专利名称：一种由内源酶水解黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷制备并分离纯化黄芩素和汉黄芩素的方法黄岑为唇形科植物黄岑(Scutellaria baicalens is Georgi)的干燥根，是一种名贵的中药材，首载于古代第一部本草著作《神农本草经》，其药用历史悠久，是我国广泛应用的传统中药材之一。其性寒味苦，归肺、胆、胃、大肠经，具有清热燥湿、止血安胎、泻火解毒、降压等功效，可用于治疗上呼吸道感染、泌尿系统感染、肺炎、肝炎、痢疚、高血压等。黄芩中的主要活性成分是黄芩苷、汉黄芩苷及其微量苷元黄芩素和汉黄芩素。大量药物代谢研究表明，对疗效起主要作用的是黄芩素和汉黄芩素，黄芩经口服后其糖苷在消化系统内被肠道菌群转化为苷元才能被吸收利用(Lai，et al.，2003)。黄芩苷在人体内很难被吸收，体内转化率低，而黄芩素容易被吸收，生物利用度高(赵晶等，1998)。而且，大量体内外药理活性研究表明，黄芩素和汉黄芩素的药理活性也远高于其糖苷成分，尤其是清除自由基及抗氧化(Gao, et al., 1999)、抗艾滋病毒(Wu, ea al.,2001)、抗血管生成(Liu, et al.，2003)作用等均高于黄芩苷和汉黄芩苷。此外，为进一步深入开发利用黄芩资源，黄芩素也广泛应用于保健食品和化妆品工业。因此，将黄芩苷和汉黄芩苷转化为活性作用更好、生物利用度更高的黄芩素和汉黄芩素已引起人们的广泛关注。申请号为200302129372.4的专利公开了一种利用强酸水解黄芩苷的葡萄糖醛酸基转化成黄芩素的方法。该方法需要在100°C下水解16-20小时，反应条件高，时间长，且加入强酸对黄芩苷破坏较大，环境污染严重。申请号为200410020649.6的专利公开了一种酶法水解黄芩苷葡萄糖醛酸基制备黄芩素的方法。该方法虽然克服了现有技术所存在的对黄芩苷破坏性大，污染严重的缺点，但需要通过微生物(细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌和担子菌)在产酶诱导物(黄岑苷、黄 酮苷和异黄酮苷)参与下进行30-90小时的发酵产酶,再利用含酶发酵液水解黄芩苷葡萄糖醛酸基制备黄芩素，水解时间长达48小时。这一工艺虽然可得到较高的转化率，但需要对产酶微生物进行筛选，发酵工艺复杂，反应时间长，后续纯化精制工艺麻烦，工业成本过高。
针对黄芩中对疗效起主要作用的黄芩素和汉黄芩素含量低，含量分别约为1.7%和0.6 %，分离纯化困难，且现有的水解转化技术工艺复杂，成本过高，环境污染严重等问题，本发明的目的是提供一种简便、安全、经济、高效、内源酶法水解黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷制备并分离纯化黄芩素和汉黄芩素的方法。该内源酶被命名为黄芩苷酶，是一种存在于黄岑根中的β-D-葡萄糖醛酸酶，在合适的培养条件下可直接将黄芩中的黄芩苷及汉黄芩苷水解为黄芩素和汉黄芩素。所采取的技术方案是:以中药黄芩为原料，采用独创性的内源酶诱导生物转化技术、负压空化提取技术、液液萃取技术、正相硅胶中低压制备液相色谱技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列高效转化、提取、分离和纯化技术手段，得到高产率、高纯度的黄芩素和汉黄芩素。具体方案如下:(I)内源酶诱导生物转化:称取中药黄芩，放入恒温负压空化反应器中，力口入用浓盐酸调节pH值为4 6的蒸馏水，在35 55 °C酶解60 120min，真空度为-0.04 -0.06Mpa。(2)负压空化提取:在酶解后的黄芩样品中加入10 20倍体积70 80%的乙醇溶液，室温提取I 3次，每次30 90min，真空度为-0.06 -0.08Mpa,合并提取液，减压浓缩至干后用蒸馏水溶解。(3)液液萃取:将得到的粗提物的水溶液，以体积比1:1 1: 3的乙酸乙酯为萃取溶剂，萃取5 7次，减压浓缩至干，得到固形物。(4)正相硅胶中低压制备:预先称取质量为样品量的20 30倍的300 400目的硅胶，采用干法装柱，连接仪器后用正己烷润柱5 IOmin ;将拌有硅胶的样品均匀洒在硅胶柱中，连接仪器，用20:1 1:1的正己烷和乙酸乙酯的混合液做流动相，根据紫外检测器监测下色谱峰的分离情况调节流动相比例，并以10 30 mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液。(5)低温析晶和重结晶:制备得到的目标产物溶液，减压浓缩至干，用丙酮溶解，低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度大于98%的黄芩素和汉黄芩素。上述生物转化所用的内源酶是存在于黄芩根部的可以直接水解葡萄糖醛酸基的黄芩苷酶。上述生物转化所用的提取器是由我室研究设计并得到专利保护(CN2597047)的负压空化提取装置。负压空化是指当装有液体的装置内压力降低时，液体内部或液固交界面上空化泡的形成、发展和溃灭的过程。一方面，空化泡在瞬间溃灭时释放极高的能量，弓丨起许多反应位点局部高温高压，从而加快反应速率。另一方面，空化泡产生强烈的空化效应和机械振动，引起样品颗粒细胞壁快速破裂，加速胞内物质向介质释放、扩散和溶解，从而促进提取。上述分离纯化所用的正相硅胶中低压制备液相是带有一个二元泵和一个紫外检测器，可以在紫外监测下根据色谱峰分离情况调节流动相比例实现目标成分分离的柱层析技术。上述重结晶所用的溶剂为丙酮和乙酸乙酯，重结晶所用溶剂比例为丙酮:乙酸乙酯30: I 10: 1，低温析晶温度为-4 25°C。本发明的优点和结果:1.利用能直接水解黄芩苷和汉黄芩苷葡萄糖醛酸基的内源酶一黄芩苷酶，水解制备黄芩素和汉黄芩素，其转化率均可达98%以上。克服现有技术存在的工艺复杂，条件要求高，转化率低，对化合物结构破坏大，环境污染严重的缺点。2.本发明采用负压空化提取技术、液液萃取技术、正相硅胶中低压液相制备技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列高效提取、分离和纯化的技术手段，得到纯度高达98%以上的黄芩素和汉黄芩素。3.与现有方法相比，该内源酶转化方法工艺简单，操作条件温和，安全无污染且转化率高；提取、分离及纯化方法工艺技术先进，效率高，目标成分纯度高，生产周期短，耗能低，降低了工业成本，可实现黄芩素和汉黄芩素在食品保健及制药工业方面大规模的产业化生产。具体实施方案实施例1精密称取中药黄芩10g，加入pH为5的蒸馏水并转移至恒温负压空化反应器中，在35°C酶解60min，真空度为-0.04Mpa。内源酶诱导转化后，滤掉滤液，加入15倍体积的70%乙醇溶液负压空化提取，真空度为-0.06Mpa，室温提取3次，每次50min。合并提取液，减压浓缩至干，得到的粗提物经HPLC检测黄芩苷和汉黄芩苷的转化率分别为95.21%和93.57%，黄芩素和汉黄芩素含量可达9.65%和2.10%，与原来的1.79%和0.61%相比分别提高了 4.38倍和2.46倍。将转化后所得粗提物用蒸馏水溶解，以等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，减压浓缩至干，得到固形物。用少量甲醇溶解，加入与固形物等质量的目数为300 400的层析硅胶炒样。预先称取质量为样品量的20倍的硅胶干法装柱，连接仪器，设置流速为20mL/min，用正己烷润柱5min。将拌好硅胶的样品装入润过的中压柱内，设置流动相洗脱梯度及紫外检测波长，运行程序，在紫外监测下根据色谱峰分离情况调节流动相比例并收集洗脱液。浓缩洗脱液，低温 析晶得到黄芩素和汉黄芩素，重结晶后得到纯品，纯度分别为98.652%和 98.021%。实施例2精密称取中药黄芩10g，加入pH为5的蒸馏水并转移至恒温负压空化反应器中，在50°C酶解90min，真空度为-0.06Mpa。内源酶诱导转化后，滤掉滤液，加入20倍体积的70%乙醇溶液负压空化提取，真空度为-0.08Mpa，室温提取3次，每次90min。合并提取液，减压浓缩至干，得到的粗提物经HPLC检测黄芩苷和汉黄芩苷的转化率分别为98.39%和98.16%，黄芩素和汉黄芩素含量可达9.83 %和2.33%，与原来的1.79%和0.61 %相比分别提高了 4.47倍和2.85倍。将转化后所得粗提物用蒸馏水溶解，以等体积的乙酸乙酯萃取7次，合并萃取液，减压浓缩至干，得到固形物。用少量甲醇溶解，加入与固形物等质量的目数为300 400的层析硅胶炒样。预先称取质量为样品量的30倍的硅胶干法装柱，连接仪器，设置流速为20mL/min，用正己烷润柱lOmin。将拌好硅胶的样品装入润过的中压柱内，设置流动相洗脱梯度及紫外检测波长，运行程序，在紫外监测下根据色谱峰分离情况调节流动相比例并收集洗脱液。浓缩洗脱液，低温析晶得到黄芩素和汉黄芩素，重结晶后得到纯品，纯度均为98%以上。说明书附1黄芩样品水解前㈧、后⑶的HPLC色谱2纯化后黄芩素㈧和汉黄芩素⑶的HPLC色谱图
本发明涉及一种由内源酶水解黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷制备并分离纯化黄芩素和汉黄芩素的方法，目的是提供一种简便、安全、经济、高效地从黄芩中提取、分离和纯化高纯度黄芩素和汉黄芩素的方法。所采取的技术方案是以中药黄芩为原料，采用独创性的内源酶诱导生物转化技术、负压空化提取技术、液液萃取技术、正相硅胶中低压制备液相色谱技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列高效转化、提取、分离和纯化技术手段，最终得到高纯度的黄芩素和汉黄芩素，黄芩苷和汉黄芩苷的转化率分别可达98.39％和98.16％，目标产物黄芩素和汉黄芩素的含量提高了4.47倍和2.85倍，纯度均可达98％以上。本发明克服了现有技术所存在的对黄芩苷和汉黄芩苷的破坏作用大，转化率低，污染严重等缺点，具有生产工艺简单易行、安全环保，转化率高、目标化合物纯度高的优点，对医药、保健产品的开发，以及工业化生产和应用有很重要的意义。