一种牛骨骼肌特异性表达基因MyoDⅠ启动子的制作方法[0002]真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达的调节由转录因子特异性结合于调控区相关元件，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究|吴式。在特异闻效表达的转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子非常重要。但启动子的特异性由多个调控元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。[0003]MyoD I是生肌决定因子MRFs基因家族所编码4种肌肉特异性转录因子中的I种，是控制骨骼肌生成的关键调节因子，与肌肉生长和肉质有着密切的关系，利用其基因调控区的相关元件构建骨骼肌特异性表达载体是一种有效的方法。
[0004]本发明提供了一 种牛骨骼肌特异性表达基因MyoD I启动子，该启动子载体具有骨骼肌特异性启动特性， 而在除骨骼肌外的多种细胞中无启动活性，说明该启动子能在骨髂肌中特异性地启动下游基因的表达，为转基因载体提供了一种重要的元件。[0005]本发明是这样实现的:牛骨骼肌特异性表达基因MyoD I启动子，其核心启动子(-108至94)包含如SEQ ID所示的DNA序列，其长度为202bp。[0006]所采用重组核酸序列含有上述的启动子或其片段，这样就可以使位于启动子下游的目的基因在骨骼肌中特异性表达，作为分析、开发、改造骨骼肌特性的研究模型。还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的基因的重组核酸，通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎，用于建立转基因动物。重组核酸序列中的目的基因，含有提高肌肉品质基因，这样就可以在获得骨骼肌特异性启动特性之外，提高该重组核酸序列的性能，为转基因牛的培养提供更多的功能性方向，增加其附加产值，提高肉品营养价值。[0007]本发明主要通过报告基因分析确定该启动子的启动特征。首先构建无启动子绿色荧光蛋白载体，为保证报告基因正确翻译，在绿色荧光蛋白基因上游插入内部核糖体进入位点(IRES)。然后通过PCR或者片段捕获等技术获得骨骼肌中特异性表达的MyoD I启动子，长度为202bp，插入内部核糖体位点上游，得到启动子报告基因分析载体。质粒去内毒素后，转染C2C12小鼠成肌细胞系，同时转染牛原代肾上皮细胞等多种细胞为对照，转染24h后更换含牛血清的诱导培养基至成肌细胞，诱导细胞分化融合，48h后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，分析启动子特性。[0008]1、牛MyoD I启动子全长的克隆及序列分析
用软件分析最有最大启动子活性的牛MyoD I启动子区域，设定为Pl片段，用在线软件设计特异性引物由生物工程有限公司合成；从牛背部最长肌组织提取组织DNA ;采用基因组PCR步移技术扩增出MyoD I的启动子；琼脂糖凝胶电泳检测扩增引物；对应物进行纯化；送生物公司进行序列分析。
[0009]2、牛MyoD I启动子全长报告质粒的构建及鉴定
将提纯后的目的基因和PGL3 — Basic进行双酶切，构建含有MyoD I启动子的重组质粒PGL3 — MyoD 1-Pl,并对其进行筛选和鉴定。
[0010]3、双荧光素酶报告基因检测报告质粒MyoD I启动子的活性
将MyoD I启动子报告质粒和PRL-TK共转染到牛前脂肪细胞中，24h后裂解细胞，并收集裂解液进行双荧光素酶检测4、牛MyoD I核心启动子区的定位
(I)MyoD 1-Pl的5’端截短载体的构建以及MyoD I核心启动子区的初步鉴定。
[0011]设计特异性引物对MyoD I — Pl 5’端进行截短，并构建重组报告质粒以检测其启动活性。截短片段分别命名为P2、P3。构建重组报告质粒PGL3 MyoD 1-P2、PGL3-MyoD 1-P3，并进行筛选，鉴定。然后对其进行双荧光素酶活性检测。
[0012](2)用脂质体转染试剂盒将启动子-荧光素酶报道质粒(pGL3_启动子)和内参质粒PRL-TK共转染到细胞中，并检测荧光素酶报告基因的表达活性。
[0013](3)将缺失突变载体按照脂质体转染试剂盒说明进行转染，细胞接种于96孔板培养后，测定荧光素酶表达活性`，并观察不同缺失突变体对荧光素酶表达活性的影响。以上实验独立重复3次。
[0014](4)通过对缺失载体启动子活性进行统计分析后，初步定位核心启动子的位置。
[0015]5、对核心启动子测序并进行功能分析
将pGL3-启动子与PRL-TK共转染到C2C12细胞系、小鼠脂肪细胞及原代小鼠乳腺细胞等10种细胞中，进行表达特异性验证。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明根据研究发现牛MyoD I基因启动子具有骨骼肌特异性启动特性，并利用这一特性设计了一种骨骼肌特异性表达启动子载体，该启动子可以在转基因牛的培育中应用。该启动子载体具有骨骼肌特异性启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该启动子在骨髂肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为转基因载体提供了一种重要的元件。



[0016]附图1为本发明核心启动子的电泳图谱；
附图2为确认本发明核心启动子的技术路线框图。

[0017]本发明的实施例:针对牛骨骼肌特异性表达基因MyoD I启动子，设计上游引物CTCCCTGCTCTGTTCCTATT,下游引物AAACTTGCTGCTGTTCTGG，通过PCR扩增，克隆核心启动子(-108至94)包含如SEQ ID所示的DNA序列，其长度为202bp。[0018]核心启动子的序列号为:CTCCCTGCTC TGTTCCTATT GGCCTCGGGCGCCCCCGCCT
CTAGCCGCTA GCTCGGGCTC GGGGGCCCTT AGGCTACTAC GGGATAAATA GCCCTGGGAGCCTGGTGTGA
AAGTAGGGGT GGGGAGGCCC CAGGGCGCTG CCGCGGCTCT CCTCAGGACC GGGGAGGGTGGGACTGCTGGGGCTCCAGAA CAGCAGCAAG TT`