专利名称：代谢综合征的预防剂和/或治疗剂的制作方法由肥胖引起的高血糖、高血压、脂质异常等症状的增加是世界各国共通的社会问题。将除了由内藏脂肪组织的肥大化引起并导致体重增加的内脏脂肪型肥胖以外，还兼具高血糖、高血压、脂质异常中的两种以上的状态称为“代谢综合征(内脏脂肪综合征)”，美国国家胆固醇教育计划(NCEP)已经公布了该病状的诊断基准。将高血糖作为指标进行判定的糖尿病大致分为I型和II型。I型的病状主要为由于遗传的因素而完全丧失了本应正常保持血糖值的激素胰岛素的分泌，其占日本人糖尿病患者的5 10%。II型的病状主要为后天丧失了胰岛素的感受性(成为胰岛素抵抗性)， 在日本人中也发现了伴随胰岛素分泌降低的病例。占糖尿病患者的90 95%、由代谢综合征诱发的糖尿病属于2型糖尿病。已知患糖尿病的原因之一为过量饮食等生活习惯对肾脏等脏器造成负担，根据最近的研究可知，作为肥胖原因的脂肪细胞的肥大化会引起脂肪组织内的基因水平的变化， 通过血中的细胞因子或其他信号因子的浓度变化而对包含肝脏和骨骼肌在内的全身造成影响，促使糖尿病的发病。在糖尿病治疗中，吡格列酮作为非常有效的降血糖剂得到利用， 但存在副作用的问题(日本特开2003-119148、以下称为专利文献1)。另外，脂肪细胞的肥大化与脂质异常有关。作为脂质异常的指标，一直以来使用了血中的总胆固醇(以下，称为“T-CH0”)值或中性脂肪(血中甘油三酯，以下称为“TG”)的值，目前，代替T-CHO而将血中LDL胆固醇值作为指标之一。并且已知若患LDL胆固醇血症、 高甘油三酯血症，则罹患动脉硬化等心血管疾病的风险会变高。在这种脂质异常的治疗中使用了司他汀(statin)、贝特类(fibrates)药物。另一方面，有报道指出在柑橘类中含有对上述那样的糖尿病、脂质异常有效的物质。此处，柑橘类的分类详细记载于田中的分类法(Tanaka，Τ.，Misunderstanding with regards Citrus classification and nomenclature. Bull. Univ. Osaka Pref. Ser. B,21, 139-145 (1969)，以下称为非专利文献1)中。需要说明的是，针对柑橘类中所含的聚甲氧基黄酮的种类和量已有研究，并报道称在与基于田中的分类法的分类之间发现了关联(非专利文献2)。WO 1999/056768A2(以下称为专利文献2~)中，已知一种将在脂肪组织或脂肪细胞中表达的基因的表达量变化作为指标而对物质的作用进行评价的方法。报道了例如GDF-8 抑制剂促进培养脂肪细胞内的GLUT4的表达、以及该物质对于糖尿病的处置有用的内容。另外，关于聚甲氧基黄酮(以下称为PMF)的效果，报道了下述例子。据 W02007/024982A2(以下称为专利文献；3)中报道，与接受高脂饮食的小鼠相比，在接受添加有由甜橙(Citrus sinensis)提取的包含PMF的成分的高脂饮食的小鼠中，体重的增加量和平均脂肪重量降低。据日本特开2001-240539(以下称为专利文献4)中报道，若对自然患糖尿病的小鼠经口给予作为PMF之一的蜜桔黄素或扁平橘(Citrus depressa)浓缩果汁，则与未给予这些物质的小鼠相比，具有显著的抑制血糖上升的效果。
据WO 2002/087567A2(以下称为专利文献5)中报道，对仓鼠仅提供果糖时、以及提供添加有食用橘皮素或柑橘类PMF组合物的果糖时，血中总胆固醇浓度降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 日本特开2003-119148
专利文献2 国际公开公报WO 1999/056768A2
专利文献3 国际公开公报WO 2007/024982A2
专利文献4 日本特开2001-240539
专利文献5 国际公开公报WO 2002/087567A2
非专利文献
非专利文献 1 Tanaka, Τ. , Misunderstanding with regards Citrus classification and nomenclature. Bull. Univ. Osaka Pref. Ser. B,21,139-145(1969)
2 :Nogata, Y. ， Sakamoto, K. ， Shiratsuchi, H. , Ishii, Τ. , Yano Μ.， and Ohta, H. , Flavonoid Composition of Fruit Tissues of Citrus Species, Biosci. Biotechnol. Biochem.，70，178—192 (2006)发明内容
如上所述，代谢综合征是由内脏脂肪型肥胖所诱发的，因此为了提高治疗效果，必须改善肥胖度、即缩小脂肪组织。但是，目前尚未发现有效的抗肥胖药，而且尚未得到认可， 因此将饮食疗法和运动疗法合用。
上述吡格列酮存在促进脂肪细胞的成长的矛盾点，若长期服用则存在体重和体脂肪增加、降血糖作用减弱的问题。另外，司他汀类、贝特类的药物存在横纹肌溶解和由肝脏分泌的脂肪酸增多的问题。
代谢综合征的治疗中饮食的限制和适度的运动是重要的。其目的在于切断下述不好的流动摄入到肌肉中但未被消耗的血中的糖分被储存在脂肪组织中，肥大化的脂肪细胞会分泌引起循环系统的并发症的中性脂肪。即，为了提高治疗效果，抑制糖分的供给源的过量摄取、将所摄取的糖分消耗尽是必要的。此处，抑制糖分的供给源(即摄食量)必须小心进行，以免引起低血糖或骨质疏松症等。另外，若所摄取的糖分在肌肉中的血糖摄入和代谢得到促进，则会促进血糖的消耗，因而摄入到肥大化的脂肪组织中的血糖减少，脂肪细胞的肥大化得到抑制，中性脂肪等的分泌也得到抑制。
此外，如上所述，代谢综合征合并了多种病状，因此在针对各病状进行给药的对症疗法中存在极限。因此，社会强烈要求对下述物质进行筛选(A)改善肥胖和高血糖、且不妨碍脂质异常的改善的物质；或(B)改善肥胖和脂质异常、且不妨碍高血糖的改善的物质。
另外，为了进行上述代谢综合征的预防和/或治疗，最希望发现可同时改善内脏CN 102549153 A脂肪型肥胖、高血糖、脂质异常这三种病状；且无高血压和其他副作用或者副作用小的物质，将该物质作为药物糖提供。但是，即使无法同时改善上述三种病状，若能在改善内脏脂肪型肥胖的病状的同时改善高血糖或脂质异常的任一种病状，则只要另一种病状不恶化则也没有问题。
此外，若这种物质的安全性高，则不仅可以以药物制剂的形式提供，还可以以功能性食品或健康食品的形式提供，可以期待预防代谢综合征患者的发生的效果。
因此，社会高度要求提供这种物质。
本发明是鉴于上述情况而完成的。即，本发明的发明人立足于与内脏脂肪型肥胖、 高血糖、脂质异常相关的复杂机理，并且注意了安全性和副作用，开发了对代谢综合征的治疗有效的成分的筛选方法。结果发现通过对骨骼肌组织或骨骼肌细胞中的糖转运蛋白基因的mRNA表达量进行测定，能够筛选出对代谢综合征的治疗有效的组合物，通过进行该筛选，发现由针对糖转运蛋白基因的效果而赋予了特征的柑橘类提取物的成分具有以往未知的显著作用，由此完成了本发明。
本发明的第1方式为代谢综合征的治疗用物质的筛选方法，所述代谢综合征表现为内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常，该筛选方法包括下述的工序(1) (3)。(1)提取工序，由以规定的量按规定的期间给予被测物质的构成被测物质给药组的非人哺乳动物、 和未以所述规定的量按所述规定的期间给予所述被测物质的构成被测物质非给药组的非人哺乳动物分别采集骨骼肌，由骨骼肌提取总RNA级分；(2)定量工序，利用规定的方法，对所述提取工序中提取的各总RNA级分中所含的、编码糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行定量；和C3)判定工序，对于分别构成所述被测物质给药组和被测物质非给药组的所述非人哺乳动物在所述规定期间中的体重增加量、摄食量和编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量，在组间进行比较分析，从而判定针对所述代谢综合征的效果。上述工序( 中定量的所述糖转运蛋白基因优选为小鼠GLUT4及其同源物。
上述筛选方法中，更优选所述规定的方法包括以下工序使用逆转录酶由编码所述糖转运蛋白基因的RNA合成cDNA的工序；使用所述转运蛋白基因特异性引物，以所述 cDNA为模板进行扩增的工序；使用选自由荧光标记核酸、同位素标记核酸和核酸染色剂组成的组中的试剂，利用与所述试剂对应的检测法对扩增产物进行定量的工序；和对编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行确定的工序。
另外，代替利用规定的方法对编码糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行定量的工序，还可以为利用规定的方法对所述基因所编码的糖转运蛋白的蛋白质表达量进行定量的工序。该情况下，在所述比较分析中，代替所述RNA的表达量而优选在组间对所述蛋白质的表达量进行比较分析。
用于对所述蛋白质的表达量进行定量的规定的方法优选包括以下工序利用选自由蛋白质印迹法、ELISA和免疫染色法组成的组中的任一种方法测定糖转运蛋白的蛋白质表达量的工序；以及确定该表达量的工序。另外，还可以合用依据所述RNA的表达量的方法和依据所述蛋白质的表达量的方法，均可以用于所述比较分析中。另外，所述被测物质中含有化合物和组合物。
本发明的第2方式为用于实施上述筛选方法的试剂盒。上述试剂盒优选包含逆转录酶、以cDNA为模板对DNA进行扩增的酶和糖转运蛋白基因特异性引物。上述试剂盒优选还具备核酸染色剂。
本发明的第3方式为一种代谢综合征的治疗用组合物，所述代谢综合征是糖尿病发病前的表现为内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常的代谢综合征，其中，所述组合物含有在干燥重量中含70 100重量％的蜜桔黄素的蜜柑区(Acrumen(VII)seCtion)柑橘类的果皮提取级分，以所述果皮提取级分的干燥重量换算，以每天5 200mg/kg的用量经口给药，所述组合物具有下述作用或特征(1) G)。(1)抑制体重增加量的上升而不影响摄食量的作用；( 促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的小鼠GLUT4及作为其同源物的糖转运蛋白基因的蛋白质表达的作用；(3)促进肥大化内脏周边白色脂肪组织缩小的作用；(4)降低血中葡萄糖浓度而不影响血中甘油三酯浓度的作用。
上述组合物中，所述蜜柑区(Acrumen(VII)seCti0n)柑橘类优选为扁平橘 Citrus cbpressa，所述蜜桔黄素优选在干燥重量中为95 100重量％，所述用量优选为每天10 100mg/kg，另外，作为所述作用或特征，优选还具有(5)促进内脏周边白色脂肪组织的脂肪细胞缩小的作用；(6)改善糖耐量的作用。
本发明的第4方式为一种代谢综合征的预防和/或治疗用组合物，所述代谢综合征表现为内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常，其中，所述组合物含有在干燥重量中含 45 55重量％的蜜桔黄素和45 55重量％的橘皮素的蜜柑区(Acrumen (VII) section)柑橘类果皮提取级分，以所述果皮提取级分的干燥重量换算，每人每天经口摄取0. 5 8. Og, 所述组合物具有下述作用或特征(1) G)。(1)抑制体重增加量的增加而不影响摄食量的作用；( 促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的小鼠GLUT4及作为其同源物的糖转运蛋白基因的mRNA或蛋白质表达的作用；(3)促进肥大化内脏周边白色脂肪组织缩小的作用； (4)降低血中甘油三酯浓度而不影响血中葡萄糖浓度的作用。
上述组合物中，所述蜜柑区(Acrumen(VII)seCti0n)柑橘类优选为扁平橘 Citrus cbpressa，所述用量优选为1. 0 6. Og/人/天，另外，作为所述作用或特征，优选还具有( 促进内脏周边白色脂肪组织的脂肪细胞缩小的作用；(6)改善瘦素抵抗性的作用。
另外，本发明的第5方式为一种含有上述代谢综合征的治疗用组合物的功能性食品。本发明的第6方式为一种含有上述代谢综合征的治疗用组合物的健康食品。另外，本发明的第7方式为一种含有上述代谢综合征的治疗用组合物的药物制剂。
根据本发明的筛选方法，能够选择出具有以下作用或特征的物质、或者含有所述物质的组合物(1)抑制体重增加量的增加而不影响摄食量的作用；( 促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的以小鼠GLUT4为首的糖转运蛋白基因表达的作用。
利用本发明的所述含有蜜桔黄素的组合物，能够提供一种代谢综合征的预防和/ 或治疗用药物制剂、功能性食品或健康食品，其特征在于，其具有抗肥胖效果，具有高血糖治疗等效果，且不妨碍脂质异常的改善。利用本发明的所述含有蜜桔黄素和橘皮素的组合物，能够提供一种代谢综合征的预防和/或治疗用药物制剂、功能性食品或健康食品，其特征在于，其具有抗肥胖效果，具有脂质异常治疗等效果，且不妨碍高血糖的改善。
通过利用规定的方法给予本发明的药物制剂，能够预防和/或治疗代谢综合征。 另外，通过摄取本发明的功能性食品和健康食品，能够促进代谢综合征的预防和/或治疗。


图IA是表示扁平橘果皮提取物的HPLC分析的结果的曲线图。曲线图的纵轴以检测电压(mV)表示UV检测器的电位变化。
图IB是表示温州蜜柑果皮提取物的HPLC分析的结果的曲线图。曲线图的纵轴以检测电压(mV)表示UV检测器的电位变化。
图2A是表示实施例3中提供低脂饮食(LFD)、高脂饮食(HFD)、添加扁平橘提取物的高脂饮食(HFD+1SPE)和添加高浓度扁平橘提取物的高脂饮食(HFD+1. 5SPE)后小鼠的体重增加量的曲线图。
图2B是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1. 5SPE后小鼠的摄食量的重量的曲线图。
图2C是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE, HFD+1. 5SPE后小鼠的肝脏、肾脏和白色脂肪组织的重量的曲线图。
图3A是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1. 5SPE后小鼠的中性脂肪 (甘油三酯)、总胆固醇、葡萄糖的血中浓度的曲线图。
图;3B是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1. 5SPE后小鼠的瘦素的血中浓度的曲线图。
图3C是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1. 5SPE后小鼠的白色脂肪组织的脂质生物合成相关基因群的相对表达量(设LFD = 1时)的曲线图。
图4A是观察实施例3中提供LFD后小鼠的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图4B是观察实施例3中提供HFD后小鼠的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图4C是观察实施例3中提供HFD+1SPE后小鼠的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图4D是观察实施例3中提供HFD+1. 5SPE后小鼠的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图5A是表示对糖尿病模型小鼠提供仅溶剂(Vehicle)、蜜桔黄素(No200)和吡格列酮(P30)时葡萄糖的血中浓度的曲线图。
图5B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时针对糖耐量的经口葡萄糖耐量试验(OGTT)的结果的曲线图。
图6A是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时白色脂肪组织中的糖转运蛋白GLUT4基因的mRNA表达量的曲线图。
图6B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时上述GLUT4的蛋白质表达量的电泳图像照片及表示其表达量的曲线图。
图6C是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时骨骼肌中的糖转运蛋白GLUT4的蛋白质表达量的电泳图像照片及表示表达量的曲线图。
图7A是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时肝脏组织中的糖异生相关基因PEPCK的mRNA表达量的曲线图。
图7B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时肝脏组织中的糖异生相关基因G6I^ase的mRNA表达量的曲线图。
图8A是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂联素的血中浓度的曲线图。
图8B是表示对糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30时脂联素基因的mRNA 表达量的曲线图。
图9A是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂肪细胞因子基因 TNF-α的mRNA表达量的曲线图。
图9B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂肪细胞因子基因 MCP-I的mRNA表达量的曲线图。
图9C是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂肪细胞因子基因 IL-6的mRNA表达量的曲线图。
图IOA是表示对糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30时脂肪细胞特异性转录因子基因PPAR γ的mRNA表达量的曲线图。
图IOB是表示对糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30时脂质生物合成相关基因aP2的mRNA表达量的曲线图。
图IOC是表示对糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30时脂质蓄积控制相关基因LPL的mRNA表达量的曲线图。
图IOD是表示对糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30时脂质蓄积控制相关基因Perilipin的mRNA表达量的曲线图。
图1IA是表示实施例6中进行低脂饮食喂食+溶剂给药的LFD摄取组(LFD，无肥胖诱导的比较例)、以及利用高脂饮食(HFD)进行肥胖诱导后进行高脂饮食喂食+溶剂给药的HFD摄取组(HFD)和进行高脂饮食喂食+橘皮素给药的T200给药组(HFD+T200)的白色脂肪组织中的脂肪细胞特异性转录因子PPAR Y基因和糖转运蛋白GLUT4基因的mRNA表达量的电泳图像照片及表示表达量的曲线图。
图IlB是表示实施例6中上述肥胖诱导后的LFD、HFD、HFD+T200的骨骼肌中的糖转运蛋白GLUT4基因的mRNA表达量的电泳图像照片和表示表达量的曲线图。
图12A是表示实施例6和7中利用高脂饮食(HFD)进行肥胖诱导和给予蜜桔黄素或橘皮素的时间表。
图12B是表示实施例7中进行低脂饮食喂食+溶剂给药的LFD摄取组(LFD，无肥胖诱导的比较例)、以及利用高脂饮食(HFD)进行肥胖诱导后进行高脂饮食喂食+溶剂给药的HFD摄取组(HFD)、进行高脂饮食喂食+蜜桔黄素给药的IONo给药组(HFD+lONo)和进行高脂饮食+高浓度蜜桔黄素给药的IONo给药组(HFD+lOONo)的5周的体重总增加量的曲线图。
图12C是表示实施例7中LFD、HFD、HFD+1 ONo、HFD+IOONo的5周的平均摄食量的曲线图。
图13A是表示实施例7中LFD、HFD、HFD+IONo, HFD+IOONo的肝脏、肾脏和白色脂肪组织的重量的曲线图。
图1 是表示实施例7中LFD、HFD、HFD+IONo, HFD+IOONo的中性脂肪(甘油三酯)、总胆固醇、葡萄糖的各血中浓度的曲线图。
图14A是实施例7中通过经口葡萄糖耐量试验(OGTT)表示LFD、HFD、HFD+IONo, HFD+IOONo的糖耐量的曲线图。
图14B是表示实施例7中LFD、HFD、HFD+IONo, HFD+IOONo的前期OGTT的血中葡萄糖浓度曲线的时间积分值的曲线图。
图15A是观察实施例7中LFD的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图15B是观察实施例7中HFD的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图15C是观察实施例7中HFD+lONo的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图15D是观察实施例7中HFD+lOONo的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。

以下，对本发明进行更详细的说明。
本说明书中，只要没有特别声明，则代谢综合征是指表现出内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常状态的代谢综合征。另外，本申请发明中，抗肥胖效果包括使肥大化的内藏脂肪组织缩小的效果。
作为被测物质，可以使用任意的物质。被测物质优选混合到食物中、或是溶解或悬浮于适当的溶剂中，然后经口给药到被测对象动物中。另外，被测物质为脂溶性物质时，也可以经皮给药到被测对象动物中。
本发明的筛选方法中作为被测对象的非人哺乳动物优选为啮齿目(Rodentia)，更优选为实验用小鼠(小家鼠；Mus musculus ；以下称为小鼠)。优选小鼠构成以规定的量按规定的期间给予被检物质的被检物质给药组、和未以所述规定的量按所述规定的期间给予所述被检物质的被检物质非给药组这两组，或者除此之外构成改变给药量、食物条件等规定条件的多个组。
本发明的筛选方法中，作为肥胖的指标，优选测定体重。进而优选通过解剖取出内藏白色脂肪组织，测定其重量，并测定内脏脂肪型肥胖的程度。进而优选对脂肪组织进行显微镜观察，测定脂肪细胞的肥大化的程度。另外，作为不伴有解剖的方法，还可以利用测定被测对象动物的电阻值的方法、或测定比重的方法来测定体脂肪率。作为本发明的摄食量的测定方法，在笼内使小鼠摄食并测定所提供的食物的减少量的方法因简便而优选。
作为本发明的用于所述筛选的糖转运蛋白相关基因，优选GLUT4、GLUTU GLUT2、 AMH(等。若代谢综合征的治疗用物质在骨骼肌控制这些基因的表达，则通过控制血糖在骨骼肌组织中的摄入效率，能够改善胰岛素抵抗性、糖耐受不良或高血糖。此外，通过减少葡萄糖在脂肪细胞中的摄入量，可抑制脂肪细胞和脂肪组织的肥大化，另外，对于已经肥大化的脂肪细胞和脂肪组织可以促进缩小。通过使由这样缩小后的脂肪细胞和脂肪组织的脂质分泌正常化，能够改善脂质异常。进而若代谢综合征的治疗用物质可促进骨骼肌内的 GLUT4、AMH(等糖转运蛋白相关基因的表达，则对于需要运动疗法的代谢综合征患者而言， 可以期待其辅助效果。另外，在高血糖中，这些基因的表达的促进具有通过胰岛素抵抗性改善而防止向更严重的糖尿病转移的效果。这些筛选用基因中，从所述物质具有改善高血糖以及脂质异常症状的作用的可能性高的方面考虑，特别优选骨骼肌的GLUT4。
本发明的基因表达的测定可以通过测定mRNA或蛋白质的表达量来进行。这些测定可以利用公知的方法进行。mRNA的测定优选包括以下工序。
(1)由骨骼肌组织片、或骨骼肌细胞提取含有mRNA的级分的工序；
(2)使用逆转录酶，由编码所述糖转运蛋白基因的RNA合成cDNA的工序；
(3)使用所述转运蛋白基因特异性引物，对所述cDNA进行扩增的工序；
(4)使用规定的试剂，利用与该试剂对应的检测法对扩增产物进行定量的工序； 和
(5)对编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行确定的工序。
所述规定的试剂优选为选自由荧光标记核酸、同位素标记核酸和核酸染色剂组成的组中的任一种试剂，从筛选效率的观点出发，进一步优选为核酸染色剂。作为所述核酸染色剂，从检测效率的观点出发，优选为STOR(注册商标)Green。作为所述检测法，从测定值的准确性的观点出发，优选为实时PCR法。作为确定所述表达量的方法，优选将甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)作为标准使用的比较Ct法。
另外，蛋白质的表达量的测定优选包括以下工序由骨骼肌组织片或骨骼肌细胞提取全部蛋白质级分的工序；利用蛋白质印迹法法、ELISA法、其他公知的方法测定所述蛋白质级分中的糖转运蛋白的蛋白质表达量的工序；确定该表达量的工序。另外，蛋白质的表达量也可以利用骨骼肌组织或骨骼肌细胞的免疫染色来测定。
本发明的被测物质针对代谢综合征的效果的判定优选根据以下条件进行。
S卩，优选为以下条件在所述规定的条件下，与所述被测物质非给药组相比，(条件ι)抑制所述被测物质给药组的体重的增加、或体重增加量的上升；(条件i)不伴有摄食量的明显增加、减少；(条件幻促进所述糖转运蛋白基因的mRNA或蛋白质的表达。利用所述(条件1)选择具有肥胖抑制效果的物质，利用(条件2)排除伴有作为副作用指标的摄食量的抑制的物质、和与肥胖的亢进相关的增加摄食量的物质。另外，利用(条件3)选择促进如上所述可期待对高血糖或脂质异常有改善效果的、骨骼肌中的糖转运蛋白基因的表达的物质。
关于本发明的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物的提取，从提取效率的观点出发，优选从蜜柑区柑橘类的果皮提取。在蜜柑区柑橘类中，从组合物的含量的方面考虑， 进一步优选花良治(Keraji ；Citrus Keraji ；以下相同)、栊柑(Ponkan ；C. reticulata)、 丹西橘(Dancy tangerine ；C. tangerine)、天台蜜橘(Jimikan ；C. succosa)、四会柑 (Shikaikan ；C. suhuiensis)、立花橘(Tachibana ；C. tachibana)、小红蜜柑(Kobenimikan ； C. erythrosa)、纪州蜜柑(Kishumikan ；C. kinokuni)、扁平橘(Shiikuwasha ；C. depressa)、 柑子(Koji ；C. Ieiocarpa)等。
从由果实得到果皮时的作业效率和所述组合物的提取效率的方面考虑，进一步优选由扁平橘(Shiikuwasha ;C.cbpreSSa)的果皮提取。所述果皮可以通过阳光或机械干燥机进行干燥，但通过阳光干燥可以降低干燥所消耗的能量、防止成分变性，因而优选。
作为本发明的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物，可以优选使用由所述蜜柑区柑橘类的干燥果皮进行甲醇提取等而得到的提取物。所述提取物以规定的比例含有下述式(I)表示的蜜桔黄素和/或式(II)表示的橘皮素。另外，所述蜜桔黄素和橘皮素的骨架部分是共通的，通常将其甲氧基的数量和部位不同的化合物组称为聚甲氧基黄酮(PMF)，本说明书中也使用该名称。


本发明的目的在于提供表现出内脏脂肪型肥胖和脂质代谢异常的代谢综合征的治疗用物质的筛选方法、所述综合征的预防和/或治疗用组合物。所述筛选方法包括下述工序(1)提取工序，由以规定的量按规定的期间给予被测物质的构成被测物质给药组的非人哺乳动物、和未给予所述被测物质的构成被测物质非给药组的非人哺乳动物分别采集骨骼肌，由骨骼肌提取总RNA级分；(2)定量工序，利用规定的方法，对所述提取工序中提取的各总RNA级分中所含的、编码糖转运蛋白基因的mRNA的表达量进行定量；和(3)判定工序，对于分别构成所述被测物质给药组和被测物质非给药组的所述非人哺乳动物在所述规定期间中的摄食量、体重增加量和编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量，在组间进行比较分析，从而判定针对所述代谢综合征的效果。