专利名称：血纤维蛋白d-二聚体片段特异性的、来源于dd-3b6/22的人源化抗体的制作方法本说明书参考的出版物的书目详细资料被收集在本说明书的末尾。本说明书对任何现有技术的参考不是，也不应当被认为，是该现有技术在任何国家中都构成部分公知常识的认可或任何形式的暗示。纤维蛋白原是一种大的蛋白分子，通常以溶解状态在血浆中循环。在凝血酶存在时，纤维蛋白原分子形成称之为血纤维蛋白的长线状聚合体，这是血块的主要成分。用纤溶酶消化后，纤维蛋白原形成被命名为A-E的片段。片段D和E是占主导地位的片段，并且D大约为E的两倍。纤维蛋白原具有三结节(trinodular)形状，其中片段 E是中心组分，而片段D是末端组分。血纤维蛋白和纤维蛋白原的纤溶酶消化产物可利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 来彼此区分。血纤维蛋白和因子XIIIa的交联形成片段D的二聚体并称之为D-二聚体。因子XIIIa是一种在血纤维蛋白邻近单体之间引入共价键的酶(Budzynski等，Blood 54(4) 794-804,1979)。因子XIIIa是通过凝血酶催化切除血浆和血小板前体中的肽而被激活的。 D-二聚体是大约为189，000道尔顿的分子，其在本质上是由来源于通过、链上的纤维蛋白原残余物间的交联键共价结合的不同血纤维蛋白分子的两个片段D基元组成的。纤维蛋白原本身由6条链组成，具有两拷贝的α、β和Y链。另一个复合体(DD)E通过纤溶酶降解交联的人血纤维蛋白而形成，并且包括两个 D片段和片段E的组合。其它的交联衍生物由Graeff 和 Halfer 描述(Graeff 和 Halfer，〃 Detection and Relevance of Cross-linked Fibrin Derivatives inBlood" , Seminars in Thrombosis and Hemostatis 8 (1)，1982)，并包括高分子量的交联衍生物如DY、YY、XD、XY、DXD和YXD0正常的止血或血液凝固包括维持血管内成分的液态或悬浮状态，而同时使得固相血液组分在血管损伤区域进行局部沉积。在健康状态下，人们假定，但从未经实验方法证实，在低级血管内血纤维蛋白的沉积与纤维蛋白溶解或细胞噬菌作用对它的清除之间存在着平衡。早期临床观察显示一些重病患者出现大出血和大块淤血的征兆，并且具有延长的凝血时间和血小板减少症。死后，在某些病例中，在微脉管系统中证明有血纤维蛋白血栓症。这些血栓症的扩散性质引起弥散性血管内凝血(DIC)，因此也被称作消耗性凝血病。 因此，凝血酶与疾病如深静脉血栓症(DVT)和肺栓塞(PE)有关。疾病例如DIC、DVT和PE涉及凝血系统的激活，导致血小板消耗、血栓产生、血纤维蛋白沉积以及继发的纤维蛋白溶解。该过程的纯生物学效应反映了血纤维蛋白沉积和血纤维蛋白清除之间的平衡。所产生的临床表现为当凝血因子的损耗占主导地位时可能是大出血，或者由于在其它条件下血管闭塞的影响，为局部缺血性组织损伤。DIC、IDVT和PE已被报道是多种紊乱的继发现象，特别是那些伴有并发的休克、酸毒症和血氧不足症的疾病。众所公认的临床联系有败血症、主要外伤、恶性瘤以及产科失调。最近，DVT被公认为是在延长的空中旅游或其它延长的不运动期间出现的特殊问题。在任何情况下，凝血程序的激活导致凝血蛋白和血小板的消耗，造成血纤维蛋白在微循环中的沉积。理想地，疾病如DIC、DVT和PE的确诊需要扩散性血纤维蛋白沉积的直接证据。获取多种直接的活组织检查证据以区分局部性和全身性血纤维蛋白形成的实际困难，导致了取代为诊断终点的间接测试的发展。然而，这些测试对血管内血纤维蛋白沉积综合征不具有特异性。它们的特异性通过其它酶的作用被进一步降低，这些酶虽然不能够将纤维蛋白原转换为血纤维蛋白，但可以象凝血酶一样导致血栓症中所涉及的其它凝血因子发生类似的改变。所有这些间接测试都基于凝血酶是唯一(蛇毒液除外)能够在哺乳动物中将纤维蛋白原转换为血纤维蛋白的酶的原理。而且，除了检测循环的可溶性血纤维蛋白单体复合体存在的副凝固实验之外，没有一种更特异的凝血酶特异性测试可容易地得到、或可用于诊断这些血纤维蛋白相关疾病的直接临床应用。这些测试包括FPA(血纤维蛋白肽A)测试，其中FPA通过特异性的RIA 操作检测，血纤维蛋白单体试验，纤维蛋白原凝胶排阻层析以及FPB (血纤维蛋白肽B)或凝血酶可增加的FPB测试。生化非特异性的凝血酶作用测试包括凝血素时间(PT)、促凝血酶原激酶时间(A PTT)以及凝血酶凝结时间(TCT)测试。尽管经常可用于实践，必须认识到从这些测试获得的信息在本质上是非特异性的，起着不考虑病因学而测量凝结因子损耗的作用。凝血因子试验也被发现是相对非特异性的，并且这包括辅因子V和VIII的分析以及纤维蛋白原水平的测试。血纤维蛋白-纤维蛋白原降解产物的测试迄今还没有被证明对于纤溶酶对血纤维蛋白的作用是特异性的，并且当凝血酶没有在先对纤维蛋白原分子作用而出现纤维蛋白原溶解时可产生阳性结果。这些测试包括片断D和E的测试。对凝血酶介导的血小板相互作用或释放进行测试发现在本质上是非特异性的。这包括血小板计数、血小板残存以及血小板释放测试。还尝试使用了与鉴定凝结因子有关的放射性标记的纤维蛋白原，但发现费时并且难于操作。因此，诊断试验的功效在于其能够预示疾病存在与否。对于诊断试验功效确定的研究，存在众所公认的基本设计原理，其使四项指数灵敏度、特异性、阳性预测值及阴性预测值能够得以确定。第一个必要条件是采用适当的诊断标准。理想地，该标准应当稍微超过临床精确度，并且应当对疾病实体尽可能是特异性的。特别与DVT和PE有关的固有难点是许多常规可用的实验室试验也缺乏诊断的特异性。低的血小板计数支持这些疾病的可能性，但也可能作为感染继发的孤立发现而发生。相似的局限性适用于许多凝血试验。低纤维蛋白原血不能区分因纤溶酶或者弹性蛋白酶作用而产生的原发性纤维蛋白溶解和在凝血酶介导纤维蛋白原转换为血纤维蛋白之后继发的纤维蛋白溶解。或者，可以利用凝血酶作用的敏感性试验，但其临床应用具有明显的缺陷。一个例子是FPA试验，尽管其对凝血酶作用是特异性的，但异常灵敏，并可在非并发的静脉血栓症中检测到局部化的血管内凝血固而产生阳性结果。提高的FPA水平的临床重要性，即使伴有阳性的副凝固试验，仍有争议，特别是如果血小板计数、全局凝结试验及纤维蛋白原水平是正常的话。鉴于这些理由，灵敏度、特异性以及预测值不能够以标准的方式予以确定。这些紊乱的临床表现是复杂和不可预知的。因此，可用诊断试验的应用，最好结合不同的血管内凝血临床综合病症加以考虑。鼠单克隆抗体3B6被公开(美国专利No. 4，758，524)。该抗体是D-二聚体特异性的，并代表了第一个凝结特异性的抗体。然而，利用这一抗体作为人类全身诊断制剂的能力由于该分子的免疫原性而受到限制。因此，需要修饰3B6抗体以降低其在非鼠动物和人类中的免疫原性。发明_既述在整个说明书中，除非上下文另有要求，措辞“包括(comprise)”，或者变化形式例如〃 comprises"或〃 comprising"，将被理解为意味着包含规定的元件或整体或者元件或整体组，而不是排除任何其它的元件或整体或者元件或整体组。冠词“一个(a) ”或“一种(an) ”在本文中用于指一个或多于一个(也就是至少一个)合乎语法目的的物质。作为例子，“一个元件”是指一个元件或不止一个元件。在本发明的先导工作中，利用脱敏技术降低3B6抗体的免疫原性。这使得用于人类的血栓症成像诊断方法得以发展。此外，脱敏形式的3B6抗体允许其作为凝块靶向制剂， 将凝块溶解剂或者凝块成长预防剂例如抗凝固剂递送到凝块部位。因此，本发明的脱敏分子起着将诊断和治疗制剂递送到靶部位例如凝块的载体的作用。这些分子还可以具有它们自己的诊断和治疗特征。脱敏形式3B6抗体的发展可应用于一系列疾病例如DVT和PE中。 此外，脱敏形式的3B6抗体可与计算机支持的断层摄影术核医学或平面成像技术例如CT、 MRI或超声波联合使用。因此，本发明提供了一种载体分子，一般地是一种免疫交互式分子的形式，而特别地是相对于亲本分子被嵌合和/或突变的单克隆抗体，从而它在靶宿主例如人类体内表现出低的免疫原性。嵌合或突变的过程在这里被称之为脱敏。在一个特别优选的实施方案中， 免疫交互式分子例如单克隆抗体被人源化，已降低其在人体中的免疫原性。脱敏可以不同的方法进行，但在一个优选实施方案中，单克隆抗体可变(ν)区的一个或多个氨基酸被突变(例如取代)以降低MHC II对来源于该区的肽的识别。换句话说，脱敏过程目的在于降低T-细胞表位介导的针对该抗体的免疫反应。本发明最优选的抗体是对D- 二聚体表现出特异性的脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6。脱敏形式:3B6的产生允许发展主要用于人体内血块的全身凝块靶向制剂。这允许其被作为成像制剂以及作为将凝块溶解剂或者凝块成长预防剂例如抗凝剂递送到凝块部位的载体。6因此，该脱敏抗体可以单独或作为一系列诊断和/或治疗制剂的载体。因此，本发明的一个方面提供了免疫交互式分子的变体，它包括对交联的血纤维蛋白衍生物具有特异性的部分，并且该部分来源于可得自动物或禽类生物的免疫交互式分子，其中的变体在来自相同或不同种类的其它动物或禽类生物中表现出低的免疫原性。优选地，免疫交互式分子是单克隆抗体变体，包括对交联的血纤维蛋白衍生物具有特异性的部分。更优选地，单克隆抗体是对人源D- 二聚体以及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且对纤维蛋白原或者包含片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物是非反应性的鼠源单克隆抗体变体，其中的鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的。优选地，抗体是对被单克隆抗体3B6所识别的表位具有特异性的脱敏抗体，并且包括来源于3B6单克隆抗体可变结构域的至少一个互补性决定区(CDRs)，而且该脱敏抗体分子的其余的免疫球蛋白源部分是来源于其中该抗体待脱敏的宿主的免疫球蛋白或其类似物。因此，本发明提供了对被3B6单克隆抗体所识别的表位具有特异性的脱敏抗体分子，其中所述脱敏抗体可变结构域的至少一个互补性决定区(CDRs)是来源于3B6单克隆抗体，其中所述3B6抗体可变区的一个或多个氨基酸被突变，以降低MHC II类分子对来源于该区的肽的识别。本发明进一步提供了用于人类的脱敏鼠单克隆抗体3B6变体，在该3B6抗体的ν 区包括被设计成用以消除或减少ν区的与MHC II类分子结合的肽片段的一个或多个氨基酸突变。脱敏的免疫交互式分子可单独使用，或者作为将诊断和/或治疗制剂递送到靶部位例如血块的载体。因此，本发明考虑了在人类患者体中检测血块的方法，通过向患者体内引入用报道分子标记的脱敏形式的鼠单克隆抗体3Β6或其抗原结合片段，使该标记抗体散布在整个循环系统中，然后对患者进行报道分子检测方法以鉴定该抗体在凝块中的位置。在一个选择的实施方案中，未标记的脱敏形式的:3Β6，而标记了具有抗-免疫球蛋白特异性的第二抗体。该抗体与第一个提及的抗体形成标记复合体。作为载体，脱敏载体可将任何凝块结合分子连同其它诊断或治疗制剂递送到凝块部位。因此，本发明考虑对D-二聚体或其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性的脱敏鼠单克隆抗体在制造凝块成像制剂中的应用。而本发明的另一个方面考虑促进人体内血块溶解或清除的方法，所述方法包括向所述人施用凝块溶解或凝块生长预防有效量的对人源D- 二聚体以及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且对纤维蛋白原或者包含片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物是非反应性的鼠源单克隆抗体变体，其中所述鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的。其中所述单克隆抗体进一步包括融合的、结合的或以其它方式连接在其上的凝块溶解或凝块生长预防制剂。本发明还有另一个方面涉及对人源D- 二聚体以及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且对纤维蛋白原或者包含片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物是非反应性的鼠源单克隆抗体变体在制造用于溶解人体内的血块的药剂中的用途，其中所述鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的，并且所述抗体进-步包括融合的、结合的或以其它方式联接在其上的凝块溶解或凝块生长预防制剂。优选的分子是用于人类的脱敏鼠单克隆抗体3B6变体，并且包括含有选自于SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :9/SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :11、SEQ IDNO :9/SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :9/SEQ ID NO :12 以及 SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :11 的核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链和轻链ν-结构域的组合，或者由与上文列举的每对中的一个或两个核苷酸序列至少有70%相似性的核苷酸序列、或由在低严紧度条件下能够与上文列举的每对中的一个或两个核苷酸序列或者其互补形式杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的组合。脱敏备用的3B6抗体变体优选包括含有选自SEQ ID NO :1/SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :2/SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :3/SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :1/SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 2/SEQ ID NO 6,SEQ IDNO :2/SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :3/SEQID NO 5,SEQID NO :3/SEQID NO 6以及SEQ ID NO :1/SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重链和轻链v_结构域的组合，或者与上文列举的每对中的一个或两个氨基酸序列至少有70%相似性的氨基酸序列的组合。另一个优选的:3B6变体包括选自 VHv5/VKvl、VHv6/VKvl、VHv7/VKvl、VHv5/VKv7、 VHv6/VKv7、VHv6/VKv4、VHv7/VKv4、VHv7/VKv7 以及 VHv5/VKv4 的重链和轻链 ν-结构域的组合。本发明的另一方面考虑了在人类患者体内检测血块的方法，通过向患者体内引入用报道分子标记的脱敏形式的鼠单克隆抗体3Β6或其抗原结合片段，使该标记抗体散布在整个循环系统中，然后对患者进行计算机辅助的断层摄影术核医学扫描来观测凝块。而本发明的另一个方面考虑了在人类患者体中检测血块的方法，通过向患者引入用报道分子标记的脱敏形式的鼠单克隆抗体3Β6或其抗原结合片段，使该标记抗体散布在整个循环系统中散布，然后对患者进行平面凝块成像术来观测凝块。本发明的脱敏免疫交互式分子还可用于将抗凝固剂锚定在特定的部位。因此，这方面提供了将诊断或治疗制剂组织特异性地锚定于例如凝块上。此外，免疫交互式分子可被设计为具有多重特异性。举例来说，设计了包括一个凝块特异性和另一个凝块部位(例如细胞受体)特异性的双特异性脱敏抗体。这使得抗体保留在凝块的部位上。在一个选择方案中，设计了多步骤治疗法，其中，举例来说，向凝块靶向施用与抗凝固剂配位的脱敏3Β6或其它交互式分子并形成复合体，然后给第一抗体和/或抗凝固剂定向施用第二抗体以促进或监测第一复合体。脱敏的免疫交互式分子还可以被用于确定凝块消散或凝块消失的动力学。这可用于更早地预测凝块的出现或消失，因此，有助于确定何时开始第二治疗例如抗凝固剂治疗的动力学。本发明进一步提供了包括脱敏的免疫交互式分子以及成像和/或治疗性标记物。 成像标记物包括MRI、超声波以及CT标记物。治疗制剂标记物包括放射性同位素、抗凝结制剂以及细胞因子。表1提供了整个主题说明书中所用的序列标识符概况。表1序列标识符概况序列识别号说明13B6DIVHv5的氨基酸23B6DIVHv6的氨基酸33B6DIVHv7的氨基酸43B6DIVKvl的氨基酸53B6DIVKv4的氨基酸6氨基酸3B6DIVKv77编码3B6DWHV5的核苷酸序列8编码3B6DWHV6的核苷酸序列9编码3B6DWHV7的核苷酸序列10编码3B6DIVKvl的核苷酸序列11编码3B6DIVKv4的核苷酸序列12编码3B6DIVKv7的核苷酸序列附图的简要说明图1是显示(A) 3B6单克隆抗体的图解图；(B) 3B6结合于血块的照片(X 4，2000放
大倍数)。图2图解描绘了用核标记物(99mTc)标记的3B6抗体。图3A图表描绘显示了给人类循环系统施用:3B6 99mTc0图:3B照片描绘显示了当来自99mTc的放射线集中在凝块部位时而对前腿中的血块进行的观测。图4A、4B和4C绘画描绘显示了利用脱敏的3B6单克隆抗体进行D- 二聚体捕获试验。优选实施方案的详细描述本发明部分建立在能够提供一种来源于一种动物或禽类生物的而在相同或不同物种的另一种动物或禽类生物中基本上呈非免疫原性的免疫交互式分子的生物化学技术的应用上。该生物化学方法被称之为“脱敏”。本文所指的“脱敏”包括诸如互补决定性区域(CDR)移植、有关免疫交互式分子构架区的“重塑”、以及可变(ν)区的突变，都旨在降低免疫交互式分子在特定宿主中的免疫原性。在本案中，优选的免疫交互式分子是抗体例如多克隆或单克隆抗体。在一个最优选的实施方案中，免疫交互分子是单克隆抗体，来源于一种动物或禽类生物，并且在相同或不同物种的另一种动物或禽类生物中表现出低的免疫原性。本发明一般地涉及来源于一种动物或禽类物种或品系的载体分子，并且当其暴露于其它动物或禽类物种或品系的免疫系统时基本上是非免疫原性的。载体分子可以本身表现出有益的诊断或治疗特征，或者可以被用于将活性化合物(例如抗凝血制剂、放射性同位素)递送到靶部位。一般地，载体分子是免疫交互式分子。更特别地，本发明涉及包括非鼠哺乳动物化形式的、基本上不能够在非鼠动物特别是人体中诱导针对其本身的免疫应答的脱敏鼠源单克隆抗体。更加特别地，本发明提供了脱敏形式的鼠单克隆抗体3B6，从而在对人类施用后，其不能够、或者表现出降低的、诱导针对其本身或其衍生物的实质性免疫应答的能力。脱敏的免疫交互式分子特别是本发明的抗体具有广泛有益的诊断和治疗应用， 例如检测人类循环系统中的血块，以及作为凝块靶向制剂递送凝块溶解制剂或凝块生长预
9防制剂如抗凝固剂。包括人源化形式的脱敏主题单克隆抗体特别被用于诊断和治疗疾病如深静脉血栓症和肺栓塞。本发明的分子特别被用作将活性化合物递送到靶部位的制剂。这样的活性化合物包括凝块结合分子。从而，本发明一方面提供了免疫交互式分子变体，所述变体包括对交联的血纤维蛋白衍生物具有特异性的部分，并且该部分得自从一种动物或禽类生物的免疫交互式分子，其中所述变体在相同或不同物种的其它动物或禽类中表现出降低的免疫原性。所上所述，优选形式的免疫交互式分子是抗体，并且特别是单克隆抗体。从而，本发明另一方面提供了单克隆抗体变体，包括对交联的血纤维蛋白衍生物具有特异性的部分，并且该部分得自于从第一动物或禽类生物的单克隆抗体，其中所述变体在相同或不同物种的第二动物或禽类中表现出降低的免疫原性。在一个特别优选的实施方案中，单克隆抗体获自鼠科动物，并且相对于另一个鼠科动物或不同物种的动物如人脱敏化。鼠科动物中的鼠单克隆抗体针对来源于血纤维蛋白原的非变性D- 二聚体被募集。后者分子通过纤溶酶被消化，并产生一系列命名为片段A 到E的片段。血纤维蛋白和因子XIIIa的交联形成片段D的二聚体称之为D-二聚体。该 D-二聚体是大约为189，000道尔顿的分子，并且包含通过γ链上的纤维蛋白原残余物间的交联键结合的两个片段D基元。因此，本发明的另一个方面涉及鼠源单克隆抗体变体，对人源D-二聚体以及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、并且对纤维蛋白原或者包含片段D和E在内的纤维蛋白原降解产物是非反应性的，其中所述鼠源单克隆抗体变体在人体中基本上是非免疫原性的。关于“基本上是非免疫原性”包括与亲本抗体，也就是暴露于脱敏步骤之前的抗体相比，降低的免疫原性。术语“免疫原性”包括激起、诱发、或以其他方式促进宿主动物的体液和/或T-细胞介导的应答的能力。特别便利的免疫原性标准包括来源于抗体可变(ν) 区的氨基酸序列与MHC II类分子相互作用、从而刺激或促进T-细胞介导的应答，包括T-细胞辅助的体液应答的能力。本发明考虑的免疫交互式分子特别是单克隆抗体包括提及的凝块靶向制剂。本文所提及的优选的鼠源单克隆抗体是单克隆抗体:3B6，其在美国专利 No. 4，758，524 中被描述。因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了脱敏形式的单克隆抗体:3B6， 其中所述脱敏3B6在人体中基本上是非免疫原性的。而且，上下文中的“基本上是非免疫原性”是指脱敏3B6单克隆抗体在人体中诱导或促进针对其本身的免疫应答(在最初或随后给药后)的能力与脱敏前的鼠单克隆抗体 3B6相比降低了。虽然优选的发明特别涉及与人类有关的脱敏形式的:3B6，本发明扩展至对其它动物或禽类物种脱敏的、对D- 二聚体和/或其它交联血纤维蛋白衍生物具有相似特异性的这种抗体或另一种抗体。本文涉及的其它交联血纤维蛋白衍生物包括，举例来说，除了 D-二聚体之外，还有D-二聚体衍生物以及包含D和E片段的复合体。后者包括(DD)E，并且是通过纤溶酶降解交联的人血纤维蛋白形成的，并且包含两个D片段和E片段的组合。其它的交联衍生物包括DY、YY、XD, Ti、DXD和YXD，其中字母表示被纤溶酶降解后形成的纤维蛋白原片段， 其中X和Y不同，并且选自片段A到C以及E。优选地，本主题发明的脱敏抗体是来源于对 D-二聚体及其它交联血纤维蛋白衍生物具有特异性的抗体，但其不与纤维蛋白原、包括片段D和片段E在内的纤维蛋白原降解产物发生交叉反应。优选地，产生抗体的克隆是用液相D- 二聚体分子而不是固定化的D- 二聚体挑选的，虽然通过任何一种形式的D- 二聚体筛选的克隆都被考虑在本发明之内。优选地，脱敏抗体对它的靶抗原表现出亲和力，这与鼠单克隆抗体3B6表现出的亲和力相似。与抗原结合分子上的个别抗原结合部位和该抗原上其相应部位之间的相互作用有关的“亲和力”包括这种相互作用的强度。“抗体”是指能够与抗原结合、相互作用或以其它方式联合的免疫球蛋白家族的蛋白。因此，抗体是抗原结合的分子。“抗体”是免疫交互式分子的一个例子，并且包括多克隆或单克隆抗体。本发明优选的免疫交互式分子为单克隆抗体。抗体包括其部分，包括Fab 部分和抗原结合决定簇。术语“抗原”在本文是用来最广义地指能够在免疫应答中起反应和/或诱导免疫应答的物质。所指“抗原”包括抗原决定簇或表位。在该上下文中的抗原视为免疫交互式分子，并且更特别地，视为单克隆抗体。任何对靶抗原具有结合亲和力的分子被称之为“抗原结合分子”。应当理解该术语延及免疫球蛋白(例如多克隆或单克隆抗体)、免疫球蛋白片段以及由免疫球蛋白衍生的表现出抗原结合活性的蛋白骨架。术语“抗体”和“抗原结合分子”包括这些分子的脱敏形式。而针对其可定向发生特定的免疫应答的部分抗原分子被称之为“抗原决定簇”或 “表位”，并且包括半抗原。典型地，在动物体中，抗原同时呈递几个甚至许多抗原决定簇。 “半抗原”是能够与抗体特异性结合的物质，但是不能或者仅能较差地诱导免疫应答，除非结合到载体上。半抗原典型地包括单个的抗原决定簇或表位。如上所述，尽管本发明优选的抗体是用于人类的脱敏形式的鼠单克隆抗体，本发明延及任何来源的和脱敏用于任何宿主的抗体。动物和禽类来源以及宿主的实例包括人类、灵长类、家畜类动物(例如绵羊、奶牛、马、猪、驴)、实验室试验动物(例如小鼠、家兔、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如狗、猫)、家禽类(例如鸡、鸭、鹅、火鸡)以及猎禽(例如雉)。脱敏抗体或其部分还可以在非动物组织例如植物中产生。植物特别被用作单链抗体的来源。本发明的另一方面考虑生产对人D-二聚体或其它交联血纤维蛋白衍生物的抗原决定簇具有特异性的脱敏单克隆抗体的方法，所述方法包括(i)获取人交联血纤维蛋白衍生物或者含有相同成分的提取物；(i i)在非人动物中产生对所述交联血纤维蛋白衍生物具有特异性、但不与片段D 发生交叉反应的抗体；以及(iii)对所述非人源抗体进行脱敏。交联血纤维蛋白衍生物可源自于任何合适的抗原提取，包括纤溶酶介导的血纤维蛋白血凝块降解，或者通过凝血酶、因子XIIIa以及纤溶酶对纤维蛋白原同时作用，使有瞬
11时的血凝块形成和随后的血凝块溶解。在后一种方法中，纤维蛋白原通过凝血酶和因子 XIIIa的作用被转化为血纤维蛋白，并随后用纤溶酶消化。当然，应当理解血纤维蛋白衍生物或含有相同成分的提取物可获自于非人动物来源。抗原来源适宜地来自于生物样品。可从动物中提取、不经处理、处理、稀释或浓缩的样品被包括在术语“生物样品” 中。上述获取粗制抗原片段的方法代表体外方法。合适的体内方法包括获取动物包括人的血清或者含有交联血纤维蛋白衍生物的其它体液，并使该体液经受PAGE步骤，其中基本上纯的交联血纤维蛋白衍生物被分离出来。或者，交联血纤维蛋白衍生物可从获自患有严重血栓紊乱的患者的血清中纯化， 以Willner等，Biochemistry 21 =2687-2692,1982所描述的利用凝胶过滤联合离子交换层析的技术为基础。抗原(也就是D- 二聚体或其它交联血纤维蛋白衍生物)可通过任何合适的方法从生物样品中分离。举例来说，分离可利用任何一种或多种抗原表面电荷性质、大小、密度、 生物活性及其对另一个实体的亲和力(例如它结合或以其它方式联合的另一个蛋白或化学化合物)。因而，举例来说，抗原从生物液中的分离可通过任何一种或多种超速离心、离子交换层析(例如阴离子交换层析、阳离子交换层析)、电泳(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦)、分子大小分离(例如凝胶过滤、超滤)以及亲和力介导的分离(例如免疫亲和分离， 包括但不限于，磁珠分离例如Dynabea 分离、免疫层析、免疫沉淀)。所使用的分离技术的挑选可以取决于特定抗原的生物活性或物理性质。优选地，从生物液中分离抗原保留了呈递在抗原表面的构象表位，从而适当地避免了导致抗原变性的技术的使用。本领域的熟练技术人员会意识到维持或者尽可能接近地模仿抗原特有的生理条件(例如它们所获自的生物液)的重要性，以确保与动物接触的抗原上的抗原决定簇或活性部位与天然抗原的是结构上完全相同的。这确保在免疫动物中能识别天然抗原的合适抗体的产生。在这种类型的一个优选实施方案中，抗原用亲和分离、 凝胶过滤及超滤的任何一种或多种从生物液中分离。免疫及随后单克隆抗体的产生可利用例如Kijhler和Milstein(Nature 256 495-499，1975 ； Kijhler禾口 Milstein, Eur. J ；Immunol. 6 (7) :511-519,1976)、Coligan 等 (Current Protocols inlmmunology, John Wiley & Sons, Inc. ,1991-1997)或 Toyama 等 ("Monoclonal Antibody, Experiment Manual" , published byKodansha Scientific, 1987)所描述的标准方法进行。基本上，动物用含有抗原的生物液或其片段通过标准方法免疫，以产生抗体生产细胞，特别是抗体生产体细胞(例如B淋巴细胞)。然后这些细胞可从免疫动物中取出用于无限增殖。抗原可能需要首先与较大的分子结合。后者是典型的高分子量的任何物质，其上天然地或人工地交联有非免疫原性或弱免疫原性的物质(例如半抗原)以增强它的免疫原性。抗体生产细胞的无限增殖可利用本领域众所周知的方法进行。举例来说，无限增殖可通过利用 Epstein-Bart 病毒(EBV)转化的方法(Kozbor 等，Methods in Enzymology 121 :140,1986)实现。在一个优选的实施方案中，抗体生产细胞利用细胞融合方法无限增殖(被记载在Coligan等，1991-1997中，同前)，这在单克隆抗体的生产中被广泛使用。在这种方法中，具有产生抗体潜能的抗体生产体细胞，特别是B细胞，与骨髓瘤细胞系融合。这些体细胞可以源自于致敏动物的淋巴结、脾和外周血，优选地是啮齿类动物例如小鼠和大鼠。在本发明的例示性实施方案中，利用了小鼠脾细胞。不过，可以利用大鼠、家兔、绵羊或山羊细胞，或者其它动物物种的细胞替代。已经从淋巴细胞肿瘤建立了用于杂交瘤生产融合方法的特殊化骨髓瘤细胞系 (Kiihler和 Milstein，1976，同前；Siulman 等，Nature 276. -269-270，1978 ；Volk 等，J ViroL 42(1) :220_227，1982)。这些细胞系至少是由于三个原因而被建立。第一个是易化融合杂交瘤从未融合而相似地无限自我增生的骨髓瘤细胞中的挑选。通常，这通过利用具有酶缺陷、使其不能够在支持杂交瘤生长的选择培养基中生长的骨髓瘤来完成。第二个原因起因于淋巴细胞肿瘤细胞产生其自身抗体的固有能力。为消除杂交瘤产生肿瘤细胞抗体，利用了不能够产生内源性轻链胡重链免疫球蛋白链的骨髓瘤细胞系。选择这些细胞系的第三个原因在于它们用于融合的适当性和有效性。许多骨髓瘤细胞系可用于产生融合细胞杂合子，包括，例如P3X63_Ag8、 P3X63-AG8. 653、P3/NSl_Ag4_l (NS-I)、Sp2/0_Agl4 以及 S194/5. XXO. Bu. 1。P3X63_Ag8 和 NS-I细胞系已由Kijhler和Milstein(1976，同前)描述。Shulman等(1978，同前)建立了 Sp2/0-Agl4骨髓瘤系。S194/5. XXO. Bu. 1 系由 Trowbridge (J Exp. Med. 148(1) :313-323, 1978)报道。产生抗体生产脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞杂合子的方法通常包括将体细胞和骨髓瘤细胞分别按10 1的比例(尽管该比例从大约20 1到大约1 1变化)，在存在促进细胞膜融合的一种制剂或数种制剂(化学、病毒或电)的条件下混合。融合方法已有描述(Kijhler 和 Milstein，1975，同前;Kijhler 和 Milstein，1976，同前；Gefter 等， Somatic Cell Genet. 3 =231-236,1977 ；Volk等，1982，同前)。那些研究者所用的融合促进制剂为仙台病毒和聚乙二醇(PEG)。由于融合操作以极低的频率产生有活力的杂合子(例如，当脾细胞用作为体细胞来源时，大概每1XIO5个脾细胞才能获得一个杂合子)，优选具有一种方法将融合细胞杂合子从其余的未融合细胞、特别是未融合的骨髓瘤细胞中挑选出来。在其它所产生的融合的细胞杂合子中检测到所需的抗体生产杂交瘤的方法同样是必要的。一般地，融合的细胞杂合子的挑选是通过在支持杂交瘤生长但是防止未融合的骨髓瘤细胞生长的培养基中培养细胞来实现，其通常会继续无限分裂。融合中所用的体细胞在体外培养中不能维持长期的生存力，所以不构成问题。在本发明的实施例中，利用了骨髓瘤细胞缺乏的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT-阴性)。这些细胞的挑选在黄嘌呤/氨基喋呤/胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基中进行，在该培养基中融合的细胞杂合子由于脾细胞的HPRT-阳性基因型而存活。利用具有不同遗传缺陷(药物敏感性等)、能够在支持基因型感受态杂合子生长的培养基中被挑选出来的骨髓瘤细胞也是可能的。需要数周选择性地培养融合细胞杂合子。在该阶段的早期，有必要鉴定那些产生所需抗体的杂合子，从而它们可以被随后克隆并增殖。一般而言，10%左右的获得的杂合子产生所需抗体，虽然从大约1到大约30%的范围是不常见的。抗体生产杂合子的检测可通过许多标准试验方法中的任何一种来实现，包括酶联免疫试验以及放射免疫试验技术， 例如如 Kennet 等((编辑)Monoclonal Antibodies andHybridomas :A New Dimension in Biological Analyses,pp. 376-384,Plenum Press,New York, 1980)中所描述的。在一个特别优选的实施方案中，利用液相D-二聚体进行酶联免疫吸附试验(ELISA)来挑选抗体-产生克隆。所需融合细胞杂合子一经挑选并克隆进个体抗体生产细胞系中，每种细胞系就可以两种标准方法中的任何一种加以增殖。杂交瘤细胞悬液可被注射到组织相容性动物体中。被注射动物随之产生分泌由该融合的细胞杂合子所产生的特定单克隆抗体的肿瘤。该动物的体液，例如血清或腹水，可被穿刺放液以提供高浓度的单克隆抗体。或者，个别细胞系可在实验室培养容器中进行体外增殖。含有高浓度单个特定单克隆抗体的培养基可通过移注、过滤或离心收集，然后纯化。细胞系通过任何合适的免疫检测方法测试其检测目的抗原的特异性。举例来说，细胞系可被等分到许多孔中并温育，而来自每个孔的上清液通过酶联免疫吸附试验 (ELISA)、间接荧光抗体技术等进行分析。鉴定产生能够识别靶抗原但是不识别非靶表位的单克隆抗体的细胞系，然后直接在体外培养或注射到组织相容性动物体中以形成肿瘤，并产生、收集和纯化所需的抗体。因此，本发明在第一步中提供了特异性地与D-二聚体或其他交联血纤维蛋白衍生物相互作用的单克隆抗体。如上文所指出的，非动物细胞例如植物、酵母和/或微生物细胞也可被用于产生典型的单链抗体。在这个实施方案中，这样的细胞被设计表达编码抗体的一个链的核酸分子。然后单克隆抗体经受脱敏方法。这样的过程可采取多种形式，包括与根据本发明制备的单克隆抗体具有相同或相似特异性的嵌合抗体的制备。嵌合抗体是其轻链和重链基因是典型地通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因构建的抗体。因此，根据本发明，一旦获得产生所需单克隆抗体的杂交瘤，利用技术产生种间单克隆抗体， 其中一个物种的结合区与另一个物种的抗体非结合区组合(Liu等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :3439-3443,1987) 0举例来说，来自非人(例如鼠)单克隆抗体的CDRs可被移植到人类抗体上，从而“人源化”该鼠抗体(欧洲专利公开号No. 0 239 400 Jones等，Nature 321 :522-525,1986 ；Verhoeyen 等，Science 239 :1534-1536,1988 ；Riechmann 等，Nature 332 :323-327,1988)。在本案中，脱敏步骤是人类特异性的。更特别地，⑶Rs可被移植到带有或不带有人恒定区的人类抗体可变区。提供CDRs的非人抗体典型地被称之为“供体”，而提供骨架的人类抗体典型地被称之为“受体”。恒定区无需存在，但如果存在，他们必须与人类免疫球蛋白恒定区基本上相同，也就是说，至少大约85-90%，优选大约95%或更大的相同性。因此，人源化抗体的所有部分，可能除了 CDRs，与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分基本上是相同的。因此，“人源化抗体”是包括人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。通过“人源化”步骤，供体抗体被表述为“人源化了的”，因为产生的人源化抗体预期可以结合与提供CDRs的供体抗体相同的抗原。本文指的“人源化”包括指对特定宿主，在本案中，人类宿主脱敏的抗体。应当理解脱敏的抗体可以具有其它的对抗原结合或其它免疫球蛋白功能基本上没有影响的保守氨基酸取代。例示性的保守取代可根据表2进行。表

本发明涉及人源化形式的小鼠单克隆抗体DD-3B6/22。该抗体对D-二聚体、交联血纤维蛋白多聚体的降解片段具有特异性。本发明还包括这些抗体在体内检测血块的应用。