血小板衍生生长因子(PDGF-BB)等主要在修复早期出现，在之后的骨分化及骨成熟阶段则没有表达；骨形态发生蛋白(BMPs)则主要在骨形成阶段表达。大鼠骨缺损实验表明，用外源成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2)短时间(如I周)作用能促进血管生成，增大愈伤组织体积，刺激产生矿化作用，但长时间作用会延迟细胞成骨分化和成熟矿化。可能的原因是，成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2)对促细胞增殖有重要作用，但这种能力随着软骨细胞的形成而终止，需要其他的生长因子作用来继续成骨分化。这些研究表明，设计控释材料搭载细胞增殖因子【譬如血小板衍生生长因子(PDGF-BB)】和骨分化因子【譬如骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)】模仿骨自然修复过程进行体内序贯释放实验是成功突破骨再生策略的必要且关键的方法。现有的绝大多数研究只考虑一种生长因子或几种生长因子的简单混合作用，限制了发展。目前的技术不能很好的控制两种物质精确释放。因此，设计新的控制两种因子释放的搭载系统是有必要的。
[0004]为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:[0005]一种包裹双生长因子的核壳结构微球，包括核壳球形结构，所述核为聚乳酸，聚乳酸粘度为0.5-2.0dL/g ;壳为聚乳酸与聚羟基乙酸组成的复合材料，所述复合材料中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比为:75-50:25-50 ;所述核和壳内分别包裹有一种生长因子，所述生长因子为BMP-7或I3DGF-BB。[0006]优选方案:所述核包裹的生长因子是BMP-7，所述壳包裹的生长因子是TOGF-BB。[0007]优选方案:所述核壳结构微球的外径为18-22微米,所述核与壳的质量比为:1:3-4,生长因子在核中的质量百分比为0.002%-0.005%,生长因子在壳中的质量百分比为
0.0008%-0.00125%。
[0008]更优选方案:所述核壳结构微球的核与壳的质量比为:1:4，生长因子在核与壳中的质量百分比分别为生长因子在核中的质量百分比为0.003%，生长因子在壳中的质量百分比为 0.001%。。
[0009]优选方案:所述聚乳酸粘度为1.0dL/g。
[0010]优选方案:所述聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比为:50:50。
[0011]所述包裹双生长因子的核壳结构微球优选通过以下方法制备得到:
[0012](I)将roGF-BB溶于去离子水制成浓度为I μ g/ml-100 μ g/ml的水相I，将复合材料溶于二氯甲烷制成质量体积百分比为8%-12%的有机相I，水相I和有机相I按体积比为1:8-12混合后超声乳化，得乳化液I ;按同样方法将BMP-7溶于去离子水制成浓度为I μ g/ml-100 μ g/ml的水相II，将聚乳酸溶于乙酸乙酯制备得到质量体积百分比为2%_5%的有机相II，水相II和有机相II按体积比为1:8-12混合后超声乳化，得乳化液II ；
[0013](2)采用同轴静电喷雾技术，将乳化液I和乳化液II分别喷入静电喷雾装置的同轴针的外针和内针中，控制内针中物质的流量为1.ο-1.2ml/h,控制外针中物质的流量为
1.5-2.0ml/h,在同轴针下方10cm_12cm处,用装满无水乙醇的培养皿接收制备的微球,然后水洗，再离心，冷冻干燥。
[0014]内针和外针内溶液的流量是很关键的，内针中物质的流量为1.0-1.2ml/h，外针中物质的流量为1.5-2.0ml/h是比较优化的，如果外针的流量太小，不能形成核壳结构。
[0015]优选方案:所述水相I中I3DGF-BB的浓度为5 μ g/ml-20 μ g/ml，所述有机相I中复合材料的质量体积百分比为10% ;所述水相II中BMP-7的浓度为5μ g/ml-20l.! g/ml，所述有机相II中复合材料的质量体积百分比为5%。
[0016]本申请还提供了所述包裹双生长因子的核壳结构微球在制备诱导细胞增殖药物中的应用。
[0017]本申请还提供了所述包裹双生长因子的核壳结构微球在制备诱导低细胞密度培养的骨髓间间充质干细胞成骨分化药物中的应用。
[0018]本申请还提供了所述包裹双生长因子的核壳结构微球在制备治疗骨折损伤药物中的应用。
[0019]本发明公开了一种利用双层核壳微球模拟自然骨再生过程微环境的方法，所述方法采用同轴静电喷雾技术和同轴静电喷雾设备(现有设备)，制备搭载骨形态发生蛋白-7(BMP-7)和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的聚乳酸(PLLA) /复合材料(PLGA)核壳微球，即将骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)分别包埋在微球的核和壳中。
[0020] 所述的同轴静电喷雾设备，采用了同轴针由316L不锈钢制成。外部毛细管(outercapillary)外径为0.72mm,内径为0.50mm,成核毛细管(core capillary)外径为0.40m和内径为0.20_。有两个注射器泵以特定速率传输聚合物溶液到同轴针的内外毛细管，使形成的微球具有壳核结构。电压发生器通过弹簧线夹给喷嘴供应高电压。为了稳定喷嘴周围电场，施加高电压到喷嘴周围的塞环(直径5cm)。通过增加喷嘴电压(Vnrazle)和塞环电压(Vring)形成稳定电位差,形成稳定喷雾。
[0021]与现有技术相比，本发明的优势在于:
[0022]本发明将两种不同的生长因子通过同轴静电喷雾包封在双层壳-核结构微球中，通过一步实现将两种生长因子包封在微球的不同部位，实现对两种生长因子的控制释放。控制释放两种生长因子，能够更好的模拟体内的骨再生的自然微环境，对促进骨再生起到最大的效果。现有许多骨再生疗法只能释放一种生长因子或简单混合释放两种生长因子。因此，本发明通过一步实现包埋两种生长因子在微球不同部位，使不同生长因子在不同时间以不同的释放曲线释放出来，与现有的单一因子释放体系和简单的两种因子混合释放体系比起来，先后释放两种生长因子的体系促骨再生的效果更好。


[0023]图1是各种生长因子对间充质干细胞(MSC)增殖的影响
[0024]图2是各种生长因子对间充质干细胞(MSC)生长周期分布的影响
[0025]图3是各种生长因子对间充质干细胞(MSC)成骨分化碱性磷酸酶活性的影响
[0026]图4是各种生长因子对间充质干细胞(MSC)成骨分化钙沉积的影响
[0027]图5是核壳微球体系中壳层材料中PLLA/PGA构成比例对BMP-7释放曲线的影响
[0028]图6是核壳微球体系中核层材料中PLLA粘度对TOGF-BB释放曲线的影响
[0029]图7是核壳微球体系中壳层材料中PLLA/PGA构成比例对TOGF-BB释放曲线的影响
[0030]图8是核壳微球体系中核层材料中PLLA粘度对BMP-7释放曲线的影响[0031 ]图9是不同微球体系的I3DGF-BB释放曲线
[0032]图10是不同微球体系的BMP-7释放曲线
[0033]图11是用不同微球处理后间充质干细胞(MSC)的ALP强度
[0034]图12用不同微球处理后间充质干细胞(MSC)的钙浓度
[0035]图13是微球的制备过程示意图，其中I是高压电源，2是内乳化液泵，3是外乳化液泵，4是外针，5是内针，6是培养皿。

[0036]下面结合实施例对本发明做进一步解释和说明
[0037]实施例1:
[0038]一种包裹双生长因子的核壳结构微球，包括核壳球形结构，所述核为聚乳酸，聚乳酸粘度为0.5-2.0dL/g ;壳为聚乳酸与聚羟基乙酸组成的复合材料，所述复合材料中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比为:75-50:25-50 ;所述核和壳内分别包裹有一种生长因子，所述生长因子为BMP-7或TOGF-BB。
[0039]一种包裹双生长因子的核壳结构微球的具体制备过程，如图13所示:
[0040](I)将PDGF-BB溶于去离子水制成浓度10 μ g/ml的水相；将复合材料溶于二氯甲烷制成质量体积百分比(克/毫升)为10%的有机相，水相和有机相按体积百分比为1:10混合后超声乳化，得乳化液I ;按同样方法将BMP-7溶于去离子水制成浓度10 μ g/ml的水相；将聚乳酸溶于乙酸乙酯制备得到质量体积比百分比(克/毫升)为3%的有机相，水相和有机相按体积比为1:10混合后超声乳化，得乳化液II ;所述复合材料中聚乳酸-聚羟基乙酸的质量比为:50:50 ；
[0041](2)采用同轴静电喷雾技术，将乳化液I和乳化液II分别喷入静电喷雾装置的同轴针的外针和内针中，控制内针中物质的流量为1.2ml/h,控制外针中物质的流量为
1.5ml/h,在同轴针下方IOcm处,用装满无水乙醇的培养皿接收制备的微球,然后水洗，再离心，冷冻干燥。
[0042]静电喷雾装置的同轴针由316L不锈钢制成，制壳针管的外径为0.72mm，内径为0.50mm,制核针管的外径为0.40mm和内径为0.20mm,装置通过两个注射器泵分别将PDGF-BB/核物料、BMP-7/壳物料通过不同的管道喷入同轴针，在同轴针下方IOcm处，用装满无水乙醇的培养皿接收制备的微球，以防微球凝聚。收集到的微球慢速离心后用去离子水清洗，再次离心后冻干。
[0043]所述核壳结构微球的外径为20微米，所述核与壳的质量比为:1:4，生长因子在核中的质量百分比为0.0033%，生长因子在壳中的质量百分比为0.001%。
[0044]对比例:固定其它因素不变，制备方法同实施例1，仅改变包裹位置或者包裹的生长因子的位置作对比实验:
[0045]将两者生长因子同时包裹在普通单层微球结构中，单层微球通过内径为0.50mm的单轴针头制备，以下简称U;
[0046]将生长因子(PDGF-BB)同时包裹在具有壳核结构的双层微球中，以下简称PB (只包裹了一种生长因子);
[0047]将生长因子(BMP-7)同时包裹在具有壳核结构的双层微球中，以下简称B (只包裹了一种生长因子);
[0048]将生长因子(BMP-7)和生长因子(PDGF-BB)同时包裹在具有壳核结构的双层微球中，以下简称P (两生长因子同时包裹在两层结构中)；
[0049]将生长因子TOGF-BB包裹在壳核结构的核层材料内，同时将BMP-7包裹在壳核结构的壳层材料内，以下简称SI ；
[0050]将生长因子BMP-7包裹在壳核结构的核层材料内，同时将I3DGF-BB包裹在壳核结构的壳层材料内，以下简称S2。
[0051]实施例2应用研究
[0052]2.1细胞因子促间间充质干细胞(MSC)增殖分析
[0053]通过细胞计数测定外源性生长因子的促细胞生长能力，血小板衍生生长因子(PDGF-BB)对间间充质干细胞(MSC)细胞增殖的影响具有阶段性，如图1所示，当浓度低于20ng/mL时，细胞数目与血小板衍生生长因子(PDGF-BB)浓度成线性关系，但再加大浓度时，促细胞增殖能力明显减弱，20ng/mL血小板衍生生长因子(PDGF-BB)促增殖幅度约为50%。相反的，骨形态发生蛋白-7(BMP-7)呈现出阶段性的抑增殖作用，低浓度(0.1-1.0ng/ml)时，骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)对细胞增殖的促进和抑制作用均不明显，浓度高(10-200ng/ml)时能抑制细胞增殖，且抑制效果与剂量有关。[0054]多次实验结果显示，当20ng/mL (固定值)血小板衍生生长因子(PDGF-BB)中添加骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)时，发现骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)抑制细胞增殖的能力强于血小板衍生生长因子(PDGF-BB)促细胞增殖能力，且骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)对血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的抑制效果与骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)剂量有关。孵育2天后，与只用20ng/mL血小板衍生生长因子(PDGF-BB)处理相比，骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)浓度为20ng/ml和200ng/ml时的抑增殖率分别为17%和24%。
[0055]骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)抑制细胞增殖可能是因为它是一种诱骨形成蛋白，因此会阻断间充质干细胞(MSC)增殖，诱导细胞分化为成骨细胞。细胞周期实验表明，与对照组相比，用20ng/mL血小板衍生生长因子(PDGF-BB)处理后，G0、G1期的细胞数目明显减少，S、G2和M期的数目明显增多。相反，用100ng/ml骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)或同时含100ng/ml骨形态发生蛋白_7 (BMP-7)和20ng/ml血小板衍生生长因子(PDGF-BB)处理后，G0、G1期的细胞数目明显增多，S、G2和M期的数目明显减少。图2表明，单独使用骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)或与血小板衍生生长因子(PDGF-BB)同时使用没有明显区别。实验结果表明，单独或与血小板衍生生长因子(PDGF-BB)联合使用骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)是将细胞生长周期阻断在Gl期。[0056]2.2诱骨髓间间充质干细胞(MSC)成骨分化因子分析
[0057]通过定量生化比色法测定不同样品处理细胞后的碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase, ALP)-时间曲线检测生长因子(Growth factors, GFs)对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。如图3所示，用血小板衍生生长因子(PDGF-BB)处理细胞4周后，碱性磷酸酶(ALP)活性没有增强，而用骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)处理2周后，碱性磷酸酶(ALP)活性显著增强，并在检测结束后保持这种增强作用。与单独使用骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)相t匕，添加P血小板衍生生长因子(PDGF-BB)后，碱性磷酸酶(ALP)活性减少约4倍。
[0058]用0.6N盐酸(HCl)提取经不同样品处理细胞后得到的含钙矿物中的钙，并测定钙含量以进行定量检测。如图4所示，经对照组和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)处理的实验组中，钙浓度都较低，用骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)或地塞米松(dexamethasone, DEX)处理，或血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)同时处理后，钙浓度则较高，且随时间增加而增加。骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)处理后的钙浓度与DEX处理后的钙浓度相当，但血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)同时处理后的钙浓度则低于其半值。实验结果表明，若同时释放，则血小板衍生生长因子(PDGF-BB)会阻断骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)的矿化作用。
[0059]2.1和2.2的研究结果显示，这两种生长因子作用机理和起作用的阶段不同。同时使用时，若不能很好的控制释放时间，会有相互影响，甚至抑制作用，不能使得两者都达到较好的效果。
[0060]2.3控制释放血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和骨形态发生蛋白_7 (BMP-7)的研
究
[0061]如图5-6所示，包埋在壳中的骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)首先释放，持续大量释放6天后能缓慢释放10天。相比较的，包埋在壳中的血小板衍生生长因子(PDGF-BB)则按S型曲线释放，最初10天释放量较少，接下来2周，释放量逐渐增加并达到最大值。若对换两种生长因子的搭载位置，将保持其释放模式，即包埋在壳中的蛋白先释放，包埋在核中的蛋白则后释放。
[0062]如图5、7所示，当固定核层材料为PLLA (粘度1.0dL/g)时，改变壳层材料复合材料(PLGA)中PLLA =PGA的配比制备的核壳微球释放生长因子(BMP7，图5 ；PDGF-BB,图7)的速率不同，当PLGA中PLLA的比例提高时，释放生长因子的速率降低。如图6、8所示，当固定壳层材料为PLGA (PLLA:PGA质量比=50:50)时，改变核层材料PLLA的粘度制备的核壳微球释放生长因子(PDGF-BB，图5 ；BMP-7,图7)的速率不同，当PLLA的粘度增大时，释放生长因子的速率降低。当固定核层材料为PLLA(粘度1.0dL/g)时，壳层复合材料中PLLA = PGA质量比=50:50时，能实现两者生长因子的先后释放，效果较好。
[0063]测定本申请与对比例中各种微球结构对生长因子包封率(EE)的影响，结果见表1，并测得不同的释放曲线，见图9-10。
[0064]表1中，对比U和P可知，核壳结构显著提高了生长因子在核中的包封率，对比U和S1/S2可知壳中生长因子的包封率无变化。普通单层微球(U组)的释放结果显示初期呈现爆发式释放，最初6天内，血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的释放量高于60%，骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)的释放量达50%。接下来几天血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)呈线性释放，直至第30天时，两种生长因子的释放量达85%。从这方面看，U组中两种生长因子呈平行释放模式。与简单单层微球相比，核壳双层微球结构复杂，能够实现多种控释模式。
[0065]例如，核壳中均包埋血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的PB组能实现血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的线性释放(忽略最初阶段的微小突发释放)。同样的，忽略最初阶段的突发释放，核壳中均包埋骨BMP-7的B组也能实现BMP-7的线性释放。P组核壳微球同时包埋血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)，与包埋等量生长因子的单层微球U组相比，两种生长因子的释放速率均慢，特别是在前2周(见图9-10)。P组释放血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的速率比PB组快，可能原因是，P组中核壳微球集中了 PB组中的同一区域(核或壳)2倍的蛋白质含量(见图9-10)。
[0066]若两种生长因子分别包埋在核壳微球中，则能实现两种生长因子的控制释放。如图9、10所示，分别包埋血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和骨形态发生蛋白_7 (BMP-7)于核和壳中的SI组，在第I周，骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)的释放量达85%，而血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的释放量仅为15%，之后血小板衍生生长因子(PDGF-BB)释放速率加快，3周后释放量达85%。同理，S2组在I周后，血小板衍生生长因子(PDGF-BB)释放量达95%，而骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)释放量仅为10%，之后骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)释放速率加快，3周后释放量达88%。
[0067] 表1实验中各组样品定义及蛋白包封率
[0068]