专利名称：与pd发病相关的基因网络通路分析模型的建立方法帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是常见于中老年人群的第二大神经退行变性疾病，它的四大临床症状表现为静止性震颤、强直、运动迟缓和姿势反射障碍。随着人 们生活水平的不断提高，人类寿命不断延长，老龄化社会程度将不断进展，PD等疾病已越来 越明显地影响了老年人的健康与生活。许多学者通过制作PD动物模型，对PD发病机制做 了广泛研究，提示多种因素导致PD发病，归纳起来有以下几种学说遗传因素学说、环境因 素学说、氧化应激学说、细胞凋亡学说和免疫学说等。例如家族性PD相关基因的研究，已 发现10个染色体位点以孟德尔遗传方式与PD连锁，分别命名为PARK1-10，其中5个涉及 常染色体显性遗传，4个以常染色体隐性遗传方式传递，另外1个可能与晚发性散发PD有 关，近年来，这些位点中有5个基因被克隆，α -synuclein基因、UCHLl基因、parkin基因 及另外一些基因位点的突变和缺失与PD的发病有关，其多态性也与PD易感性有关；其中 α -synuclein和UCHLl基因常见于常染色体显性遗传家族性PD，parkin基因突变常见染 色体隐性遗传的青少年型PD。有关PD机制的研究层出不穷，虽然促进了人们对PD发病机制的认识和探索有效 的治疗方法。但同一因素或多种因素造就的结果并非相同，使PD机制的研究莫衷一是。因 此，PD的防治仍为世界性的难题。纵观各类针对PD发病机制研究的报道及申请专利，我们 认为传统的针对个别蛋白、个别基因的研究手段无法达到全面把握PD发病的分子机制的 目的，因此，构建与PD发病相关的基因网络通路是深入了解PD发病分子机制的良好基础， 也为研究其他疾病发生的分子机制提供了范例。基因表达数量性状基因座定位技术是近几年新形成一种高通量的研究手段，结合 了基因表达分析和数量性状基因座定位，能够同时分析基因表达和基因表达调控。2001年， Jansen和Nap提出将全基因组中的每个基因的mRNA表达量看作数量性状，对其进行QTL定 位分析通过基因芯片技术获得分离群体的全基因组表达谱，构建群体内每个个体的分子 标记连锁图谱，通过对基因表达量的QTL定位将控制某基因表达的基因座(eQTL)定位到基 因组上的具体位置。一个eQTL就是染色体上的一个位点，这个位点可以包含一个或多个基 因，这个(些)基因控制着某个基因表达的遗传变异。2002年，Brem等人率先将该研究手 段成功应用到酵母的研究中；2003年，Schadt等人应用该方法在F2小鼠中寻找致病基因 通路。2005年，Lu L等人首次应用该方法研究基因重组纯系小鼠前脑的基因调节通路。随 后，该方法被成功应用到多个物种的研究中，如玉米、果蝇、大鼠和人类等。至于将基因表达 数量性状基因座定位技术应用到PD发病机制的研究中，目前国内外还无相关报导。
本发明的目的在于提供一种与PD发病相关的基因网络通路分析模型的建立方法。 本发明的技术解决方案是—种与PD发病相关的基因网络通路分析模型的建立方法，其特征是包括下列步 骤收集PD发病相关基因，确定PD发病相关基因的上游调控位点，筛选上游调控位点候选 基因，确定PD发病相关基因间的协同或调控关系，构建基因表达调控网络通路。所述收集PD发病相关基因，包括应用生物信息学手段收集已报道的PD相关基因 及采用1-甲基-4苯基_1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)注射法建立PD动物模型，应用基因芯片 技术分别获取PD模型组和正常组动物的中脑和前脑的基因表达资料，并筛选出两组间基 因表达差异具有明显统计学意义的基因。实现确定PD发病相关基因的上游调控位点的方法，是将基因表达水平视为数量 性状进行数量性状基因座定位的研究，借助于BXD重组近交系小鼠基因表达资料和基因 分型数据，进行基因表达数量性状基因座定位分析，对所收集的基因表达资料进行基因连 锁分析，包括区间连锁分析、复合连锁分析和交互影响连锁分析，从而确定PD相关基因的 上游调控位点；通过置换试验和FDR(false discovery rate)分析，从而筛选出具有统计学 意义的上游调控位点。所述筛选上游调控位点候选基因，主要步骤如下通过增加局部基因组扫描的密 度，缩小上游调控基因位点95%可信区间范围；通过对亲代B6和D2小鼠基因表达量的分 析，筛选出在两亲本间基因表达水平有显著差异的基因；通过生物信息学方法筛选出与中 脑和前脑的发育、结构以及功能相关的基因；通过原位杂交方法筛选出在中脑和前脑高效 表达的基因；借助于SNP数据库，筛选出在B6和D2间存在功能性SNP或其他序列多态性的 基因。本发明借助于BXD重组近交系(Recombinant Inbred，RI)小鼠基因表达资料和基 因分型数据(genotype)，进行基因表达数量性状基因座定位分析，对所收集的基因表达资 料进行基因连锁分析，包括区间连锁分析、复合连锁分析和交互影响连锁分析，从而确定PD 相关基因的上游调控位点；通过置换试验和FDR(False discovery rate)分析，从而筛选出 具有统计学意义的上游调控位点。(1)将基因表达水平视为数量性状进行数量性状基因座 定位的研究；(2)选择BXD RI小鼠作为研究对象，其基因分型资料稳定，可反复使用；每一 品系的同一资料可从多个个体反复提取，从而减少数据的误差，提高定位的准确性；不同时 间或不同实验室的数据也可累加及联合进行分析；来自BXD RI小鼠的所有资料都可在遗 传学上进行相关分析。所述确定PD发病相关基因间的协同或调控关系，构建基因表达调控网络通路是 应用专门用于基因网络分析的软件及网站对上游候选基因和其下游被调节基因进行分析， 建立相关基因之间的网络调节通路。本发明本发明方法简便，易操作，可以有效建立与PD发病相关的基因网络通路分 析模型。下面结合实施例对本发明作进一步说明。 本发明公开了一种与PD发病相关的基因网络通路分析模型的建立方法，包括下列步骤收集PD发病相关基因，确定PD发病相关基因的上游调控位点，筛选上游调控位点候选基因，确定PD发病相关基因间的协同或调控关系，构建基因表达调控网络通路。本发明方法简便，易操作，可以有效建立与PD发病相关的基因网络通路分析模型。