专利名称：胃促胰酶的适配体及其用途的制作方法人胃促胰酶(EC. 3. 4. 21. 39)，是一种胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶，其贮存在肥大细胞分泌颗粒中。当外界刺激时，肥大细胞经历脱粒，导致人胃促胰酶连同多种炎症介质一起释放到细胞外。释放的人胃促胰酶特异地识别包含在底物蛋白和肽中的芳香族氨基酸，诸如苯丙氨酸和酪氨酸，并且切割靠近所述氨基酸的肽键。人胃促胰酶的代表性底物是血管紧张肽I (AngI)。人胃促胰酶切割AngI从而产生血管紧张肽II (AngII)，血管紧张肽 II是一种血管收缩因子。按系统发生哺乳动物胃促胰酶分类为两个亚家族α和β。灵长类，包括人，只表达一种属于α家族的胃促胰酶。同时，啮齿类表达α和β两个家族的胃促胰酶。在小鼠中，有很多种胃促胰酶，其中属于β家族的小鼠肥大细胞蛋白酶4(mMCP_4)，从其底物特异性和组织中的表达模式判断，被认为是与人胃促胰酶最密切相关的。在仓鼠中，同样属于β 家族的仓鼠胃促胰酶-1对应于人胃促胰酶。同时，和人胃促胰酶同属α家族的mMCP-5和仓鼠胃促胰酶_2，具有弹性蛋白酶类活性并且在底物特异性方面与人胃促胰酶不同。胃促胰酶与转化生长因子β (TGF-β)的激活极为相关。TGF-β以潜伏态(潜伏-TGF-β)存在于上皮细胞和内皮细胞周围的细胞外基质中，并且通过大潜伏TGF-β结合蛋白(LTBP)保留在细胞外基质中。当需要并且被激活时TGF-β从细胞外基质释放，并且激活的TGF-β是对活体极为重要的细胞因子，据报道其参与细胞增殖和分化以及组织损伤后的组织修复和再生。它的信号的衰弱导致多种疾病的发生和发展。据信在此过程中， 胃促胰酶涉及潜伏TGF-β从细胞外基质的释放以及潜伏TGF-β到活性TGF-β的转化。已知胃促胰酶与众多疾病相关，所述疾病包括纤维化、心血管疾病、炎症、过敏性疾病和器官粘附(organ adhesion)。纤维化是这样的疾病，其特征为在肺、心、肝、肾、皮肤等中细胞外底物的异常代谢，导致结缔组织蛋白的过度沉积。在肺纤维化中，例如，结缔组织蛋白诸如胶原蛋白过度沉积在肺中，导致肺泡难以收缩以及随后的呼吸窘迫。已经证明肺纤维化起因于由暴露于大量尘埃引起的肺尘埃沉着病、由使用药物诸如抗癌药剂引起的药物诱导的肺炎、过敏性肺炎、肺结核、自身免疫疾病诸如诸如胶原蛋白病等。然而，有一些其中病因未知的情况。分子水平上的纤维化发生机制还未被阐明。通常，在正常状态下，成纤维细胞的增殖和功能得到很好的控制。然而，在严重或持续炎症或损伤的情况中，组织修复机制过度运行，导致成纤维细胞的异常增殖以及结缔组织蛋白的超量生产。已知TGF-β是引起这些现象的因子。如表明其参与的证据，已经有报道向纤维化的动物模型给药抗TGF-β中和抗体导致胶原蛋白表达的减少和纤维化的显著抑制。在具有先天肺纤维化的患者中，观察到 TGF-β水平的增加和胃促胰酶阳性肥大细胞计数的提高。同时，胃促胰酶与纤维化的联系已经由使用动物模型的实验证明。在博来霉素诱导的肺纤维化的仓鼠模型中，胃促胰酶抑制剂显著减小了促进的胃促胰酶活性、增加的胶原蛋白III mRNA的表达、组织纤维化和其他现象。在博来霉素诱导的肺纤维化的小鼠模型中已经观察到同样作用；胃促胰酶抑制剂的给药抑制胃促胰酶活性并且减少羟基脯氨酸的含量。可以使用具有这些特征的胃促胰酶抑制剂作为胃促胰酶相关疾病诸如纤维化的预防或治疗药物。已经开发出的胃促胰酶抑制剂包括小分子化合物诸如TPC-806、 SUN-13834、SUN-C8257、SUN-C8077 和 JNJ-10311795 (专利文献 1)。近年来，应用于治疗药物、诊断试剂和检测试剂的RNA适配体已经引起人们的注意；一些RNA适配体已经处于临床研究阶段或实际使用中。在2004年十二月，世界上第一个 RNA适配体药物，Macugen，在美国被批准作为年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration)的治疗药物。RNA适配体是指特异地结合目标分子诸如蛋白的RNA，并且能够使用SELEX (指数富集的配体系统进化)方法来制备它(专利文献2-4)。在SELEX方法中，特异结合目标分子的RNA选自具有大约IOw个不同核苷酸序列的RNA库。所用的RNA 具有大约40个核苷酸的随机序列，引物序列在所述随机序列的侧翼。允许此RNA库与目标分子混合，并且只有与目标分子结合的RNA被使用过滤器等分离。通过RT-PCR扩增分离的 RNA，并且使用此作为下一轮的模板。通过重复此操作大约10次，可以获得特异结合目标分子的RNA适配体。与抗体药物相似，适配体药物能够以细胞外蛋白为目标。根据众多科学文章和公共领域中的其他参考材料，判断适配体药物在一些方面超过抗体药物。例如，适配体与抗体相比通常展示较高的对目标分子的亲和性和特异性。适配体不太可能遭受免疫清除，而作为抗体特性的逆反应，诸如依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)，据报道不太可能在使用适配体时发生。从药物递送的角度，由于它们的分子尺寸大约是抗体的十分之一，所以适配体可能迁移到组织，这使得更容易将药物递送到目标位点。因为适配体通过化学合成制备，它们允许位点选择性化学修饰，并且能够通过大量生产来降低成本。适配体的其他优势包括长期贮存稳定性、耐热性和耐溶剂性。同时，适配体的血液半衰期通常短于抗体的血液半衰期；然而，考虑到毒性此性质有时是有优势的。由这些事实得出这样的结论，即即使当以同样分子为目标时，适配体药物可能胜过抗体药物。现有文献专利文献专利文献1 :USB6500835专利文献2 =WO9Izl98I3专利文献3 :W094/08050专利文献4 :W095/07364发明概述本发明要解决的问题本发明关注于提供胃促胰酶的适配体和用于使用同样适配体的方法等。解决问题的方法本发明人不懈地研究从而解决了上述问题并且成功地制备了用于胃促胰酶的优质适配体，其导致本发明的完成。因此，本发明提供以下各项5[1]与胃促胰酶结合从而抑制胃促胰酶活性的适配体。[2]根据[ι]的适配体，所述适配体包含由^C1GauagaN1N2UAAX2(SEQ ID NO 21 ；每个和X2，不管是否相同，是A或G，而每个N1和N2,不管是否相同，是A、G、C、U或T)代表的核苷酸序列。[3]根据[2]的适配体，其中 N1N2 是 GA、GU、GC、UU、GT 或 CU0[4]根据[2]的适配体，其中&和)(2全部是A或全部是G。[5]根据[3]或W]的适配体，其中至少一个嘧啶核苷酸已经被修饰或改变。[6]根据[1]的适配体，所述适配体包含以下的核苷酸序列(a)、(b)和(C)中的任一项(a)适配体，所述适配体包含选自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和69_72 (其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列；(b)适配体，所述适配体包含选自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和69-72 (其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列，其中1至5个核苷酸被取代、缺失、插入或添加；和(c)核苷酸序列，所述核苷酸序列与选自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和 69-72(其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或更多的同一性。[7]根据W]的适配体，其中至少一个包含在适配体中的核苷酸已经被修饰或改变。[8]根据[1]的适配体，所述适配体包含以下核苷酸序列(a’)、(b’ )和(C’ )中的任一项(a，)选自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61(1)、69(1)、69(2)、和72 (1)-72 (8)(其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列；(b，)选自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61(1)、69(1)、69(2)和72 (1)-72 (8)(其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列， 其中1至5个核苷酸被取代、缺失、插入或添加；和(C，)与选自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61 (1)、69 (1)、69 (2)和72 (1) -72 (8)(其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或更多的同一性的核苷酸序列。[9]根据[1]的适配体，其中位于包含在所述适配体中的相应嘧啶核苷酸的2’位置的每个羟基，不管是否相同，可以由选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。[10]根据[1]的适配体，其中位于包含在所述适配体中的相应嘌呤核苷酸的2’位置的每个羟基，不管是否相同，可以由选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。。[11]包含适配体[1]至[10]中任一项和功能物质的复合物。[12]根据[11]的复合物，其中所述功能物质是亲和性物质、用于标记的物质、酶、 药物递送载体或药物。[13]包含所述适配体[1]至[10]或所述复合物[11]或[12]中任一项的药物。[14]根据[13]的药物，所述药物被用于预防或治疗心血管疾病或纤维化。[15]包含所述适配体[1]至[10]或所述复合物[11]或[12]中任一项的诊断试剂。[16]包含所述适配体[1]至[10]或所述复合物[11]或[12]中任一项的胃促胰酶检测探针。[17]包含所述适配体[1]至[10]或所述复合物[11]或[12]中任一项的胃促胰酶纯化的固相载体。[18]检测胃促胰酶的方法，所述方法包括使用所述适配体[1]至[10]或所述复合物[11]或[12]中的任一项。[19]纯化胃促胰酶的方法，所述方法包括使用所述适配体[1]至[10]或所述复合物[11]或[12]中的任一项。本发明的作用本发明适配体或复合物可以用作药物或试剂诸如用于由胃促胰酶引起的多种疾病诸如纤维化和心血管疾病的诊断试剂。本发明适配体或复合物也能够用于纯化和浓缩胃促胰酶，以及检测和定量胃促胰酶。图1显示由MFOLD程序预测的由SEQ ID NO :4、5、12-14、18显示的适配体的二级结构，其中圈中围住的部分显示由SEQ ID NO :21显示的共同序列。图2显示由MFOLD程序预测的由SEQ ID NO 22-27显示的适配体的二级结构，其中圈中围住的部分显示由SEQ ID NO :21显示的共同序列。图3显示由MFOLD程序预测的由SEQ ID NO 28-34显示的适配体的二级结构，其中圈中围住的部分显示由SEQ ID NO :21显示的共同序列。图4显示由SEQ ID NO 12和13显示的适配体如何结合到胃促胰酶，其中40N表示包含40个核苷酸的随机序列的RNA库。固定作为捕获分子的每个适配体或阴性对照40N ； 注射作为分析物的人胃促胰酶。使用Biacore TlOO (由GE Healthcare制造)进行所述测量。图5显示由MFOLD程序预测的由SEQ ID NO :38_40、43、48显示的适配体的二级结构，其中圈中围住的部分显示由SEQ ID NO :21显示的共同序列。图6显示由MFOLD程序预测的由SEQ ID NO :49、51、55_57显示的适配体的二级结构，其中圈中围住的部分显示由SEQ ID NO :21显示的共同序列。图7显示由SEQ ID NO 13、55和56显示的适配体如何结合到胃促胰酶，其中40N 表示包含40个核苷酸的随机序列的RNA库。将胃促胰酶固定到芯片表面上；注射作为分析物的每个适配体或阴性对照40N。使用Biacore TlOO (由GE Healthcare制造)进行所述测量。图8显示通过蛋白质印迹法检测的胃促胰酶如何降解LTBP-I以及列于表9中的适配体如何抑制LTBP-I降解的结果。道数1、8、9、23和31显示标记；道数6、21和四显示阴性对照(无抑制剂)的结果；道数7、22和30显示不含胃促胰酶的对照的结果。实施本发明的最佳方式本发明提供具有对胃促胰酶的结合活性的适配体。本发明适配体能够抑制胃促胰酶的活性。适配体是指对特殊的目标分子具有结合亲和性的核酸分子。所述适配体也能够通过结合到特殊的目标分子来抑制所述特殊的目标分子的活性。本发明适配体具有对胃促胰酶的结合活性，并且能够抑制胃促胰酶的活性。本发明适配体可以是RNA、DNA、修饰的核酸或其混合物。本发明适配体还可以是直线型的或环型的。胃促胰酶，是公知的丝氨酸蛋白酶，其贮存于肥大细胞分泌颗粒中。胃促胰酶深入地涉及由肥大细胞介导的多种生物反应，包括，例如，生物活性肽的制备和降解、细胞外基质重建、细胞因子网络和免疫。本发明适配体能够展示对来源于任何哺乳动物的胃促胰酶的抑制活性。这种哺乳动物包括灵长类(例如人、猴)、啮齿类(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)和同伴动物、家养动物和工作动物(例如狗、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)，优选的是人。 人胃促胰酶的氨基酸序列由登录号AAB26^8显示，并且可以是具有一至多个突变残基、其结构域部分或其肽部分的序列。人胃促胰酶的结构不仅可以是单体，还可以是二体或多聚体。本发明适配体在生理缓冲溶液中与胃促胰酶结合。尽管对缓冲溶液的选择没有限制，但是优选的是具有大约5. 0-10. OpH的缓冲溶液。这种缓冲溶液包括，例如，下述溶液A 和溶液C(见实施例1和幻。本发明适配体以由下述任何检测可检测的强度与胃促胰酶结I=I O使用Biacore TlOO (由GE Healthcare制造)来测量结合强度。在测量方法中，首先将所述适配体固定到传感器芯片上，固定的量大约是1000RU。注射用作分析物的20 μ L 被制备成0. 2 μ M的胃促胰酶溶液，并且检测胃促胰酶与所述适配体的结合。使用包含具有 30或40个核苷酸的随机核苷酸序列的RNA作为阴性对照。如果与对照RNA相比胃促胰酶相等地或显著更有力地与所述适配体结合，则判断所述适配体具有结合胃促胰酶的能力。在另一个方法中，首先将胃促胰酶固定到传感器芯片上，固定的量大约是4000RU。 注射用作分析物的20 μ L被制备成0. 01 μ g/ μ L的适配体溶液，并且检测所述适配体与胃促胰酶的结合。使用包含具有30或40个核苷酸的随机核苷酸序列的RNA作为阴性对照。 如果与对照RNA相比胃促胰酶相等地或显著更有力地与所述适配体结合，则判断所述适配体具有结合胃促胰酶的能力。对胃促胰酶的抑制活性是指对胃促胰酶具有的任何活性的抑制潜能。例如，抑制胃促胰酶功能之一的水解和切割肽链的酶活性。酶活性的可用底物不限于出现于活体中的蛋白和生物活性肽(例如AngI、潜伏TGF-β等)，还包括包含前述肽的部分氨基酸序列的肽、与发色物质或荧光物质结合的肽。发色物质和荧光物质对本领域技术人员是已知的。经由蛋白或生物活性肽降解反应发生的现象包括胶原蛋白I/III表达的增加、羟基脯氨酸含量的增加、IgE表达的增加等；其上的抑制作用也包括在对胃促胰酶的抑制活性中。此外， 对嗜中性白细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞迁移到胃促胰酶的抑制活性也包括在对胃促胰酶的抑制活性中。此外，对胃促胰酶诱导的组胺释放促进、肥大细胞计数提高、增加的血管渗透性、组织纤维化、炎症、血管发生、血管内膜增厚等的抑制作用也包括在对胃促胰酶的抑制活性中。胃促胰酶的底物是指遭受胃促胰酶水解切割的肽、蛋白等。存在于活体中的已知胃促胰酶的底物包括肽和蛋白诸如AngI、潜伏TGF-β、干细胞因子(SCF)、前胶原、胶原酶原、纤连蛋白、基质金属蛋白酶-1前体(pro-MMP-1)、pro-MMP-9、基质金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)、载脂蛋白A-I(apoA-I)、apoE、磷脂转运蛋白、IL-Ιβ前体、大-内皮素-1 (大-ET-1)、大-ET-2、结缔组织激活肽III、IL-18前体、物质P、血管活性肠肽(VIP)、 胰激肽、缓激肽和C3a。本文中，胃促胰酶的底物不限于它们，还包括人工设计的包含由胃促胰酶特异识别的氨基酸残基的模型肽，诸如Phe和Tyr，以及与发色物质或荧光物质结合的这些肽。通过例如下述三种测试方法可以确定适配体是否抑制胃促胰酶的酶活性。第一种方法采用合成底物。有用的胃促胰酶底物是 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA (4-甲基香豆基-7-酰胺基)(由 P印tide Institute, Inc.制造)，其包含胰凝乳蛋白酶类蛋白酶的标准底物4个氨基酸的肽“Ala-Ala-Pro-Phe”。使用 96 孔板(F16 Black Maxisorp Fluoronunc,由 Nunc 制造)在缓冲溶液(溶液C;见下面的实施例2)中进行测定，其中反应混合物的体积为100 μ L。首先，在溶液C中制备各核酸以获得50 μ L溶液。在添加10 μ L在溶液C中制备的ImM底物后，将所述板放置至Ij酶标仪(microplate reader) SpectraMaxl90 (由 Molecular Devices Corporation (分子设备公司)制造)，并在37°C孵育5分钟。分别地，将0.05 μ g胃促胰酶(重组体，由SIGMA 制造)在溶液C中稀释，并且使40 μ L此稀释液在37°C孵育5分钟。将所述胃促胰酶溶液添加到核酸和底物的混合物中从而启动酶反应。将含有所述反应混合物的板放置于酶标仪 SpectraMaxl90(由 Molecular Devices Corporation 制造)，并且在 37°C检查依赖于时间的荧光强度在5分钟内的变化(激发波长380nm，检测波长460nm)。产生由胃促胰酶活性从所述底物释放的AMC (7-氨基-4-甲基香豆素)的荧光增加的线性近似，并且将其斜率作为初始反应速度。至于对照，在以下两种情况中样品以同样的方式处理和分析使用包含具有30或40个核苷酸的随机序列的核酸库(阴性对照)，并且使用已知的胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶抑制剂一抑凝乳蛋白酶素(阳性对照)。将在没有核酸和抑制剂存在情况下的初始反应速度作为100%酶活性，计算每种测试物质的抑制率，并且确定引起50%酶活性抑制所需的抑制剂浓度(IC5tl)。展示比已知抑制剂抑凝乳蛋白酶素更低的IC5tl值的适配体被判断为具有优秀的抑制活性。第二种评估方法采用天然底物。有用的胃促胰酶的天然底物是血管紧张肽I。此处，荧光衍生化由血管紧张肽I降解释放的肽片段HiS-Leu,并定量来自其的荧光强度。在所述测定中，在50 μ L溶液C中进行酶反应。首先，在溶液C中稀释0.3-0. 75ng 胃促胰酶(重组体，由SIGMA制造；或天然的，由Calbiochem制造)从而获得5 μ L胃促胰酶溶液。在溶液C中制备各核酸以获得25 μ L溶液。将5yL各胃促胰酶稀释液与25yL 各核酸溶液混合，然后将所述混合物在37°C孵育5分钟。分别地，在溶液C中制备20 μ L、 125 μ M的血管紧张肽I (由P印tide Institute, Inc.制备)并且在37°C孵育5分钟。将所述血管紧张肽I溶液添加到胃促胰酶和核酸的所述混合物中，并且启动所述酶反应。在使所述反应在37°C进行90分钟后，添加25 μ L用冰预冷的30%三氯乙酸溶液以终止所述反应。使全部的混合物在4°C、14000rpm离心10分钟，并且使用30 μ L所得的上清液用于随后的荧光衍生化反应。在将30 μ L所述上清液添加到96孔板(Black，由Costar制造)后，在每个孔中混合15 μ L甲醇中的2%的O-苯二醛(由SIGMA制造)溶液和170 μ L 0. 3Μ的NaOH溶液， 并且使所述板在室温中静止10分钟。随后，添加25yL 3M HCl溶液以终止所述反应。将所述板放置到酶标仪SpectraMaxl90(由Molecular Devices Corporation制造)，并且在 355nm的激发波长和460nm的荧光波长确定荧光强度。至于对照，在两种情况中以同样的方式处理和分析样品使用SEQ ID NO :58 (阴性对照)并且使用已知的胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶抑制剂一抑凝乳蛋白酶素(阳性对照)。在两种情况中，在0分钟反应时间获得的荧光强度充当空白测定。将在其中添加等体积溶液C代替各核酸的胃促胰酶酶反应中检测到的荧光强度设为100%，计算各测试物质的抑制率，并且确定引起50%酶活性抑制所需的抑制剂浓度(IC5tl)。展示比已知抑制剂抑凝乳蛋白酶素更低的IC5tl值的适配体被判断为具有优秀的抑制活性。第三种评估方法采用包含在细胞培养物上清液中的天然底物。此处，通过蛋白质印迹法来检测胃促胰酶底物LTBP-I的降解。处于冰冻下的NHLF细胞(由Cambrex Bio Science制造)在37°C水浴中快速解冻，然后使其悬浮于培养基中(10% FBS/F-12)。在以 1200rpm离心5分钟后，移去所得的上清液，将所述细胞重悬于培养基中。将总体积为IOmL 的培养基添加到经离心的细胞，并且将所述细胞悬浮液转移到细胞培养皿并且在存在5% CO2的条件下在37°C培养。在显微镜下观察所述细胞的形态学和增殖状态。当所述细胞变得汇合时，用无血清培养基(0. 2% BSA/F-12)代替所述培养基。在代替所述培养基的两天后，所述培养物上清液被收集、分装并在-30°C的冷冻下贮存。在将在使用前刚解冻的40 μ L NHLF培养物上清液分装到管中后，向其添加用溶液 C稀释的5 μ L核酸溶液。至于阳性对照，用溶液C稀释抑凝乳蛋白酶素，并且以同样的方式添加此稀释液。至于阴性对照，只添加溶液C。接下来，添加5 μ L在溶液E (溶液C+0. 1 % BSA、0. 05%叠氮化钠)中的lOOng/mL胃促胰酶稀释液。至于对照，准备不含胃促胰酶的管。 在搅拌后，将所述样品在37°C孵育1小时，并将其与等体积的电泳裂解缓冲液混合以终止所述反应。通过如下所述的蛋白质印迹法的方法来检测样品中的LTBP-1。把混合于裂解缓冲液中的样品煮3分钟，使10μ L的所述样品在5-20%的丙烯酰胺凝胶上经历电泳。在电泳完成后，将所述样品转移到硝化纤维素滤膜，此后用5%脱脂奶、 50mM Tris-HCl (pH 8. 0)和0. 05%叠氮化钠封闭所述滤膜。所述滤膜与在2% BSA、PBS和 0. 05%叠氮化钠中的2 μ g/mL抗LTBP-I单克隆抗体的稀释液在室温过夜反应。将所述滤膜漂洗3次并且使其在室温下与二抗溶液(用0. 1 %的BSA/PBS稀释10000倍的HR标记的抗鼠IgG抗体)孵育2小时。将所述滤膜漂洗5次，并且使用化学发光底物进行检测。如根据LTBP-I条带密度和位置(分子量)确定的，来自不含胃促胰酶的孔的条带充当阳性对照(+)，而来自阴性对照孔的条带充当阴性对照(_)。通过目测检查各测试物质的抑制活性。对本发明适配体没有限制，只要它能够结合到胃促胰酶的任何部分从而抑制其活性。本发明适配体的长度是不受限的，并且通常可以是大约10至大约200个核苷酸， 并且可以是，例如，不超过大约100个核苷酸，优选地不超过大约50个核苷酸，更优选地不超过大约40个核苷酸，最优选地不超过大约30个核苷酸。当核苷酸的总数较小时，化学合成和大量制备将更容易，并且在成本方面具有主要优势。同样据认为化学修饰是容易的，在体内的稳定性是高的，并且毒性是低的。包含在本发明适配体中的各核酸，不管是相同的还是不同的，可以是包含核糖
10(例如嘧啶核苷酸的核糖、嘌呤核苷酸的核糖)2’位置的羟基的核苷酸(即，未被取代的核苷酸)，或是核糖2’位置由任何原子或基团取代的核苷酸。作为这种任何原子或基团的实例，可以提及由氢原子、氟原子或-0-烷基(例如-O-Me基)、-0-酰基(例如-O-COMe基) 或氨基(例如-NH2基)取代的核苷酸。本发明适配体具有由^GAUAGAN^UAAi^SEQ ID NO :21 ；其中&和)(2中的每一个， 不管是否相同，是A或G，而N1和队中的每一个，不管是否相同，是A、G、C、U或T ；其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)代表的序列。具有此序列的适配体强有力地与胃促胰酶结合从而抑制胃促胰酶活性。在上式中，&和)(2优选地都是A或都是G ；N1R优选地是GA、GU、GC、UU、GT或CU (其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)。本发明适配体也可以是这样的核苷酸，其中至少一种(例如1、2、3或4种)核苷酸在核糖的2’位置包含羟基或上述任何原子或基团，例如，至少两种(例如2、3或4种) 选自由氢原子、氟原子、羟基和甲氧基组成的组的基团。在本发明适配体中，所有的嘧啶核苷酸可以是在核糖的2’位置由氟原子取代的核苷酸，或是在核糖的2’位置由以上提及的任何原子或基团取代的核苷酸，优选地是在核糖的2’位置由选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组的相同或不相同的原子或基团取代的核苷酸。在本发明适配体中，所有的嘌呤核苷酸可以是在核糖的2’位置包含羟基的核苷酸，或在核糖的2’位置由以上提及的任何原子或基团取代的核苷酸，优选地是在核糖的2’ 位置由选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组的相同或不相同的原子或基团取代的核苷酸。本发明适配体也可以是这样的个体，其中所有核苷酸在核糖的2’位置同样地包含羟基，或以上提及的任何原子或基团，例如，选自由氢原子、氟原子、羟基和甲氧基组成的组的相同基团。本文中，在此说明书中，在对如何修饰核苷酸中的所述糖基的描述中构成所述适配体的核苷酸被假定为RNA ( S卩，所述糖基被假定为核糖)。然而，这不意味着从构成适配体的核苷酸中免除DNA，并且如适当的应当把对RNA的修饰看作是对DNA的修饰。当构成适配体的核苷酸是DNA时，例如，在核糖2’位置的羟基由X取代应当看作是在脱氧核糖2’位置的一个氢原子由X取代。本发明适配体也可以是(a)包含选自SEQ ID NO :4-34、38-57、59_65和69-72 (其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的适配体；(b)包含选自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和69_72 (其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的适配体，其中1至5个核苷酸被取代、缺失、插入或添加的核苷酸序列；或(c)包含与选自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和69_72 (其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或以上(优选地80%或以上，更优选地90%或以上， 最优选地95%或以上)同一性的核苷酸序列的适配体。本发明适配体还包括(d)选自由以下各项组成的组的偶联物多个以上的适配体(a)的偶联物、多个以上的适配体(b)的偶联物、多个以上的适配体(c)的偶联物、以及多个以上的适配体(a)、(b)和(c)的偶联物。能够与胃促胰酶结合和/或抑制胃促胰酶活性(胃促胰酶酶活性等)的不仅有以上的适配体(a)，而且还有适配体(b)至(d)。本发明的适配体也可以(a，)包含选自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61⑴、69⑴、69⑵和72⑴-72⑶(其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的适配体；(b，)包含选自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61(1)、69(1)、69(2)和72 (1)-72 (8)(其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的适配体，其中 1至5个核苷酸被取代、缺失、插入或添加的核苷酸序列；或(c，)包含与选自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、 56 (15) -56 (52) ,61(1),69 (1)、69 (2)和72 (1) -72 (8)(其中规定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或以上同一性的核苷酸序列的适配体。本发明适配体还包括(d’ )选自由以下各项组成的组的偶联物多个以上的适配体(a’ )的偶联物、多个以上的适配体(b’ )的偶联物、多个以上的适配体(C’ )的偶联物、以及多个以上的适配体(a’)、(b’ )和(c’ )的偶联物。此外，本发明适配体还包括(e)由以下各项组成的偶联物一个或多个选自由以上的(a)、(b)和(C)组成的组的适配体，和一个或多个选自由(a’)、(b’ )和(c’ )组成的组的适配体。以上的适配体(a’)-(d’ )和(e)也能够与胃促胰酶结合和/或抑制胃促胰酶活性(胃促胰酶酶活性等)。在以上的(b)和(b’ )中，对被取代、缺失、插入或添加的核苷酸的数量没有限制， 只要所述适配体能够与胃促胰酶结合和/或抑制胃促胰酶活性(胃促胰酶酶活性等)。核苷酸的数量可以是，例如，不超过大约30，优选地不超过大约20，更优选地不超过大约10， 还更优选地不超过5，最优选地4、3、2或1。至于以上的(C)和(C’)，“同一性”是指在其中使用本技术领域中已知的数学算法(优选地，所述算法考虑在一个或两个所述序列上引入空位(gap)以获得最佳比对)来比对两个核苷酸序列的最优比对中相同核苷酸残基与所有重叠核苷酸残基的比率(％ )。在本说明书中可以通过以下方式来计算核苷酸序列的同一性，例如，在以下条件下(gap open(空位开启)=5penalties (罚分)；gapextension (空位延长)= 2penalties (罚分)；x_dropoff (降低)=50 ；expectancy (其月望)=10 !filtering (过滤)=ON (开启))使用同源计算算法 NCBIBLAST-2 (National Center for Biotechnology ^formation(美国国立生物技术信息中心)Basic Local Alignment Search Tool (基本局部比对搜索工具))来比对所述两个核苷酸序列。在以上的(d)、(d’ )和(e)中，可以通过随机结合来获得偶联。在所述偶联中，可以使用连接体。核苷酸链(例如1至大约20个核苷酸)和非核苷酸链(例如-(CH2)n-连接体、-(CH2CH2O)n-连接体、六乙二醇连接体、TEG连接体、包含肽的连接体、包含-S-S-键的连接体、包含-CONH-键的连接体、包含-OPO3-键的连接体)可以作为连接体被提及。如在上述多个偶联物中提及的多个不受具体的限制，只要它是两个或更多，并且所述多个可以是，例如，2、3或4。在以上的(a)至(d)，(a’)至(d’)和(e)中的各核苷酸，不管是相同的还是不同的，可以是在核糖的2’位置包含羟基的核苷酸或在核糖(例如嘧啶核苷酸的核糖)的2’位置由任何基团(例如氢原子、氟原子或-O-Me基)取代的核苷酸。本发明的适配体可以是这样的个体，其中各核苷酸的糖残基(例如核糖)已被修饰从而增加了结合胃促胰酶的活性、稳定性、药物可递送性等。用另一个原子代替在糖残基的2’ -位置、3’ -位置和/或4’ -位置的氧原子的一个实例等可以作为糖残基中被修饰位点的实例被提及。氟化、0-烷基化(例如0-甲基化、0-乙基化)、0-芳基化、S-烷基化 (例如S-甲基化、S-乙基化)、S-芳基化和氨基化(例如-NH2)可以作为修饰的实例被提及。这种糖残基的改变可以通过本身已知的方法进行(见，例如，Sproat等人，(1991)Nucl. Acid. Res.(核酸研究)19，733-738 ;Cotton 等人，(1991) Nucl. Acid. Res.(核酸研究)19， 2629-2635 ；Hobbs 等人，(1973)Biochemistry (生物化学)12,5138-5145)。本发明的适配体还可以变更(例如化学取代)核酸碱基(例如嘌呤或嘧啶) 以增加胃促胰酶结合活性等。5-位置嘧啶变更、6-和/或8-位置嘌呤变更、用环外 (extracyclic)胺变更、用4_硫代尿苷取代以及用5_溴代或5_碘代-尿嘧啶取代可以作为这种变更的实例被提及。可以改变包含在本发明适配体中的磷酸基团从而给予对核酸酶和水解的抗性。例如，P (0) 0基团可以用以下基团取代=P (0) S (硫代物)、P (S) S ( 二硫代物)、P (0) NR2 (酰胺化物)、P (0) CH3> P (0) BH3> P (0) R、R (0) OR，、⑶或 CH2 (缩甲乙醛)或 3，-胺(-NH-CH2-CH2-) [其中R或R’的各单位是独立的H或取代的或未取代的烷基(例如甲基、乙基)]。连接基团是，例如，-0-、-N-或-S-，而核苷酸能够通过这些连接基团连接到邻接的核苷酸。所述变更也可以包括变更诸如在3’和5’的加帽反应。可以通过给末端添加以下各项来进一步进行变更聚乙二醇、氨基酸、肽、反向 dT、核酸、核苷、肉豆蔻酰、石胆酰、二十二烷基(docosanyl)、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰(Linoleoyl)、其他脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光物质、抗癌药剂、毒素、酶、放射性物质、生物素等。对于这些变更，见，例如，US专利5，660，985和 5，756，703。可以如本文所公开的以及通过本领域中本身已知的方法合成本发明的适配体。合成方法采用RNA聚合酶。化学合成具有所需序列和RNA聚合酶启动子序列的DNA，通过公知方法转录作为模板的所述DNA以获得所需的RNA。还能够使用DNA聚合酶来合成本发明适配体。化学合成具有所需序列的DNA，通过公知为聚合酶链式反应(PCR)的方法来扩增作为模板的所述DNA。通过公知方法聚丙烯酰胺电泳或酶处理使此变为单链。当合成修饰的适配体时，可以通过使用在特定位点突变的聚合酶来增加延伸反应效率。如此获得的适配体能够容易地通过公知方法来纯化。适配体能够通过化学合成方法诸如亚酰胺(amidite)法和亚磷酰胺法来大量合成。这些合成方法广为人知，如在Nucleic Acid(核酸)(卷幻[1]核酸的合成和分析(由 Yukio Sugiura编辑，由Hirokawa出版社出版)等中描述的。实际上，使用合成器诸如 OligoPilotlOO 或 OligoProcess (由 GE Healthcare Bioscience 制造)。如此合成的适配体能够通过本身已知的方法诸如层析法来纯化。假如在化学合成的过程中通过亚磷酰胺法等来将活性基团诸如氨基基团引入适配体中，可以在所述合成后添加功能物质。例如，通过将氨基基团引入到所述适配体的末
端，有可能缩合结合有羧基的聚乙二醇链。适配体以多种结合模式与目标分子结合，诸如基于磷酸基团的负电荷的离子键、 基于核糖的疏水键和氢键以及基于核酸碱基的氢键和堆积相互作用。尤其是，以与组成核苷酸的数目相同的数目出现的基于磷酸基团负电荷的离子键是强的，并且与出现在蛋白正电荷表面上的赖氨酸和精氨酸形成化学键。因此，可以取代不直接参与结合目标分子的核酸碱基。尤其是，因为茎结构区域已经形成碱基对并且朝向双螺旋结构的内部，所以核酸碱基不太可能直接结合目标分子。因此，即使当碱基对被另一个碱基对代替时，所述适配体的活性通常不减小。在其中没有形成碱基对的结构诸如环结构中，假如核酸碱基不参与直接结合所述目标分子，则碱基置换是可能的。关于核糖2’ -位置的修饰，在核糖2’ -位置的功能基团很少直接与所述目标分子相互作用，但是在很多情况中，它不具有相关性，并且能够由另一个修饰的分子取代。因此，除非涉及直接与所述目标分子结合的功能基团被取代或缺失，适配体通常保持其活性。同样重要的是总的三维结构不发生大的变化。能够使用SELEX法或其改进版本来制备适配体(例如，Ellington等人，(1990) Nature (自然)，346，818-822 ；Tuerk 等人，(1990) kience (科学)，249，505-510)。在所述 SELEX法中，通过增加轮数或使用竞争性物质来使所述选择标准更严格，浓缩并选择展示较强的对所述目标分子的结合潜能的适配体。因此，通过调整SELEX的轮数和/或改变竞争性条件，在一些情况中能够获得具有不同结合力的适配体、具有不同结合模式的适配体以及具有相同结合力或结合模式但是具有不同碱基序列的适配体。所述SELEX法包括通过PCR 扩增的过程；通过在所述过程中使用锰离子等来引起突变，有可能以较高的多样性来进行 SELEX。通过SELEX获得的适配体是展示对目标分子高亲和性的核酸，但这不意味着抑制所述目标分子的生物活性。胃促胰酶是碱性蛋白，据认为核酸有可能与其非特异地结合，但是与那些不同有力地结合到胃促胰酶的特定位点的适配体不影响所述目标分子的活性。实际上，包含用作阴性对照的随机序列的RNA不抑制胃促胰酶的酶活性，尽管它与胃促胰酶弱地结合。基于如此选择的活性适配体，可以进行SELEX以获得具有较高活性的适配体。明确地，在制备其中具有确定序列的适配体被部分随机化的模板或掺杂有10至30%的随机序列的模板后，再次进行SELEX。通过SELEX获得的适配体具有大约80个核苷酸的长度，并且实际上这难以作为药物制备。因此，有必要重复试错法(try-and-error)尝试以使所述适配体缩短到50个核苷酸或更短的长度以使化学合成容易。依靠为通过SELEX获得的适配体设计的引物，随后的最小化操作的方便度改变。除非成功设计所述引物，否则随后的开发将是不可能的，即使通过SELEX选择具有活性的适配体。在本发明中，获得了具有23个核苷酸却保持活性的适配体。因为适配体允许化学合成所以能够容易地修饰它们。对于适配体，通过使用MFOLD 程序来预测二级结构，或通过X射线分析或NMR分析来预测空间结构，有可能在某种程度上预测可以取代或缺失那个核苷酸，以及在哪里插入新的核苷酸。能够容易地化学合成预测的具有新序列的适配体，并且能够使用现有的测定系统来确定所述适配体是否保持活性。
如果通过如上所述的重复的试错法尝试鉴定了对获得的适配体与所述目标分子结合重要的区域，在很多情况中即使当将新的序列添加到所述序列的两个末端时所述活性仍保持不变。所述新序列的长度不受具体的限制。本领域普通技术人员能够获得各种各样的修饰的设计和变更，如序列。如上所述，适配体允许各种各样的修饰的设计和变更。本发明也提供制备允许包含指定序列(例如相当于选自以下区域中的部分的序列茎区域、内环区域、凸起区域、发夹环区域和单链区域下文中，当需要时简称为固定(fixed)序列)的适配体的各种各样的设计或变更的适配体的方法。例如，这种适配体的制备方法包括通过使用一种核酸分子或多种核酸分子(例如具有不同数字“a”或“b”的核酸分子库)来制备包含固定序列的适配体，所述多种核酸分子由下式显示的核苷酸序列和分别相对于引物序列(i)和(ii)的引物对组成
弓丨物序列固定序列-(N)b- I引物序列(ii)[其中(N)a代表由“ a ”个单位的N组成的核苷酸链；(N) b代表由“ b ”个单位的N 组成的核苷酸链；每个单位的N，不管是相同的还是不同的，是选自由A、G、C、U和T (优选地，A、G、C和U)组成的基团的核苷酸。各个“a”和“b”，不管是相同的还是不同的，可以是任何数字，并且可以是，例如，1至大约100，优选地1至大约50，更优选地1至大约30，还更优选地1至大约20或1至大约10]。本发明还提供复合物，所述复合物包含本发明的适配体和与其结合的功能物质。在本发明的复合物中所述适配体和所述功能物质之间的键可以是共价键或非共价键。本发明的复合物可以是这样的个体，其中本发明的适配体和一个或多个(例如2个或3个)同类或不同类的功能物质结合在一起。所述功能物质不受具体的限制，只要它以新的方式给予本发明的适配体特定的功能，或能够改变(例如改进)本发明的适配体能够具有的特定性质。蛋白、肽、氨基酸、脂质、糖、单糖、多核苷酸和核苷酸能够作为所述功能物质的实例被提及。亲和性物质(例如生物素、抗生蛋白链菌素、对目标互补序列具有亲和性的多核苷酸、抗体、谷胱甘肽琼脂糖凝胶、组氨酸)、用于标记的物质(例如荧光物质、发光物质、放射性同位素)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、药物递送载体(例如脂质体、微球、肽、聚乙二醇)、药物(例如用于导弹疗法(missile therapy) 的那些诸如刺孢霉素(calicheamycin)和duocarmycin ；氮芥类似物诸如环磷酰胺、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺或或曲磷胺(trofosfamide)；氮丙啶(乙基enimines) 诸如塞替派(thiotepa)；亚硝基脲(nitrosoureas)诸如卡莫司汀(carmustine)；烷基化药剂诸如替莫唑胺(temozolomide)或达卡巴嗪(dacartazine)；叶酸类代谢拮抗剂诸如甲氨蝶呤(methotrexate)或雷替曲塞(raltitrexed)；嘌呤类似物诸如硫鸟嘌呤 (thioguanine)、克拉屈滨(cladribine)或氟达拉滨(f ludarabine)；嘧啶类似物诸如氟尿嘧啶、替加氟或吉西他滨(gemcitabine)；长春花生物碱(vinca alkaloids)诸如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)或长春瑞滨(vinorelbine)及其类似物； 鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物诸如足叶乙苷(etoposide)、紫杉烷类(taxans), 多西他赛(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)；安慈拉环素(anthracyclines)诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、伊达比星(idarubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)，及其类似物；其他细胞毒性抗生素诸如博来霉素和丝裂霉素；钼化合物诸如顺钼(cisplatin)、卡波钼(carboplatin)和奥沙利钼(oxaliplatin)；喷司他丁 (pentostatin)、米替福新(miltefosine)、雌莫司汀(estramustine)、托泊替康 (topotecan)、伊立替康(irinotecan)和比卡鲁胺(bicalutamide))以及毒素(例如蓖麻毒素、Iiatoxin和维罗毒素(Vero toxin))能够作为所述功能物质的实例被提及。在一些情况中这些功能分子最终被除去。此外，所述分子可以是能够由酶诸如凝血酶、基质金属蛋白酶(MMP)和因子X识别和切割的肽，并且可以是能够由核酸酶或限制性内切酶切割的多核苷酸。本发明的适配体或复合物能够被用作，例如，药物或诊断试剂、检测试剂或试剂。本发明的适配体和复合物能够具有抑制胃促胰酶功能的活性。如上所述，胃促胰酶与纤维化和心血管疾病十分相关。因此，本发明的适配体和复合物作为用于治疗或预防伴随纤维化或心血管障碍的疾病的药物是有用的。本发明的适配体和复合物能够特异地结合胃促胰酶。因此，本发明的适配体和复合物作为用于检测胃促胰酶的探针是有用的。所述探针在胃促胰酶体内成像、胃促胰酶血浓度测量、组织着色、ELISA等中是有用的。所述探针作为用于涉及胃促胰酶的疾病(伴随纤维化或心血管障碍等的疾病)的诊断试剂、检测试剂、分析试剂等也是有用的。基于它们对胃促胰酶特异的结合，本发明的适配体和复合物能够用作纯化胃促胰酶的配体。本发明的适配体和复合物能够用作药物递送载体。涉及器官或组织纤维化的疾病包括肺纤维化、前列腺增生、心肌纤维化、肌骨骼纤维化、骨髓纤维化、子宫肌瘤、硬皮病、术后粘连、术后瘢痕、灼伤瘢痕、肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩、特应性皮炎、腹膜硬化、哮喘、肝硬化、慢性胰腺炎、胃硬癌(scirrhous gastric cancer)、肝纤维化、肾纤维化、血管纤维化疾病、归因于糖尿病并发症纤维化微血管炎 (fibrous microvasculitis)的视网膜炎、神经症、肾病、肾小球肾炎、肾小管间质肾炎、遗传性肾病、动脉硬化周围动脉炎等。心血管疾病包括血管病、主动脉瘤、肾功能不全、高血压、动脉硬化、心肌梗塞、 心脏肥大、心力衰竭、归因于经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty)等的血管病后再狭窄、糖尿病肾病和非糖尿病肾病、外围循环疾病寸。胃促胰酶具有酶活性并且切割充当底物的生物活性物质。目前已知的底物的实例包括AngI、潜伏TGF-β、SCF、前胶原、胶原酶原、pro-MMP-9、IL-li3前体等。胃促胰酶通过制备或降解这些生物活性肽的反应展示生物学作用，所述反应包括细胞外基质重建、细胞因子网络、免疫和血管收缩。同时，胃促胰酶自身激活肥大细胞并且促进组胺释放，并且与炎症密切相关。因此，本发明的适配体和复合物不限于上述底物，并且能够被用作用于与由胃促胰酶接受的底物介导的生物学功能相关的疾病以及由胃促胰酶自身参与的疾病的药物或诊断试剂、检测试剂和分析试剂。本发明的药物可以与药用载体制备在一起。赋形剂诸如蔗糖、淀粉、甘露糖醇(marmit)、山梨糖醇(sorbit)、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙和碳酸钙；粘合剂诸如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚
16乙二醇、蔗糖和淀粉；分解质诸如淀粉、羧基甲基纤维素、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠 (sodium-glycol-starch)、碳酸氢钠、磷酸钙和柠檬酸钙；润滑剂诸如硬脂酸镁、Aerosil, 滑石和十二烷基硫酸钠；增味剂诸如柠檬酸、薄荷醇、甘草甜素铵盐、甘氨酸和橘粉；防腐剂诸如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯；稳定剂诸如柠檬酸、柠檬酸钠和乙酸；助悬剂诸如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和硬脂酸铝；分散剂诸如表面活性剂； 稀释剂诸如水、生理盐水和桔汁；底蜡诸如可可脂、聚乙二醇和煤油；等能够作为药用载体的实例被提及，但是这些不是限制性的。对本发明药物的给药途径没有限制，本发明的药物能够通过例如口服给药和肠胃外给药来给药。适合口服给药的制剂是通过将有效量的配体溶解在稀释剂诸如水、生理盐水或桔汁中制备的溶液；以固体或颗粒形式包含有效量的配体的胶囊、袋剂或片剂；通过将有效量的活性成分悬浮在合适的分散剂中制备的悬浮液；通过分散和乳化在合适分散剂中的有效量的活性成分的溶液制备的乳剂；促进水溶性物质吸收的Cio等。当需要时能够通过本身已知的用于遮味、肠溶、持续释放等的方法来给本发明的药物加包衣。作为用于包衣的涂层剂的实例，使用羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙二醇、吐温80、普流罗尼克(PlUronic)F68、乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟基甲基纤维素、Eudragit (由Rohm， Germany制造，甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)、色素(例如红氧化铁、二氧化钛等)等。所述药物可以是快速释放制剂或持续释放制剂。作为适于肠胃外给药(例如，静脉内给药、皮下给药、肌肉内给药、局部给药、腹膜内给药、鼻内给药等)的制剂，可以获得水成和非水成等渗无菌注射液，所述注射液包括抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂、等渗剂等。水成和非水成无菌悬浮液也能够被提及，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、杀菌剂等。所述制剂能够以单位剂量容积或若干分开的剂量包含在容器诸如安瓿瓶或药水瓶中。活性成分和药用载体也能够被冻干并且以这样的状态贮存，即正好在使用前可以溶解或悬浮于合适的无菌载体中。持续释放制剂也是合适的制剂。持续释放制剂的剂型包括从包埋于体内的载体或容器诸如人造骨、生物可降解基质(base)或非生物可降解海绵、袋等中持续释放。用于从体外连续或间歇、全身或局部递送的设备，诸如药物泵和渗透压泵，也包含在持续释放制剂的范围内。生物可降解基包括脂质体、阳离子脂质体、聚(乳酸乙醇酸共聚物)酸(PLGA)、 atherocollagen、明胶、轻基磷灰石、多糖西佐口南(polysaccharide sizofiran)。除液体注射剂、悬浮剂和持续释放制剂外，适合经肺给药的吸入剂、适合经皮给药的膏剂等是可接受的。在吸入剂的情况中，处于冻干状态的活性成分被微粉化并通过使用适当的吸入设备吸入来给药。当需要时能够适当地将吸入剂与常规使用的表面活性剂、油、调味品、环糊精或其衍生物等制备在一起。能够根据传统方法制备吸入剂。特别地，能够通过以下方法制备吸入剂将本发明的适配体或复合物粉末化或液化，将其混合在吸入推进剂和/或载体中，并且将其填充到适当的吸入容器中。当上述本发明的适配体或复合物是粉剂时，能够使用普通的机械粉末吸入器；在液体的情况中，能够使用吸入器诸如喷雾器。此处，能够广泛使用通常已知的个体作为推进剂；含氯氟烃系列化合物诸如含氯氟烃-11、含氯氟烃-12、含氯氟烃-21、含氯氟烃-22、含氯氟烃-113、含氯氟烃-114、含氯氟烃-123、含氯氟烃-142c、含氯氟烃-134a、含氯氟烃-227、含氯氟烃-C318和1，1，1，2-四氟乙烷，碳氢化合物诸如丙烷、异丁烷和正丁烷，醚诸如二乙醚，压缩气体诸如气态氮和气态二氧化碳等能够被提及。此处，油酸、卵磷脂、二乙二醇二油酸酯、四氢糠基油酸酯(tetrahydroflufuryl oleate)、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、三油酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单赖氨酸甘油酯(glyceryl monolysinoate)、十六烷醇、硬脂醇、聚乙二醇 400、氯化十六烷吡啶、三油酸山梨酯(商品名Span 85)、单油酸山梨酯(商品名Span 80)、 单月桂酸山梨酯(商品名20)、聚氧乙烯硬化蓖麻油(商品名HC0-60)、聚氧乙烯00)山梨糖醇酐单月桂酸酯(商品名吐温20)、聚氧乙烯00)山梨糖醇酐单油酸酯(商品名吐温 80)、天然来源卵磷脂(商品名EPICL0N)、油醇聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij 92)、硬脂醇聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij 72)、月桂醇聚氧乙烯(4)醚(商品名Brij 30)、油醇聚氧乙烯(2)醚(商品名GenapolO-020)、氧乙烯和氧丙烯嵌段共聚物(商品名Synperonic)等能够作为表面活性剂的实例被提及。玉米油、橄榄油、棉籽油、葵花油等能够作为油的实例被提及。在膏剂的情况中，将适当的药用基剂(黄凡士林、白凡士林、石蜡、plastibase、硅氧烷、白软膏、蜂蜡、猪油、植物油、亲水软膏、亲水凡士林、精制羊毛脂、水解羊毛脂、吸水软膏、亲水plastibase、聚乙二醇软膏等)与活性成分本发明的适配体混合，并且将其用作制剂。取决于以下因素本发明药物的剂量变化活性成分的种类和活性、疾病的严重度、 作为给药受试者的动物物种、给药受试者的药物可允许性、体重、年龄等，而基于成人每日所需活性成分量的通常剂量，可以是大约0. 0001 大约100mg/kg，例如，大约0. 0001 大约10mg/kg，优选地大约0. 005 大约lmg/kg。本发明还提供在其上固定的具有本发明的适配体和/或复合物的固相载体。基底、树脂、平板(例如多孔板)、滤膜、药筒、柱和多孔物质能够作为固相载体的实例被提及。 所述基底可以是用于DNA芯片、蛋白芯片等的基底；例如，镍-PTFE(聚四氟乙烯)基底、玻璃基底、磷灰石基底、硅基底、氧化铝基底等，而通过用聚合物等给这些基底加涂层制备的基底能够被提及。作为树脂的实例，琼脂糖颗粒、二氧化硅颗粒、丙烯酰胺和N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯交联的二乙烯基苯颗粒、用表氯醇交联的葡聚糖的颗粒、纤维素纤维、芳基葡聚糖(aryldextran)和N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物、单分散性合成聚合物、单分散性亲水聚合物、琼脂糖、Toyopearl等能够被提及，并且也包括通过将不同的功能基团与这些树脂结合而制备的树脂。本发明的固相载体能够用于例如纯化、检测和定量胃促胰酶。通过本身已知的方法本发明的适配体和/或复合物能够被固定到固相载体上。例如，能够提到这样的方法将亲和性物质(例如以上描述的那些)或预先确定的功能基团引入到本发明的适配体和/或复合物中，然后经由亲和性物质或预先确定的功能基团将所述适配体或复合物固定到固相载体上。本发明也提供这样的方法。所述预先确定的功能基团可以是能够经历偶联反应的功能基团；例如，氨基、硫醇基、羟基和羧基能够被提及。本发明也提供将这种功能基因引入其中的适配体。本发明也提供纯化和浓缩胃促胰酶的方法。尤其是，本发明使胃促胰酶与其他家族蛋白的蛋白分离成为可能。本发明纯化和浓缩的方法可以包括使胃促胰酶吸附到本发明的固相载体上，并且用洗脱液洗脱吸附的胃促胰酶。能够通过本身已知的方法将胃促胰酶吸附到本发明的固相载体上。例如，将包含胃促胰酶的样品(例如细菌或细胞培养物或培养物上清液、血)引入到本发明的固相载体或包含同样的组合物中。可以使用洗脱液诸如中性溶液将胃促胰酶洗脱。对中性洗脱液没有限制，所述中性洗脱液的PH可以是，例如，大约6 大约9，优选地大约6. 5 大约8. 5，以及更优选地大约7 大约8。所述中性溶液还能够包括，例如，尿素、螯合剂(例如EDTA)、钠盐(例如NaCl)、钾盐(例如KCl)、镁盐(例如MgCl2)、表面活性剂(例如吐温20、Triton、NP40)和甘油。本发明纯化和浓缩的方法可以进一步包括在胃促胰酶吸附后使用漂洗溶液漂洗所述固相载体。漂洗溶液的实例包括包含以下物质的那些尿素、螯合剂(例如EDTA)、Tris、酸、碱、转移RNA、DNA、表面活性剂诸如吐温20、盐诸如NaCl等。本发明纯化和浓缩的方法可以仍然进一步包括加热所述固相载体。此步骤能够使所述固相载体再生和灭菌。本发明也提供检测和定量胃促胰酶的方法。尤其是，本发明允许与其他家族蛋白的蛋白分离地检测和定量胃促胰酶。本发明检测和定量的方法可以包括通过利用本发明的适配体(例如通过使用本发明的复合物和固相载体)来测量胃促胰酶。能够以与免疫学方法相同的方式来进行检测和定量胃促胰酶的方法，除了使用本发明的适配体代替抗体以夕卜。因此，通过使用本发明的适配体代替抗体作为探针，以与以下方法相同的方式酶免疫测定(EIA)(例如直接竞争性ELISA、非直接竞争性ELISA、夹心式ELISA)、放射性免疫测定 (RIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹技术、免疫组织化学染色法和细胞分选法，能够进行检测和定量。本发明的适配体也能够用作PET等的分子探针。这些方法能够用于，例如， 在活体或生物样品中测量胃促胰酶含量，和诊断与胃促胰酶有关的疾病。在本文提及的所有出版物中的包括专利和专利申请说明书的公开内容，通过本文的引用以这样的程度结合于本发明中以致它们都已经被清楚地给出。在下文中，通过以下实施例来更详细地描述本发明，然而所述实施例绝不限制本发明的范围。实施例实施例1 制备与胃促胰酶特异结合的RNA适配体(1)使用SELEX方法制备与胃促胰酶特异结合的RNA适配体。改进Ellington等人 (Ellington 和 Szostak, Nature (自然)346，818-822，1990)的方法和 Tuerk 等人(Tuerk 和Gold，Science (科学)249，505-510，1990)的方法来进行SELEX。使用固定在NHS活化的kpharose (琼脂糖凝胶)4Fast Flow (由GE Healthcare制造)载体上的胃促胰酶(人皮肤，由Calbiochem制造)作为目标分子。如在说明书中由GE Healthcare指导的那样将胃促胰酶固定到所述载体。使用SDS-PAGE通过在固定前检验胃促胰酶溶液和在固定后就检测上清液来确认固定的量。作为SDS-PAGE的结果，在上清液中没有检测到胃促胰酶的条带；确认几乎所有使用的胃促胰酶都已经被偶联。这意味着大约167pmol的胃促胰酶被固定到大约3μ L的树脂上。通过使用Dur必cribe T7转录试剂盒(由Epicentre制造)转录化学合成的DNA 来获得在第一轮中使用的RNA(40N)。通过此方法获得的RNA在嘧啶核苷酸的核糖的2’-位置被氟取代。使用以下的长度为70个核苷酸的DNA作为DNA模板，所述DNA在40个核苷酸的随机序列的每个末端都具有引物序列。所述DNA模板和所用的弓I物通过化学合成来制备。DNA 模板5’-GCGGCCGCTCTTCTATGNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCCTACCG T-3，(SEQ ID NO 1)弓 I物 Fwd :5，-T AATACGACTCACTATAGGGACGGTAGGAA T T C-3，(SEQ ID NO :2)引物 Rev:5，-GCGGCCGCTCTTCTAT G_3，(SEQ ID NO :3)在所述DNA模板(SEQ ID NO 1)中连续的N是40个具有任何组合的核苷酸GON 每个N是A、G、C或T)，其产生所获得的各适配体独有的序列区域。所述引物Fwd包括T7RNA 聚合酶的启动子序列。在第一轮中所用的RNA库的变化理论上是1014。将所述RNA库添加到固定有胃促胰酶的载体上，并且允许其在室温下静置30分钟。然后，用溶液A漂洗所述树脂以除去未与胃促胰酶结合的RNA。此处，所述溶液A是 145mM氯化钠、5. 4mM氯化钾、1. 8mM氯化钙、0. 8mM氯化镁和20mM Tris的混合溶液。使结合到胃促胰酶的RNA在95°C加热10分钟并添加溶液B作为洗脱液，并且从所述上清液中回收。此处，所述溶液B是7M尿素、3mM EDTA和IOOmM Tris-HCl (pH6. 6)的混合物。通过 RT-PCR扩增回收的RNA并且使用Dur必cribe T7转录试剂盒将其转录，并将此用作下一轮的库。以此过程作为1轮，将同样的操作进行多次。在完成SELEX后，将PCR产物克隆到 pGEM-T Easy载体(由Promega制造)中，并且用其转化大肠杆菌菌株DH5 α (由Toyobo制造)。在从单克隆中抽提出质粒后，使用DNA测序仪(3130x1 Genetic Analyzer，由ABI制备)来确定克隆的碱基序列。在8轮SELD(后，测序44个克隆的序列；可见序列的趋同性。一些克隆的序列由 SEQ ID NO :4-20显示。在所述序列中，存在6个由SEQ ID NO :4显示的序列，2个由SEQ ID NO 5显示的序列，和1个由SEQ ID NO 6-20显示的序列。SEQ ID NO 6和8只有一个碱基的区别。发现SEQ ID NO :4、13和14的序列包含由SEQ ID NO :21显示的共有序列，所述共有序列出现在44个克隆中的9个中。使用MFOLD程序(M. Zuker，Nucleic Acids Res.(核酸研究)31 (13) ,3406-3415，200 来预测这些序列的二级结构；由共有序列部分形成的部分具有相似的环结构(loop structure)。具有由SEQ ID NO :4、5、12-14和18显示的序列的适配体的推定的二级结构在图1中给出，其中由通过SEQ ID NO :21显示的共有序列形成的各部分被围在圈中。以下给出的是相应的核苷酸序列。除非另外说明，以下各个序列以从5’到3’的方向显示，其中嘌呤碱基(A和G)是以2’ -OH的形式，而嘧啶碱基(U和C)是以2’ -氟修饰的形式。在所述序列中，各N1和队指示选自A、G、C和U的任何核苷酸，而和\都是 A或都是G。SEQ ID NO 4 GGGACGGUAGGAAUUCGUCCAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAACAAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 5
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GGGACGGUAGGAAUUCCCACUUGUCUUUGAGGCAAGAAAUUGUAUUCCGAAGAAGCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO :6:GGGACGGUAGGAAUUCUACGGUCUGUGUGAAAUUGAAACACACAAAGAACAAUAGACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO :7:GGGACGGUAGGAAUUCACCUUUCCAAUUGUGAAAGAAACACAAAAAGAAAUGACAUCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 8 GGGACGGUAGGAAUUCUACGGUCUGUGUGAAAUUGAAACACACAAAGAACAAUAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 9 GGGACGGUAGGAAUUCCCGAAAAGCAACAAGCUUGCUAAAAUGAUUCCGAAAAAACACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 10 GGGACGGUAGGAAUUCCGCCGCCUAAAAAACGACGAUAUUACAGAAACGUCAAAUACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 11 GGGACGGUAGGAAUUCCCGACACGAAAUGUGUGAUUAAUUCCGAACAACAAAGUAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 12 GGGACGGUAGGAAUUCGCCGUCAACGUUACAUAAUGUAUAUACCAGGGUAACUAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 13 GGGACGGUAGGAAUUCCGCAACCAUCCCGUAACUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 14 GGGACGGUAGGAAUUCUCGUUCCUGACAGCAUUUGAGAUAGAUUUAAACAAACGCACAUAGAAGAGCGGCCGC
SEQ ID NO 15 GGGACGGUAGGAAUUCCCAGAAAAUAAAUUCCGAAGAAAACAACAAUUUUUGCAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 16 GGGACGGUAGGAAUUCCCAUGACUGAAAAACGUCAGUAAAAUCCGAAAAUCAUAUCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 17 GGGACGGUAGGAAUUCCGUUCGCAGAAACGAACUUUUAAAAAAUGUACGUGGGAGCACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 18 GGGACGGUAGGAAUUCGAACGACAAAUUAUAGAACUUCGUUUGACAUUCCACACCACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 19 GGGACGGUAGGAAUUCCCACUGCAAUUCAGCAGAAAAAAUUCCGAAAAACACACACCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 20 GGGACGGUAGGAAUUCAAAAUCAGCUGAUUUGUAAUUUUUUUACACAGGCAAAACACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 21 X1GauagaN1N2UaaX2在上述的8轮后，在相似的条件下继续SELEX。在第11轮完成后，测序93个克隆的序列。一些所述克隆的序列由SEQ ID NO :22-27显示。若干序列与一些在8轮后获得的序列相同；存在22个由SEQ ID NO 4显示的序列和4个由SEQ ID NO 14显示的序列。这意味着由SEQ ID NO :21显示的共有序列集中了。也存在1个由SEQ ID NO :5显示的序列、 3个由SEQ ID NO :22显示的序列和2个由SEQ ID NO :23和M显示的序列。一个序列由 SEQ ID NO 25-27显示。SEQ ID NO 22和11只有一个碱基的区别。SEQ ID NO 26和4只有一个碱基的区别。由SEQ ID NO :21显示的共有序列出现于93个克隆中的35个。在到第11轮为止新出现的序列中，由SEQ ID NO 25和沈显示的那些包含由SEQ ID NO 21显示的共有序列。具有由SEQ ID NO :22-27显示的序列的适配体的推定的二级结构在图2中给出，其中由通过SEQ ID NO :21显示的共有序列形成的各部分被围在圈中。这些部分都具有如在图1中的特征性的环结构。以下给出的是相应的核苷酸序列。除非另外说明，以下各个序列以从5’到3’的方向显示，其中嘌呤碱基(A和G)是以2’ -OH的形式，而嘧啶碱基(U和C)是以2’ -氟修饰的形式。SEQ ID NO 22 GGGACGGUAGGAAUUCCCGACACAAAAUGUGUGAUUAAUUCCGAACAACAAAGUAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 23 GGGACGGUAGGAAUUCAUAUGUACUCCGUCCUGACAAAAUGUCAAUGACAAACGUUCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 24 GGGACGGUAGGAAUUCCCUUCAUAGUAGAAUGUUGGUUUCUACAAAAGCGACAAGCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 25 GGGACGGUAGGAAUUCAGCUGACUCCAAUGCACACGUAGAUAGAGUUAAAACGUUGCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 26 GGGACGGUAGGAAUUCGUCGAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAACAAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 27 GGGACGGUAGGAAUUCCGUCAUCGGUUGCAAAUUGAAAAUACAAAACAAGGACAACCAUAGAAGAGCGGCCGC在上述8轮SELEX后，使用作为目标分子固定在H印arin kpharose (肝素琼脂糖凝胶)6i^ast Flow(由GE Healthcare制造)载体上的胃促胰酶(人皮肤，由Calbiochem 制造)继续SELEX。将溶液形式的胃促胰酶添加到所述载体并且在室温保持30分钟，由此将胃促胰酶固定到所述载体。使用SDS-PAGE通过在固定前检验胃促胰酶溶液和在固定后就检测上清液来确认固定的量。SDS-PAGE的结果没有在所述上清液中检测到胃促胰酶的条带，从而确认了几乎所有使用的胃促胰酶都被固定。显然大约IOOpmol的胃促胰酶被固定到大约3μ L的树脂上。克隆第11轮的库，并且确定79个克隆的序列。一些这些克隆的序列由SEQ ID NO 28-34显示。有若干序列与在上述8轮后获得的序列相同；存在9个由SEQ ID N0:4显示的序列和1个由SEQ ID NO 19显示的序列。有若干序列与在上述11轮后获得的序列相同； 存在2个由SEQ ID N0:27显示的序列。此外，存在4个由SEQ ID NO 显示的序列，2个由SEQ ID NO 29显示的序列