专利名称：一种通过组织培养获得大量小佛肚竹再生植株的方法小佛肚竹属簕竹属，又名葫芦竹、佛竹、密节竹，是以特形杆作为观赏性状的重要观赏竹之一。小佛肚竹一般具2种杆形正常杆形的小佛肚竹杆下部略呈之字形曲折；畸形杆形的小佛肚竹节间短缩且肿胀呈花瓶状。后一杆形常用于制作盆景及庭院栽培作观赏用，其竹高25-60cm，直径O. 5-2cm，节间较短，一般只有2-5cm，或短缩肿胀呈花瓶状，为著名的观赏竹种，具有广阔的市场前景(陈双林，杨希.观赏竹种佛肚竹栽培及形态控制 [J].福建林业科技，2001，28(1) :79 80)。然而，竹类植物开花间隔期长，开花期无法预测，且种子获取十分困难，萌发率也低。因此，竹子繁殖主要以埋鞭、埋杆、埋节等传统方法为主，这些方法具有消耗种竹多、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等缺点，小佛肚竹也是如此。而且，小佛肚竹畸形杆的变异不稳定，利用生物技术可以高效、快速地对作物品种性状进行遗传改良，从而为小佛肚竹再生植株的培养提供一种方便、快捷和有效的方法。竹子组织培养方面的研究，最早见于1968年，Alexander和Rao关于竹子合子胚离体培养的简报。国外比较系统开展竹子组织培养工作始于20世纪80年代。我国的竹子组织培养工作开展得较晚，20世纪90年代才开始，闕国宁等以黄竹和印度箣竹2种丛生竹的嫩节作为外植体诱导愈伤组织，最终形成完整植株。现阶段，国内通过以芽繁芽途径来实现竹子植株的再生，其技术已趋于成熟，但通过愈伤组织途径来实现植株的再生，报道并不多。本发明针对背景技术的不足和缺陷，克服小佛肚竹组织培养过程中再生难的问题，通过不同生长调节剂的组合，设计出适合小佛肚竹再生的培养基，完成小佛肚竹植株再生的时间最快仅为15周左右。为小佛肚竹的快速繁殖和定向生物技术育种奠定了坚实的基础。具有一定的社会效益和经济效益，可以促进我国竹产业的发展。
本发明的目的在于提供一种快速、大量获得小佛肚竹再生植株的方法。本发明提出的获得小佛肚竹再生植株的方法，采用愈伤组织培养技术，包括小佛肚胚性愈伤组织的诱导、分化及植株再生等。具体步骤为(O小佛肚竹胚性愈伤组织的诱导将无菌的再生芽的芽尖接种到愈伤诱导培养基进行愈伤诱导，愈伤组织形成四周后将其转接到继代培养基进行增殖培养，得到胚性愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基为以 MS为基本培养基，再附加6mg/L2，4-D,O. 001mg/LTDZ、0. 5mg/L萘乙酸(NAA)组成，所述继代培养基为MS, 5mg/L2, 4-D, O. 5mg/L6-BA, lmg/L 蔡乙酸，lOOmg/L Vc。( 2)胚性愈伤组织的分化将胚性愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上培养，至有再生芽分化形成，一般约一个月左右时间；其中，所述愈伤组织分化培养基为MS，3mg/L6-BA，0. 5mg/LNAA。(3)小佛肚竹的植株再生将已经分化出再生芽的愈伤组织转接到生根培养基中，进行生根培养，其中，所述生根培养基含 MS，3mg/l NAA, (O. 1-0. 5) mg/1 6-BA。待根生长至5cm时，可进行再生苗的移栽。再生苗移栽花盆中后置于植物生长室中(湿度在60%-80%，温度(25±1°0，光周期为光照14h/黑暗10h)。上述培养基组分中，MS为MS培养基成分(Murashige & Skoog medium, 1962, Physiol. Plant 15:473-497 )，2，4-D 为 2，4-二氯苯氧乙酸，TDZ 为噻二唑苯基脲，6-BA 为6-苄氨基腺嘌呤，Vc为维生素C。本发明方法获得小佛肚竹的频率高，适宜于小佛肚竹遗传改良。
图I小佛肚竹的枝芽外植体。
图2小佛肚竹枝芽诱导出的愈伤组织。
图3小佛肚竹愈伤组织在增殖培养基上生长一段时间后的愈伤组织。
图4小佛肚竹愈伤组织在分化培养基上分化一个月后长出芽体。
图5小佛肚竹愈伤组织在分化培养基上分化三个月后长出的芽丛。
图6小佛肚竹再生苗的生根。
图7移栽成功的小佛肚竹再生植株。

(1)外植体的选择本发明的实验中选取材料为小佛肚竹vantricosa)的无菌苗的再生芽。(图I)
(2)胚性愈伤组织的诱导与保持选取无菌苗上刚萌发的再生芽，切取离芽尖约I.5cm 的茎段(图 2)。接到愈伤诱导培养基(MS+TDZ0. 00lmg/L+ 2，4_D6mg/L+ NAAO. 5mg/L)，四周后愈伤组织形成，将形成的愈伤组织转接到愈伤增殖培养基(MS+5mg/L2，4-D+O. 5mg/ L6-BA+lmg/L萘乙酸+100mg/LVc)进行增殖培养。(图3)
(3)胚性愈伤组织的分化胚性愈伤组织培养30天后，将愈伤组织转接到分化培养基 (MS+3mg/L6-BA+0. 5mg/LNAA)上，使愈伤组织分化成芽。(图4、图5)
(4)再生芽的生根与移栽将分化后的芽转接至生根培养基中(MS+3mg/l NAA+(0. 1-0. 5)mg/1 6_BA)，2周后，就有不定根产生，待根生长至5cm时，可进行再生苗的移栽。再生苗移栽花盆中后置于植物生长室中(湿度在60%-80%，温度(25±1°0，光周期为光照14h/黑暗IOh)(图6、图7)。本实验中所有培养基都在灭菌前将pH调到5. 8，灭菌条件为121°C下18min。培养室温度为(25±1°C)。光周期为14h/黑暗10h。培养物表面的光照强度约为30001x。


本发明属于生物技术领域，具体为一种通过组织培养获得大量小佛肚竹再生植株的方法。该方法包括采用小佛肚竹幼嫩枝芽芽尖为外植体，经消毒处理后在经改良的诱导培养基上形成愈伤组织，进而诱导胚性愈伤组织的发生，然后，将胚性愈伤组织接种到改良的分化培养基上，诱导胚性愈伤组织分化出芽，再在生根培养基上分化出根，形成完整植株，最后移栽到花盆，完成小佛肚竹再生全程。本发明方法获得小佛肚竹的频率高，适宜于小佛肚竹遗传改良。