专利名称：一种禽用融合型口服干扰素的制备及其应用的制作方法目前，对我国禽类养殖业危害最大、也最难控制的一类疾病是传染性的病毒性疾病。针对于禽类该类疾病，一直没有有效的治疗方法和手段，其中疫苗接种是当前防止禽类病毒性疾病暴发和流行的主要措施和关键环节。但随着疫苗预防失败或接种不及时，一些病毒性疾病在禽类养殖中的时常爆发，传染性和死亡率极高，有些可达100%。一旦爆发病毒性疾病时，干扰素等生物制剂是目前市场上治疗的首选药物。但当前市场应用的干扰素以单价型为主，并多属于注射型，其使用起来操作繁琐、成本高、费工费时，效果不太理想。并且，当前禽类干扰素的生产主要以原核表达系统为主，也有利用真核细胞表达系统。原核表达系统存在不能进行蛋白质的转录和翻译后修饰功能，且表达产物多是不溶性的胞内包涵 体，产量低，需要复杂的加工纯化等过程；真核细胞表达系统存在着成本昂贵、条件要求苛亥IJ、蛋白质产物易受到污染、且纯化困难和难以规模化等缺点，均限制了二者系统的应用。因此，寻找新的生物反应器生产多价复合型的干扰素成为目前干扰素的主要研发方向。盐藻{J)unediella salina)是生活在咸水中的一种单细胞真核藻类,其自身具有许多其它反应器无法比拟的优点，如1)盐藻本身营养丰富，富含￠-胡萝卜素、维生素和蛋白质等成份，具有极高的营养价值和医用价值；2)盐藻属于光能自养型生物，可直接采用开放式大规模培养，培养成本廉价，生产费用低；3)盐藻本身无毒无害，是一种天然的保健品，可以提高机体免疫力和抵抗力；4)盐藻是一种天然的原生质体，对其进行遗传转化操作简单；5)盐藻培养安全可靠，不会对环境造成污染。6)盐藻属于真核生物，具有转录和翻译后对蛋白的加工能力，能产生近天然的高活性蛋白。
鉴于目前禽用干扰素的生产和应用现状，本发明提供一种禽用融合型口服干扰素的制备方法，所制备的融合型口服干扰素能够抗病毒治疗疾病，提高机体的免疫力、改善禽类机体肉质品质。该产品的研制成功对禽类病毒性疾病的预防和治疗都具有十分重要的现实意义，存在巨大的经济效益和商业价值。一种禽用融合型口服干扰素的制备及其应用，其具体步骤如下 步骤一、禽a、Y干扰素基因的制备对全球公共序列数据库GenBank已登录的鸡、鸭和鹅三种动物的a、Y干扰素基因分别进行序列比对，结合盐藻细胞基因组密码子的偏爱性，对三种动物二者基因的碱基序列进行改造修饰，人工合成了三种禽类通用的a干扰素序列(序列表序列I)、Y干扰素序列(序列表序列2)。依据基因序列，分别设计特异性引物，通过PCR的方法扩增禽a、y干扰素基因； 步骤二、转化盐藻细胞真核表达载体构建通过PCR扩增的禽a、y干扰素基因片段分别与PMD18-T克隆载体连接，通过各自的双酶切鉴定和测序鉴定后分别切下a、Y基因片段，通过T4连接酶先后将二者基因连接到真核表达载体pBI-上；将构建好的重组载体pBI-a + y用于对盐藻细胞的转化； 步骤三、重组表达载体转化盐藻细胞将构建好的重组质粒通过高效的玻璃珠转化法，或通过现有的基因枪法、电击法、脂质体介导法或超声波导入法转化盐藻细胞。转化后的盐藻细胞经选择培养基筛选培养，最终获得阳性转化株。挑取阳性藻落分别进行扩大培养，供后续分子生物学鉴定所用； 步骤四、对转化藻株的筛选与分子生物学鉴定提取转基因藻株的基因组总RNAjf-合到盐藻基因组中的目的基因进行RT-PCR扩增鉴定，以期查明目的基因整合与表达状态。同时，利用western blot技术对表达得蛋白产物进行生化活性分析； 步骤五、融合型口服干扰素的制备将鉴定正确的转基因藻株按1%的接种量接种于天然海水藻类养殖池，进行开放式的规模化养殖。培养约10-14天，当藻细胞浓度达到10 6个 /ml时，通过静止沉淀或离心收集藻体，即得到融合型口服干扰素，可根据不同的用途进行下一步步骤六或步骤七工艺；
步骤六、在预防或治疗禽类病毒性疾病中的应用为达到此用途，可采用以下技术方案低温条件下采用超声波粉碎，裂解的盐藻体按占鸡饮水体积的5%的比例加入，现配现用，控制在0. 5-2h内饮完；
步骤七、作为一种功能性饲料添加剂在禽类养殖业和饲料加工业中的应用为达到此用途，可采用以下技术方案将该转基因藻株直接或经过浓缩、低温干燥、制粒、粉碎或与其它营养成分混合等加工后，添加到禽类动物养殖饲料中。添加量为1_7%，添加形态可以为粉齐U、颗粒剂等固体形式、也可以是糊剂、丸剂等半固体形式，也可以是液体形式。有益效果
I、本发明所制备的干扰素为融合型的二价干扰素，是利用禽类保守性较强的干扰素a、Y基因序列为基础，a基因具有强的抗病毒作用，能够起到治疗病毒性疾病的目的；Y基因能够调节机体体质、增强机体免疫力的作用，将二者基因进行融合表达a+ Y，能够起到上述二者作用的协同效果，治疗作用更佳。2、本发明克服了当前干扰素生产系统存在的不足，利用了集多种优点为一身的盐藻细胞作为表达系统。将干扰素a + Y基因转化盐藻细胞制备得到转基因藻株。该转基因藻株不需要诱导、分离和提纯等复杂的加工过程，可直接作为活性干扰素制剂投喂家禽，操作过程简便，省时省力。同时，盐藻自身的优点也得以利用，能够起到“一株多用”的效果，即能够起到抗病毒、提高机体免疫力外,还能够加快机体的生长速度、改善肉质品质等优点，是一种营养丰富的绿色抗病毒制剂。3、本发明所制备的干扰素制剂能够采用天然开放式工厂化养殖，其不仅产量高、成本低廉，而且不易受外界微生物的污染，生物安全性好。4、本发明巧妙利用了盐藻、家禽、干扰素三者之间存在的密切联系干扰素具有较强的抗病毒作用，病毒能够感染家禽，家禽又能以盐藻作为饲料组分，而盐藻又是一个理想的绿色表达系统。为此，通过转基因手段制备的工程藻株无需提纯加工便可通过口服方式直接投喂，方便快捷，避免了注射等方式的不利影响。这种天然绿色的活性干扰素制剂直接通过口服给药方式进行，在国内外尚未见报道。5、本发明制备的干扰素制剂不仅能作为禽用抗病毒药物得以应用，而且又可作为一种多功能的饲料添加剂在禽类养殖业和饲料加工业中得以应用，且该添加剂具有无任何毒副残留、无抗药性、绿色环保等优点。


图I为禽a基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测电泳 图中左侧为分子量2000 Marker，右侧为PCR产物样品
图2为禽Y基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测电泳 图中M为分子量2000 Marker ；B为空白对照；P为两个重复的PCR产物样品；
图3为pBI-a重组质粒的取BernH双酶切琼脂糖凝胶检测电泳 图中左侧为pBI-a重组质粒双酶切后DNA片段，右侧为Marker ；
图4为pBI-a + Y重组质粒的及 "和fee双酶切琼脂糖凝胶检测电泳 图中左侧为pBI-a + Y重组质粒双酶切后DNA片段，右侧为Marker ；
图5为转化盐藻细胞的真核表达载体pBI-a +Y结构示意图 图6为转基因藻株的固体培养基筛选培养结果 图中左侧平皿为阴性对照组，即野生型盐藻细胞的生长情况，无单藻落出现；右侧平皿为转化藻株的生长情况，可见有多个单藻落的生长；
图7为对阳性转化株进行a基因的PCR扩增鉴定 图中M为分子量2000 Marker ;W为阴性对照，即野生型的盐藻株；T1、T2分别为两株阳性转化株；
图8为对表达产物进行Western blot分析结果 图中左侧为蛋白Marker，右侧为融合的干扰素蛋白条带。

PMD18-T克隆载体、pBI-真核表达载体购买于大连宝生物有限公司；大肠杆菌感受态购买于大连宝生物有限公司；限制性内切酶油a、BamH、Sac购自大连宝生物有限公司；T4 DNA连接酶购自大连宝生物有限公司；Trizol试剂购买于美国Invitrogen公司；PCR清洁试剂盒和胶回收试剂盒购自美国Axygene公司；特异性引物的合成由上海生工生物有限公司合成；
一种禽用融合型口服干扰素的制备及其应用，其具体步骤如下
步骤一、禽a、Y干扰素基因的扩增
I)禽a干扰素基因的制备
对全球公共序列数据库GenBank已登录的鸡、鸭和鹅的a干扰素基因(登录号分别为DQ226092、EF053034和AY524422)进行序列比对，结合盐藻表达系统基因组的密码子偏爱性，对三种动物的基因序列进行改造修饰，将出现频率较高的氨基酸分配到相应的位置，避免终止和非编码碱基组合的出现，人工合成了三种动物通用的启动子为ATG，终止子为TAA的a干扰素序列(序列表序列1)，依据此序列设计出一对引物，上游引物5，TCTAGAATGGCTGGGCCATCAGCCCC3，，下游引物5 ’ GGATCCCGTGTTGGTGCGGGT 3 ’，下划线所指为上下游引物分别引入的油a酶切位点。然后采用以下反应程序进行PCR扩增
94°C预变性 5min，30 个循环(94°C变性 40S，53°C退火 40S，72°C延伸 70S)，72°C延伸 IOmin后终止反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示出大小约600bp的基因片段(结果如图I所示)；
2)禽Y干扰素基因的制备
对全球公共序列数据库已GenBank登录的鸡、鸭和鹅的、干扰素基因(登录号分别为AY163160、AY166850和AY524421)进行序列比对，结合盐藻表达系统基因组的密码子 偏爱性，将出现频率较高的氨基酸分配到相应的位置，人工合成了三种动物通用的启动子为ATG，终止子为TAA的Y干扰素序列(序列表序列2)，依据此序列设计出一对引物，上游引物5 ’ GGATCCACTTGCACTACCCAGACTTAC3，，下游引物5 ’ GAGCTCTTACGTGTTGGTGCGGGTGA3’，下划线所指为上下游引物分别引入的和fee酶切位点。然后采用以下条件进行PCR 扩增:94°C预变 4 min，28 个循环(94°C变性 45 S，56°C退火 50S，72°C延伸 100S),72°C延伸IOmin后终止反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示出大小约500bp的基因片段(结果如图2所示)。步骤二、PCR产物的克隆及鉴定 I)干扰素a、y基因片段的克隆
在PCR产物连接pMD18-T克隆载体之前，先进行PCR产物的纯化回收。采用PCR清洁试剂盒进行分别回收a、Y基因片段，按照所附说明书进行操作。将回收得到a片段基因片段采用限制性内切酶油a和及_7进行双酶切，Y基因片段采用限制性内切酶及_7和Sac进行双酶切，然后分别与经过相同双酶切的PMD18-T克隆载体连接，连接体系如下2U I 10倍T4 DNA连接酶缓冲液，I u I pMD18-T载体，7 a或Y基因片段，I u I T4DNA连接酶，补充ddH20至总体积20 U I，然后连接反应体系于16°C水浴放置过夜。
2)重组pMD18-T- a (或Y )克隆载体的酶切及测序鉴定
采用CaCl2热激法将克隆载体pMD18-T_a (或Y )转化至大肠杆菌感受态，采用蓝白斑筛选，37°C过夜培养。然后挑取阳性克隆，扩大培养后采用碱裂解法小量提取质粒，对质粒分别进行双酶切鉴定(重组质粒PMD18-T- a采用限制性内切酶^BamH进行双酶切，重组质粒PMD18-T-Y使用限制性内切酶及丽7和5^进行双酶切)，检测能否切出预期的基因片段。然后选取酶切鉴定正确的阳性克隆寄送上海生工生物有限公司进行测序鉴定。步骤三、转化盐藻细胞pBI-a + Y真核表达载体的构建
将酶切和测序鉴定均正确的重组载体PMD18-T- a (或Y )分别进行双酶切(重组质粒PMD18-T- a采用限制性内切酶油a取BamH进行双酶切，重组质粒pMD18_T_ y限制性内切舊BamH和fee进行双酶切)，然后采用Axygene公司胶回收试剂盒回收干扰素a、y基因片段，按照其所附说明书进行操作；先将真核载体PBI-进行限制性内切酶取BamH双酶切，酶切体系为1. 5 ill Xba酶，I. 5 ill及_7酶，7111 pBI-载体，2yl buffer，补加水至总体积20 ii 1，于37°C水浴酶切过夜，然后通过胶回收试剂盒回收载体片段。将回收的a基因片段和载体片段PBI-连接。连接体系为2 ill 81-载体，10111 a基因片段，2 ill10倍T4 DNA连接酶缓冲液，T4 DNA连接酶I. 5 y 1，补加水至总体积20 U 1，然后于16°C水浴连接过夜；
次日采用CaCl2热激法分别将该连接体系转化入大肠杆菌感受态，采用蓝白斑筛选，挑取阳性菌落培养后进行质粒的提取。提取质粒采用限制性内切酶取BamH进行双酶切鉴定，酶切体系和条件同上，结果如图3所示，切出了约600bp的片段。鉴定正确的重组质粒进行及 "和双酶切，酶切体系为1. 5 ii I fee酶，I. 5 ill BamH酶，7 ii I pBI-a载体，2iil 10倍限制性内切酶buffer，补加水至总体积20iU，于37°C水浴酶切过夜，然后通过胶回收试剂盒回收载体片段。将回收的载体片段与Y基因片段连接，连接体系和条件同a基因片段的连接，然后对重组质粒进行限制性内切酶和fee双酶切鉴定(图4所示)，最终成功构建pBI-a + Y真核表达载体，该载体的结构如图5所示。步骤四、盐藻细胞的转化及转化株的筛选培养
采用玻璃珠转化法将重组质粒pBI-a+ Y转化藻细胞，主要操作步骤如下收集对数生长期的盐藻细胞800 W，细胞浓度为IO6个细胞/ml，然后加入150 W 20%聚乙二醇和90耵重组质粒(浓度为0.55吒/耵)，在300 mg玻璃珠存在的条件下，于转速2400 rpm涡旋12 S，完成转化过程。待玻璃珠完全沉降后，将转化体系用PKS培养基暗培养12h，然后正常光照培养3天(光暗比为12:12)。采用2000rpm离心5min收集盐藻细胞，将细胞涂布固体选择培养基进行筛选培养，直至可见单藻落的出现(如图6所示)。同时，转化过程中设有阴性对照组，即不加入重组质粒的转化操作组，该组的实验操作过程相同。步骤五、表达a + Y融合干扰素转化藻株的分子生物学鉴定
首先从筛选的固体培养板中挑取阳性单藻落，接种5ml PKS液体培养基试管培养7天。然后按10%的接种量接种三角烧瓶扩大培养，培养至细胞浓度达到IO5个/ml时，离心收集盐藻体。利用Trizol试剂，按照其所附说明书进行操作，提取转化后盐藻的总RNA，采用RT-PCR的方法进行a基因的扩增，以查明目的基因的整合与表达情况。将PCR产物通过1%琼脂糖凝胶进行鉴定，能够得到特异性较强、大小符合预期的基因片段(如图7所示)。结果说明目的基因整合到了盐藻的基因组中，并且得到了有效的转录表达。同时，利用Westernblot对融合的目的蛋白进行生物活性分析。结果显示，在分子量为40KD处显示出特异的条带，说明表达的a + Y融合干扰素保持其天然的生物学功能(如图8所示)。步骤六、转基因藻株作为抗病毒药物在禽类病毒性疾病预防和治疗中的应用
I)以裂解的转基因盐藻体通过饮水方式作用于鸡体，进行抗病毒的预防保护实验
分别对转基因盐藻和未转化的野生盐藻细胞进行离心收集，低温条件下采用超声波粉碎，参数为400W，破碎IOS间隔3S，共破碎20次。裂解的盐藻体按占鸡饮水体积的5%的比例加入，现配现用，最好控制在0. 5-2h内饮完。在正常饲喂条件下给予全天多次饮水，连续应用3天。选择15日龄健康的SPF鸡，随机分成三组，每组20只，每组设三组重复。A组空白对照组，在鸡养殖过程中，给予正常的一般饮用水，没有加入盐藻细胞组阴性对照组，在鸡的养殖过程中，给予含5%野生型盐藻体的饮用水；(组，治疗比较组，在鸡的养殖过程中，给予含5%转基因盐藻体的饮用水。所用组别在连续3天多次饮水的基础上，第4天开始，三组动物统一投喂含传染性法氏囊病料，饮水方式如上述进行，连续饮用7天，每天记录每组鸡发病情况。实验结果(如表I所示)空白对照组和阴性对照组鸡的发病率达到100%，二者的累计死亡率分别是56. 5%和53. 5%，而治疗组鸡没有发病和死亡，表明转基因盐藻株通过饮水方式作用鸡体，对其进行预防病毒性疾病的有效保护率达到100%。治疗组保护率的计算方法保护率=(I-治疗组死亡数/治疗组动物总数)*100% 空白对照组死亡率的计算方法死亡率=(空白对照组死亡数/空白对照组动物总数)
*100%
阴性对照组鸡死亡率的计算方法死亡率=(阴性对照组死亡数/阴性对照组动物总数)*100%


一种禽用融合型口服干扰素的制备及其应用，利用禽类干扰素α、γ基因保守序列为基础，将具有较强抗病毒作用的干扰素α基因和能够提高机体免疫力、增强机体体质的干扰素γ基因融合表达，表达的α+γ融合干扰素兼有二者协同功能。同时，利用盐藻生物反应器作为表达系统，该系统除能表外源基因外，盐藻自身的营养丰富、无毒无害等优点也得以利用，制备得到“一株多用”的基因藻株，应用该转基因藻株制备出的禽用融合型口服干扰素，可应用于禽类病毒性疾病的预防或治疗、禽类养殖业和相关饲料加工业等领域，效果好且绿色环保、成本低廉。