轮状病毒基因重配株制作方法

白植生, 朱伟文

2003年2月12日

2002年5月16日

2002年5月16日

北京诺泰科华生物技术开发有限公司

A61K39/12GK1396258SQ0211768

轮状病毒 重配 基因

1. 一组轮状病毒基因重配株，其特征在于该组基因重配株以羔羊轮状病毒dsRNA基因组为遗传背景，携带有人轮状病毒(G1，G2，G3或G4血清型)VP7中和抗原蛋白编码基因片段(第7，8，或9基因片段)，和/或VP4中和抗原蛋白编码基因片段(第4基因节段)，或兼有人轮状病毒的另一个基因片段2. 权利要求1的一组轮状病毒基因重配株，其特征在于以羔羊轮状病毒NT株(G10型)dsRNA基因组为遗传背景，即含有羔羊轮状病毒dsRNA基因组中的8个以上基因片段，但编码VP7中和抗原的第9基因片段除外3. 权利要求1的一组轮状病毒基因重配株，其特征在于含有人轮状病毒(G1，G2，G3或G4血清型)dsRNA基因组中的VP7中和抗原蛋白编码基因片段(第7，8，或9基因片段)，和/或VP4中和抗原蛋白编码基因片段(第4基因节段)，和/或兼有人轮状病毒dsRNA基因组的另一个其它基因片段，即该组轮状病毒基因重配株所含人轮状病毒dsRNA基因组的基因片段不超过3个4. 如权利要求1，2，和3中所述的轮状病毒基因重配株，其中的一个亲本株，即对人弱毒的动物轮状病毒，是天然发生和分离的羔羊轮状病毒(NT株)5. 如权利要求1，2，和3中所述的轮状病毒基因重配株，其中另一个亲本株，即人轮状病毒G1，G2，G3或G4血清型VP7(和/或VP4)中和抗原蛋白的供体，选自人轮状病毒VP7血清型G1，VP7血清型G2，VP7血清型G3，VP7血清型G4，均为已知的国际实验室标准参考株6. 权利要求1至3的一组轮状病毒基因重配株中，含有特定的人轮状病毒(G1，G2，G3或G4血清型)dsRNA基因组中的第7，或8，或9基因片段，即编码VP7中和抗原蛋白基因片段7. 权利要求1至3的一组轮状病毒基因重配株中，含有羔羊—人轮状病毒G1型基因重配株，即NT1轮状病毒基因重配株8. 权利要求1至3的一组轮状病毒基因重配株中，含有羔羊—人轮状病毒G2型基因重配株，即NT2轮状病毒基因重配株9. 权利要求1至3的一组轮状病毒基因重配株中，含有羔羊—人轮状病毒G3型基因重配株，即NT3轮状病毒基因重配株10.权利要求1至3的一组轮状病毒基因重配株中，含有羔羊—人轮状病毒G4型基因重配株，即NT4轮状病毒基因重配株11.权利要求1至3和7至10中的任何一项轮状病毒基因重配株用于制备轮状病毒疫苗，预防轮状病毒性腹泻的用途12.权利要求1至3和7至10中的任何一项轮状病毒基因重配株用于制备轮状病毒抗原和抗体的用途13.权利要求1至3和7至10中的任何一项轮状病毒基因重配株用于制备轮状病毒诊断试剂的用途14.权利要求1至3和7至10中的任何一项轮状病毒基因重配株用于同其他轮状病毒进行基因再重配的用途15.权利要求以羔羊轮状病毒NT株dsRNA基因组为遗传背景，选育和组建与任何其他人轮状病毒G血清型毒株dsRNA基因组的基因重配株16.权利要求1至3和7至10中所述的基因重配株，在基因重配技术和方法中应用特定的感染复数(M.O.I.)17.权利要求1至3和7至10中所述的基因重配株，中试批量培养的宿主系统是新生小牛肾原代和二代细胞18.权利要求1至3和7至10中所述的基因重配株，中试批量培养的宿主系统是Vero传代细胞19.一种保护剂用于保护权利要求1至3和7至10中的任何一项轮状病毒基因重配株病毒活性的稳定性20.一种检定轮状病毒病毒活性的方法用于检测轮状病毒样品的病毒滴度

本发明涉及一组轮状病毒基因重配株，用于生产口服轮状病毒活疫苗，预防小儿轮状病毒腹泻，对控制人类轮状病毒感染和腹泻流行有重大意义我国每年婴幼儿腹泻病例约为3.5亿人次，在3岁以下因急性腹泻住院的病儿中，年平均33％为轮状病毒感染性腹泻，秋冬季流行季节时可达50％以上采用对肠道传染病的一般预防措施，如社会公共卫生和个人卫生条件的改善，水源改善和粪便管理等，对轮状病毒腹泻未能取得明显预防和控制的效果临床对轮状病毒腹泻至今尚无特效的药物和疗法以前曾推广的口服补液疗法(ORS)也未取得明显效果因此，研究开发理想的安全有效的轮状病毒疫苗来预防婴幼儿的严重的轮状病毒性腹泻已是一项全球性迫切任务数十年来，许多病毒疫苗对预防和控制病毒性传染病取得了十分显著的效果，如天花，脊髓灰质炎，麻疹，流行性腮腺炎，乙型肝炎等特别是1979年10月26日世界卫生组织宣布，天花已从地球上被消灭，这是人类历史上第一个使用疫苗消灭的传染病，十分明显地证实了疫苗对人类做出的贡献像其他病毒疫苗研发过程一样，人用轮状病毒疫苗研发途径有活疫苗(动物株轮状病毒活疫苗，人—动物基因重配株活疫苗，新生儿轮状病毒弱毒株活疫苗，人轮状病毒冷适应株减毒活疫苗)，灭活疫苗(轮状病毒灭活疫苗)，病毒样颗粒疫苗等轮状病毒活疫苗研究和开发从1983年开始，主要策略是采用琴纳氏种痘法原理，即“种牛痘预防人类天花”轮状病毒可感染人和许多幼小动物，有严格的宿主特异性，非人宿主的轮状病毒对人为无毒或弱毒因此，接种动物轮状病毒对人是安全的，并可获得有效的免疫，如牛轮状病毒RIT4237株(1983)，WC3株(1988)，猴轮状病毒MMU 18006株(1985)，羊轮状病毒LLR株(1988)，都是用动物轮状病毒原株研发人用的口服轮状病毒活疫苗随后，国际上又致力于轮状病毒基因重配株口服轮状病毒活疫苗的研发，即在动物轮状病毒基因组弱毒性状的基础上，利用基因重配技术换入人轮状病毒G1型，G2型，G3型和G4型的编码VP7和VP4抗原蛋白的基因片段，以此加强疫苗的免疫效果如猴—人轮状病毒基因重配株四价口服活疫苗(RRV-TV)，以及正在开发的牛UK株和WC3株—人轮状病毒基因重配株四价活疫苗美国的猴—人轮状病毒基因重配株四价活疫苗(RRV-TV)在1998年已经由美国食品药品监督管理局(FDA)批准注册，此疫苗包括D-RRV(G1)，DS-1-RRV(G2)，RRV(G3)和ST3-RRV共四个基因重配株，临床观察结果表明，小儿口服此疫苗后对轮状病毒腹泻的保护率为49-68％，对轮状病毒重型腹泻的保护效果为65-100％人—牛基因重配株四价口服活疫苗(WC3-QV)，此疫苗包括WI79-9(G1)，SC2-9(G2)，WI78-8(G3)，和WI79-4(VP4基因片段)共四个基因重配株II期临床观察结果，小儿经口服接种后，发热反应明显减少，对重型和中型轮状病毒腹泻的保护效果可达70％人—牛基因重配株四价口服活疫苗(UK-QV)，此疫苗包括D-UK(G1)，DS-1-UK(G2)，P-UK(G3)和ST3-UK(G4)共四个基因重配株，II期临床观察结果，小儿经口服接种后，副反应轻微，免疫效果良好本发明的目的是利用基因重配技术，将我国分离的羔羊轮状病毒(NT株)同人轮状病毒毒株进行基因重配，提供一组基因重配株，即携带人轮状病毒特异性有效抗原VP7(和/或VP4)编码基因片段的动物轮状病毒，构建成一组安全，高效的轮状病毒活疫苗的理想疫苗株，具有良好的生物学性状，可用于生产口服轮状病毒活疫苗，轮状病毒诊断试剂及轮状病毒抗原和抗体，用于小儿轮状病毒腹泻的预防和诊断基因重配原理和技术方法已在分子病毒学研究和病毒疫苗研制中广泛应用，如病毒基因与编码蛋白，基因型(电泳型)的多型性、流感病毒冷适应株基因重配株疫苗、轮状病毒基因重配株活疫苗等轮状病毒基因组由11个节段的双链RNA组成，每一个基因节段编码一个蛋白质，第1，2，3基因分别编码VP1，VP2，和VP3蛋白，是组成病毒核心的结构蛋白；第6基因编码VP6，是决定病毒组和亚组特异性的抗原蛋白；第4基因编码VP4蛋白，第7，8，或9基因编码VP7蛋白(视不同毒株而定)，VP4和VP7是两个主要的诱导产生中和抗体的外壳结构蛋白(表面抗原)，是决定血清型的抗原蛋白，在轮状病毒感染免疫和疫苗免疫中起着十分重要的作用；第5，7，8，10，和11基因分别编码非结构蛋白NSP1-NSP5轮状病毒的血清型分为G型和P型，VP7血清型为G型，目前已知有14个G血清型，其中10个已在人类腹泻粪便标本中检出(1，2，3，4，5，6，8，9，10，12型)，临床和流行病学调查研究表明G1，2，3，和4型最常见，可占婴幼儿轮状病毒腹泻的90％以上，G1型更是主要流行型别VP4血清型为P型，目前已知有19个P血清型人类轮状病毒有5个血清型，其中P1A为G1，3，和4型毒株所共有，P1B为G2型毒株所有一般认为，VP7是轮状病毒主要中和抗原，VP4是轮状病毒次要中和抗原婴幼儿感染轮状病毒腹泻后，可产生抗VP7和抗VP4的中和抗体，抵抗轮状病毒的再感染或减轻轮状病毒再感染的症状因此，为了开发更为安全有效的理想的轮状病毒活疫苗，对原有的动物轮状病毒株活疫苗进行了改造，即通过基因重配理论和技术，将人轮状病毒的中和抗原VP7(和/或)VP4的编码基因片段交换到动物轮状病毒基因组上，构建出新的轮状病毒基因重配株，开发了或正在开发轮状病毒基因重配株口服活疫苗，临床观察已见成功状病毒NT株RNA基因组中的8个基因片段以上；2)各基因重配株基因组中携带人轮状病毒G1型，G2型，G3型，或G4型VP7血清型抗原编码基因片段本发明上述各基因重配株在新生小牛肾原代细胞和Vero传代细胞培养中生长良好，各基因重配株培养物经MA-104细胞检定结果，病毒滴度可达4.5-5.5log10 TCIDEA50/ml本发明为轮状病毒培养物病毒滴定提供一种新方法，即TCIDEA50法本发明上述各基因重配株经细胞培养50代结果证实，遗传性状稳定，RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱未见改变本发明上述各基因重配株病毒活性稳定性良好，37℃耐热性试验合格本发明为确保上述基因重配株培养物的耐热稳定性，提供一种性能良好的蔗糖果糖保护剂为实现上述目的，本发明的发明人确定下述优选的技术方案1)基因重配株的动物轮状病毒亲本株(亲本株1)是对人弱毒性状的动物轮状病毒，即羔羊轮状病毒NT株，是用细胞培养从羔羊腹泻粪便中分离的自然分离株，属轮状病毒A群，G10型，P12型，电泳图谱为长型；2)基因重配株的人轮状病毒亲本株(亲本株2)是人轮状病毒G1型Wa株，G2型DS-1株，人轮状病毒G3型(本实验室采用同为G3型的猴轮状病毒SA11株)，G4型Hochi株，均为实验室通用的标准参考株亲本株2提供G1型，G2型，G3型，或G4型VP7(和/或VP4)中和抗原编码基因片段；3)进行基因重配的宿主系统是适于轮状病毒繁殖的MA-104传代细胞(恒河猴胎肾传代细胞)；4)利用混合感染法进行基因重配，控制两个亲本株病毒的细胞感染复数(m.o.i.)获得轮状病毒的混合培养物，包括亲本株1和亲本株2及基因片段不同组合的子代基因重配株；5)利用蚀斑分离法和终末稀释分离法筛选目的基因重配株，即以羔羊轮状病毒基因组为遗传背景(不少于8个羊轮状病毒基因片段，不含羊轮状病毒第9基因片段，即编码G10型VP7抗原的基因片段)，并重配了人轮状病毒G1型，G2型，G3型，或G4型毒株VP7(和/或VP4)中和抗原编码基因片段，即第7，第8，或第9基因片段(因不同毒株而异)；6)利用轮状病毒RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳(混合交叉电泳)鉴定子代基因重配株，并确定基因重配株的11个基因片段，特别是VP7抗原编码基因片段，来自哪个亲本株；7)利用轮状病毒VP7型抗原单克隆抗体ELISA法鉴定子代基因重配株的VP7型别；8)确定本发明的人--羔羊轮状病毒基因重配株在如下实施例中，将更详细地描述本发明，但是本发明不限于这些实施例实施例11.细胞培养选定适于轮状病毒繁殖的细胞系，即MA-104传代细胞(恒河猴胎肾传代细胞，ECACC 85102918)细胞生长液为市售的MEM培养基(Eagle最低必需培养基，美国GIBCO公司生产)，并加入10％(V/V)的胎牛血清或新生小牛血清(美国GIBCO公司生产)，100ug/ml卡那霉素，培养容器为方瓶培养面积为32cm2，培养温度为37℃取已生长成片的细胞，弃去培养液，用适量胰蛋白酶-Versene消化分散液(0.1％胰蛋白酶和0.02％Versene混合液，胰蛋白酶1∶250，美国Difco公司生产)，将细胞分散成游离的单个或小团细胞，按1∶3-1∶4扩大比例加入培养液，吹打均匀，接种3-4个培养瓶，置37℃温箱培养，2-4日可生长成片按实验需要，细胞也接种于培养板中(6孔，24孔，96孔，美国Nunc公司生产)，置CO2培养箱37℃培养2.轮状病毒培养取轮状病毒毒种原液，按最终浓度5.0-10ug/ml加入IX型胰蛋白酶(美国Sigma公司生产)，37℃作用1小时，病毒用MEM液稀释10-1或10-2，接种生长成片的MA-104细胞，每瓶细胞接种病毒液0.1ml，置37℃吸附1小时后，加入MEM液10ml，此培养液含0.5-1.0ug/ml IX型胰蛋白酶，置37℃培养轮状病毒引起的细胞病变为细胞圆缩，胞内颗粒增加当细胞病变75％以上时，将感染细胞置-25℃低温冰箱中冻融2次后，收获病毒液，编号后置-25℃低温冰箱保存本发明所用实验毒株和目的基因重配株的原种置-65℃低温冰箱保存实施例2轮状病毒的鉴定1)群抗原鉴定ELISA快速法，轮状病毒抗原诊断试剂盒为兰州生物制品研究所生产2)亚群抗原鉴定轮状病毒核酸电泳法(酚抽提法提取轮状病毒基因组RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染色法)本发明所用人轮状病毒毒株，电泳图谱长型为亚群II，电泳图谱短型为亚群I3)基因型(轮状病毒RNA电泳图谱)鉴定本发明所用实验毒株具有各自的独特的电泳图谱4)血清型(G型)鉴定采用轮状病毒VP7单克隆抗体ELISA法，试剂为日本Serotec Lab公司产品本型OD值应比异型OD值高2倍以上实施例3轮状病毒基因重配1)亲本株的选定亲本株1轮状病毒基因重配株的背景基因毒株是羔羊轮状病毒NT株亲本株2轮状病毒G1型，G2型，G3型，G4型毒株，是提供该型VP7(和/或VP4)编码基因片段的供体株2)基因重配以轮状病毒G4型基因重配株为例取亲本株1羔羊病毒NT株和亲本株2轮状病毒Hochi株(G4型)混合感染MA-104细胞24孔培养板(病毒接种方法见实施例1)，每孔接种0.1ml，两个毒株各0.05ml，感染复数(m.o.i.)约为2.0 TCID50/细胞置37℃吸附1小时后，用MEM液轻洗3次，每孔加入1ml MEM培养液，置37℃培养待细胞病变达到75％以上时收获以上病毒收获液为混合体，有亲本株1、亲本株2、及亲本株1、2基因重配所产生的不同的子代基因重配株实施例4轮状病毒基因重配子代重配株的分离和筛选将以上实施例3基因重配所得的病毒混合液按以下方法进行分离和筛选1)蚀斑法将病毒混合体用MEM液进行适当稀释后(10-2或10-5)，接种MA-104细胞6孔板进行蚀斑分离病毒接种方法见实施例1，在病毒吸附后加入琼脂覆盖层，即MEM培养液含0.8％琼脂糖(美国Sigma公司产品)，置37℃ CO2培养箱培养4-5日，加盖中性红(美国Sigma公司产品)琼脂，即MEM培养液含0.06％中性红，置37℃或室温下2-3日，观察蚀斑一个蚀斑理论上是一个病毒颗粒子代的繁殖体随意挑取单个子代蚀斑并移种到MA-104细胞24孔培养板扩大培养，即1个蚀斑的琼脂接种1孔出现细胞病变后收获病毒液，轮状病毒ELISA检测阳性，编号后置-25℃低温冰箱保存取上述分离后的病毒样品，提取RNA进行电泳图谱分析，根据图谱鉴定该病毒样品是亲本株，或是基因重配株结果证明蚀斑法可以挑选出单个的子代株，而且可以再通过蚀斑法将单个的子代株再克隆2)终末稀释法将病毒混合体用MEM液进行适当稀释后(10-2或10-5)，接种MA-104细胞96孔板进行终末稀释法分离，病毒接种方法见实施例1每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml，37℃培养4-5日，观察细胞病变，判定阳性或阴性按Reed-Muench法判定TCID50的终点，将低于50％阳性的稀释度的阳性孔，逐孔转移到24孔细胞培养板中培养扩增，收获病毒液轮状病毒ELISA检测阳性，编号后置-25℃低温冰箱保存在终末稀释的条件下，低于50％阳性的稀释度的阳性孔，理论上可能是一个病毒颗粒子代的繁殖体取上述分离后的病毒样品，提取RNA进行电泳图谱分析，根据图谱鉴定该病毒样品是亲本株，或是基因重配株结果证明终末稀释法法可以挑选出单个的子代株，而且可以再通过终末稀释分离法将单个的子代株再克隆实施例5基因重配子代株的选择法1)随机法如以上实施例4所述，亲本株1和亲本株2按同样接种量感染MA-104细胞，收获病毒混合样品，进行分离和筛选，其中约80％为亲本株1和亲本株2的子代病毒，即非重配子代株，约20％子代为基因重配株2)免疫血清压迫选择法体内法在亲本株1和亲本株2混合感染培养过程中，加入超量的抗亲本株1(羔羊轮状病毒NT株)的免疫血清，中和杀灭亲本株1子代病毒以及所有具有羔羊轮状病毒VP7抗原的基因重配子代株，有利于亲本株2目的基因重配株的筛选体外法或是在基因重配之后和收获病毒混合样品之后，用超量的抗亲本株1(羔羊轮状病毒NT株)的免疫血清，中和处理亲本株1子代病毒以及所有具有羔羊轮状病毒VP7抗原的基因重配子代株，然后再接种MA-104细胞培养，筛选子代株，有利于亲本株2目的基因重配株的筛选免疫血清压迫选择法所获得的基因重配混合病毒样品中所含子代株比随机法大约可少50％实施例6轮状病毒基因重配株的鉴定以轮状病毒G4型基因重配株为例1)两个亲本株基因图谱的差别提取亲本株1(羔羊NT株)和亲本株2(H株)的病毒核酸RNA样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，第一行为亲本株1，第二行为亲本株1和亲本株2的等量混合样品，第三行为亲本株2根据第二行的混合电泳图谱可见22条带，即亲本株1的11条带和亲本株2的11条带结果表明亲本株1和亲本株2的11个基因片段是各不相同的2)基因重配子代株病毒的鉴定将实施例4所分离挑选的基因重配子代株病毒样品，提取RNA样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时将亲本株1和亲本株2的RNA样品也进行电泳作为对照基因重配子代株病毒样品电泳图谱的11条带，同亲本株电泳图基因重配子代株谱进行对比，可以确定哪条片段来自哪个亲本株由此可以鉴定所挑选的子代株是亲本株1，亲本株2，或是重配株废弃亲本株1和亲本株2的子代株，保留具有混合片段的基因重配子代株3)目的基因重配株的选择根据聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱分析，选择目的基因重配株，如G4型基因重配株具有亲本株2(Hochi株G4型)的第9基因片段和亲本株1(羔羊轮状病毒NT株)的第1，2，3，4，5，6，7，8，10，11等10个基因片段实验结果在上述基因重配子代株病毒样品中，获得了目的基因重配株，即G4型基因重配子代株病毒样品，命名为NT-4株同样方法和实验过程，获得了NT-2株(G2型基因重配株)，NT-3株(G3型基因重配株)，NT-1株(G1型基因重配株)实施例7目的基因重配株的确定按上述方法获得并确认了以下的目的基因重配株(代表株)基因片段基因重配株 1 2 3 4 5 6 7 891011血清型NT-4株 羊羊羊羊羊羊羊 羊4羊羊G4NT-2株 羊羊羊羊羊羊22 2羊羊G2NT-3株 羊羊羊羊羊羊羊 羊3羊羊G3NT-1株 羊羊羊羊羊羊羊 羊1羊羊G1实施例8目的基因重配株的检定以G4型基因重配株NT-4株为例1) 轮状病毒A群，轮状病毒ELISA检测结果阳性2) 轮状病毒RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳结果阳性，11条基因片段，其中第9片段来自Hochi株(G4型)，而第1，2，3，4，5，6，7，8，10，11，基因片段则来自羔羊病毒NT株3) 血清型G型VP7单克隆抗体ELISA检测结果，证实为G4型实施例9基因重配株的遗传稳定性将确定的基因重配株在MA-104细胞培养中连续传代至第50代，结果表明基因重配株遗传性状稳定，RNA电泳图谱未见改变实施例10基因重配株的病毒滴度取基因重配株第5-10代病毒培养物，用MA-104细胞培养进行病毒滴定TCIDEA50法用MEM液将病毒样品稀释为10-1--10-5，接种96孔板，每孔0.1ml，根据细胞病变判断各孔阳性或阴性，再用轮状病毒ELISA的方法判断各孔阳性或阴性，并以ELISA结果为准，按Reed-Muench法计算TCID50，特称之为TCIDEA50基因重配株的病毒滴度为4.5-5.5log10 TCIDEA50/ml实施例11基因重配株的大量培养方法1取基因重配株NT-4株接种新生小牛肾原代细胞，采用大方瓶培养，培养面积300cm2，加液量为150ml，病毒稀释10-1--10-2，接种量为10ml.置37℃吸附1小时，培养4--5日，收获病毒液的病毒滴度达4.5-5.5log10TCIDEA50/ml方法2取基因重配株NT-4株接种Vero细胞，采用大方瓶培养，培养面积300cm2，加液量为150ml，病毒稀释10-1--10-2，接种量为10ml37℃吸附1小时，培养4--5日，收获病毒液的病毒滴度达4.0-5.0log10 TCIDEA50/ml羔羊轮状病毒NT株的大量培养方法取羔羊轮状病毒NT株接种Vero细胞，采用大方瓶培养，培养面积300cm2，加液量为150ml，病毒稀释10-1--10-2，接种量为10ml37℃吸附1小时，培养4--5日，收获病毒液的病毒滴度达4.0--5.0log10TCIDEA50/ml