专利名称：重组轮状病毒vp6载体蛋白及其制备的制作方法轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是婴幼儿腹泻的主要病原体。世界范围内每年大约有60多万例RV感染患者死亡，其中80%发生在发展中国家。RV属呼肠病毒科(Meoviridae)，轮状病毒属(Motavirus RV基因组由11个片段的双链RNA组成，分别编码6个结构蛋白(VP1-VP4, VP6和VP7)和6个非结构蛋白(NSP1-NSP5/NSP6)。 根据RV组(亚组)抗原蛋白VP6的抗原性的不同，可将至今已发现的轮状病毒RV分为A G七个组，A组是婴幼儿腹泻的主要病原体。根据病毒蛋白编码框(ORF)核苷酸序列同源性差异，可将A组轮状病毒RV的12个蛋白(基因)分为不同的基因型。根据RV基因型分类标准，A组轮状病毒RV的结构蛋白VP6至少可分为16个基因型(11-116型)。VP6蛋白由第6基因片段编码，含397个氨基酸，分子量约为44. 8KDa。VP6蛋白是轮状病毒RV中含量最丰富的蛋白，约占病毒总蛋白量的51%。RV内壳中间层由260个致密的VP6蛋白三聚体共780个蛋白分子构成。VP6蛋白具有重要的生物学功能，是病毒基因组转录和病毒组装不可缺少的成分。VP6蛋白也具有重要的免疫学性质。近年进行的VP6蛋白免疫学研究表明，一些抗VP6蛋白的IgA单克隆抗体诸如7D9所产生的IgA具有保护作用，在SCID鼠中可清除其慢性RV病毒感染。一些研究表明VP6蛋白的抗病毒作用可能是通过IgA的分泌途径而阻碍了病毒的复制循环过程，或作为一种黏膜的分泌型IgAJf RV感染的上皮细胞排除，从而起到保护作用。研究发现VP6蛋白分子中至少存在两个Th细胞抗原表位和一个交叉反应的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。有研究表明在使用麦芽糖结合VP6蛋白对小鼠进行黏膜免疫后，IFN- Y被认为是⑶4+T细胞分泌的唯一有效的抗RV的细胞因子。众多的实验表明，经VP6蛋白免疫后，在动物体内确实能引起抗RV感染的作用。抗VP6蛋白单克隆抗体具有抑制病毒转录活性和保护小鼠免受病毒感染的作用。用重组表达的VP6蛋白免疫小鼠，也可诱导小鼠产生免疫保护作用。VP6蛋白可自我组装成病毒样颗粒(VLPs)。由于VLPs没有感染性，在研究细胞相互作用，开发诊断制剂和疫苗方面，具有更好的安全性。与单一分子的重组抗原相比，VLPs具有更好的免疫原性，可刺激机体产生体液和细胞免疫反应。由于VLPs具有高密度的呈递抗原表位，可产生很强的免疫反应，是许多疫苗研制中很有前景的材料。轮状病毒TB-Chen株是从临床胃肠炎患者中分离得到的公知轮状病毒株，是我国第一株完成了全基因组分析的A组人轮状病毒RV株,轮状病毒TB-Chen株全称为RVA/Human-wt/CHN/TB-Chen/1996/G2P[4]。这是一个公知的具有很好基础研究和开发应用价值的病毒株。
本发明的目的在于提供一种重组轮状病毒VP6载体蛋白。本发明的另一个目的在于提供一种重组轮状病毒VP6载体蛋白的制备方法。本发明提供的是这样一种重组轮状病毒VP6载体蛋白，其特征在于重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因上有下列六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点Sac I(gagctc),BspT104 I (ttcgaa),Kpn I (ggtacc),Bln I (cctagg),Sac II (ccgcgg),XhoI (ctcgag)，其中: 重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的核苷酸序列如下 I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa 51aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
201aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
351aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa 501 tagatcacaa cctgcgcatg_agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg 701 atggtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat 851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcRcaRcact CRaRcatcat 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac 1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg 1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg 1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa 重组轮状病毒VP6载体蛋白由380个氨基酸组成，其氨基酸序列如下
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val lie Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys o 所述重组轮状病毒VP6载体蛋白通过下列步骤构建
1)根据轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白基因的核苷酸序列，人工设计下列引物对
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
以及下列引物
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT ；
2)以轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增 PETL5/P174R 和 P174F/PVP6-3 ；
PETL5/P197R 和 P197F/PVP6-3 ；
PETL5/P244R 和 P244F/PVP6-3 ；
PETL5/P275R 和 P275F/PVP6-3 ；
PETL5/P298R 和 P298F/PVP6-3 ；
PETL5/P308R 和 P308F/PVP6-3 ；PCR扩增反应体系为PCR反应混合液体积为IOOy 1，其中，分别含有60pmol的上述各引物对，以及 30ng 模板 DNA，I X IO5 pmol 的 dNTPs，10 μ I 的 IOX PCR 缓冲液，5U Taq DNA聚合酶，其余用水补足；PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性40s，56°C复性30s，72°C延伸反应lmin，共40个循环，最后72°C延伸10 min ;分别得到
带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F和6174R ;
带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197F和6197R ；
带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6244F和6624R ；
带有Bln I位点序列的PCR扩增片段6275F和6275R ；
带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298F和6298R ；
带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308F和6308R ；
用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化上述六对扩增片段；
3)将步骤2)所得下列各扩增片段，按常规分别用下列对应的内切酶即内切酶I/内切酶II进行双酶切
带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F:Nde I/Sac I ；
带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174R:Sac I/BamH I ；
带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197F:Nde I/BspT104 I ；
带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197R:BspT104 I/BamH I ；
带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6244F:Nde I/Kpn I ；
带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6624R:Kpn I/BamH I ；
带有Bin I位点序列的PCR扩增片段6275F:Nde I/Bln I ；
带有Bin I位点序列的PCR扩增片段6275R:Bln I/BamH I;
带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298F:Nde I/Sac II;
带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298R:Sac I I/BamH I;
带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308F:Nde I/Xho I ；
带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308R:Xho I/BamH I ；
酶切反应体系为分别含有3μ I的上述各基因片段，以及3μ I的内切酶I (15U)，3μ I的内切酶II(15U)，和8μ I的IOX缓冲液及63 μ I的水；将各酶切混合液分别于37°C水浴反应3小时后，得对应的六个酶切片段，分别用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化六个酶切片段；
4)将步骤3)所得六个酶切片段对分别与T4DNA连接酶及缓冲液混合后，在18°C连接反应6h,最终在同一个VP6蛋白上构建出携带有Sac I (gagctc), BspT104 I (ttcgaa),Kpn I (RRtacc),Bln I (cctagg), Sac II (ccrcrr),Xho I (ctcRaR)六个酶切位点的 VP6载体蛋白编码基因；
5)、将步骤4)得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到ρΕΤ表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒pET6F ;
6)按常规将步骤5)所得重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定，之后将重组质粒PET6F在下列条件下分别转化BL21 (DE3)感受态细胞10 μ I重组质粒pET6F与100 μ I BL21 (DE3)感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42 °C放置70秒钟，力口Λ 500 μ I的LB培养液后，在37 °C培养30分钟；培养物涂在含200 μ g/ml氨苄青霉素的I.5%琼脂培养板上,将培养板于37°C培养14个小时,挑取单个菌落放入含200 μ g/ml氨节青霉素的LB培养液中培养和表达,得携带有Sac I (gagctc),BspT104 I (ttcgaa),Kpn I(ggtacc), Bln I (cctagg), Sac II (ccgcgg), Xho I (ctcgag) 6 个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F。所述步骤2)的轮状病毒TB-Chen株为公知的病毒株。所述步骤4)所得VP6F载体蛋白编码基因由1146个核苷酸组成，前端为编码蛋氨酸(M)的起始秘密子ATG，末端由2个终止密码子(TGA TAA)组成。
所述步骤6)所得重组轮状病毒VP6载体蛋白由380个氨基酸组成，分子量为43. 2Kd，其编码基因由1146个核苷酸组成。本发明提供的带有六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F，不影响VP6蛋白原有的分子结构，保留了 VP6蛋白原有所有抗原表位，并都位于蛋白分子的表面，可最大限度的展示外源抗原表位免疫学性质，以便将其他病毒的抗原表位插入本发明的重组轮状病毒VP6载体蛋白中，从而构建出轮状病毒RV与其他病毒联合重组的嵌合疫苗及试剂。

1)人工设计下列引物对
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
以及下列引物
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT ；
2)以轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增 PETL5/P174R 和 P174F/PVP6-3 ；
PETL5/P197R 和 P197F/PVP6-3 ；
PETL5/P244R 和 P244F/PVP6-3 ；
PETL5/P275R 和 P275F/PVP6-3 ；PETL5/P298R 和 P298F/PVP6-3 ；
PETL5/P308R 和 P308F/PVP6-3 ；
具体是
在PCR反应体系为PCR反应混合液体积为100 μ I，包含30ng模板DNA，I X IO5 pmol的dNTPs, IOX PCR缓冲液 10μ 1，5U Taq DNA聚合酶，60pmol 的引物对PETL5/P174R和P174F/PVP6-3，其余用水补足；PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性40s，56°C复性30s，72°C延伸反应lmin，共40个循环，最后72°C延伸10 min ;得到带有NdeI和Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F，和带有Sac I和BamH I位点序列的PCR扩增片段6174R ;用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该扩增片段；将PCR扩增片段6174F和6174R分别用Nde I/Sac I 和 Sac I/BamH I 双酶切，即
A、6174F酶切片段制备酶切反应体系为3μI的6174F片段，3 μ I的Nde I (15U)，3μ I的Sac I (15U),8y I的IOX缓冲液，63 μ I的水；将酶切混合液分别于37°C水浴反应3小时后，得酶切片段，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该酶切片段；
B、除使用SacI/BamH I双酶切外，6174R酶切片段制备与6174F酶切片段相同；
C、酶切片段的连接将6174F和6174R酶切片段与T4DNA连接酶及缓冲液混合后，在18°C连接反应6h，得到携带有Sac I位点(gagctc)的VP6编码基因
3)运用步骤2)的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P197R和P197F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/BspT104 I和BspT104 I/BamH I，在步骤2)获得的携带有Sac I位点的VP6编码基因上插入BspT104 I (ttcgaa)位点，得到檇带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因；
4 )用与步骤2 )相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P244R和P244F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Kpn I和Kpn I/BamH I，在步骤3)所得携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因上插入Kpn I (ggtacc)位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I (ggtacc)位点的VP6编码基因
5)用与步骤2)相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P275R和P275F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Bln I和Bin I/BamH I，在步骤4)所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I (RRtacc)位点的VP6编码基因上插入Bln I (cctaRR)位点，得至Ij携带有 Sac I 位点、BspT104 I 位点、Kpn I (RRtacc)位点及 Bln I (cctaRR)位点的 VP6编码基因；
6 )用与步骤2 )相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P298R和P298F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Sac II和Sac I I/BamH I，在步骤5)所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I (RRtacc)位点及Bln I (cctaRR)位点的VP6编码基因上插入Sac II (ccrcrr)位点，得到携带有 Sac I 位点、BspT104 I 位点、Kpn I (RRtacc)位点、SacII (ccrcrr)位点及Sac II (ccrcrr)位点的VP6编码基因:
7)、用与步骤2)相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P308R和P308F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Xho I和Xho I/BamH I，在步骤6)所得携带有Sac I位点、BspT104 I 位点、Kpn I (RRtacc)位点、Bln I (ccrcrr)位点及 Sac II (ccrcrr)位点的VP6编码基因上插入Xho I (ctcgag)位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、KpnI (RRtacc)位点、Bln I (ccrcrr)位点、Sac II (ccrcrr)位点及 Xho I (ctcRaR)位点的VP6载体蛋白编码基因，该VP6F载体蛋白编码基因由1146个核苷酸组成，前端为编码蛋氨酸(M)的起始秘密子ATG，末端由2个终止密码子(TGA TAA)组成，其核苷酸序列为
I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa 501 tagatcacaa cctgcgcatg agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg 701 atggtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat 851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcRcaRcact CRaRcatcat 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac 1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg 1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg 1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
8)、将步骤7)得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到ρΕΤ表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒pET6F ；
9)按常规将步骤8)所得重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定，之后将重组质粒PET6F在下列条件下分别转化BL21 (DE3)感受态细胞10 μ I重组质粒pET6F与100 μ I BL21 (DE3)感受态细胞混匀，并上放置30分钟，转42 °C放置70秒钟，加入500 μ I LB培养液后，在37°C培养30分钟；培养物涂含200 μ g/ml氨苄青霉素的I. 5%琼脂培养板，将培养板于37°C培养14个小时，挑取单个菌落放入含200 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，得重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F，该重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F由380个氨基酸组成，其氨基酸序列如下
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys o本发明所得重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F，经下列免疫学Western Blot检 测
1)将重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F，用作对照的重组轮状病毒NSP2蛋白，用作对照的牛血清白蛋白，各取2yg，分别溶于20μ I水，分别加入5μ I 5Χ变性缓冲液，混匀，在100°C 变性 5min ；
2)将I)的变性蛋白样品用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%SDS-PAGE)分离，并在电压15V、电流50mA的条件下，电泳转印25 min,转移到PVDF膜上，将膜置于含5%脱脂奶粉的PBS/T液中于4° C封闭过夜；
3)用PBS/T洗膜5次，分别加入抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体(1%脱脂奶粉1:400稀释)，抗重组轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体(1%脱脂奶粉1:400稀释)，抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体(1%脱脂奶粉1:400稀释)，于37°C孵育I. 5 h ;用PBS/T液洗膜5次，每次5 min ；
4)加入HRP标记的羊抗豚鼠IgG(1:2，000如上稀释)/ HRP标记的兔抗人IgG (1:800如上稀释)，37°C孵育I h;PBS/T漂洗5次，DAB显色；显色后，蒸馏水漂洗膜，终止显色，观察并分析结果如下
重组VP6载体蛋白rVP6F能与抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。重组VP6载体蛋白rVP6F能与抗重组轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。重组VP6载体蛋白不能与抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体发生免疫反应。用重组VP6载体蛋白rVP6F按常规免疫豚鼠得到的血清抗体，能与轮状病毒全病毒中的VP6蛋白发生特异性免疫反应。用重组VP6载体蛋白rVP6F免疫得到的豚鼠免疫血清抗体，能与重组轮状病毒VP6蛋白发生特异性免疫反应。抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体只与重组轮状病毒NSP2蛋白发生免疫反应。抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体，或抗重组轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体与用作阴性对照的重组轮状病毒NSP2蛋白和牛血清白蛋白均无免疫反应。结论本发明提供的重组VP6载体蛋白rVP6F具有特异的抗原反应性和免疫原性。
序列表
重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的核苷酸序列I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa 51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa 501 tagatcacaa cctgcgcatg_agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcRaacat acagcaattt 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg 701 atRRtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat 851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcRcaRcact CRaRcatcat 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac 1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg 1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg 1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa 重组轮状病毒VP6载体蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val lie Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys o
引物
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT。


本发明提供一种重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备，重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因上有下列六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点，不影响VP6蛋白原有的分子结构，保留了VP6蛋白原有所有抗原表位，并都位于蛋白分子的表面，可最大限度的展示外源抗原表位免疫学性质，以便将其他病毒的抗原表位插入本发明的重组轮状病毒VP6载体蛋白中，从而构建出轮状病毒RV与其他病毒联合重组的嵌合疫苗及试剂。