专利名称：诱导白木香产生沉香的3株真菌的制作方法2010版《中国药典》中记载中药沉香的基源植物为瑞香科(Thymelaeceae)沉香属(Aquilaria)植物白木香[A. sinensis (Lour. )Gilg.]含树脂的木材。在我国中药史上，沉香的药用价值已经认识很久。李时珍在《本草纲目》中记载“沉香性辛，微温，无毒，有降气、调中、清肝之效，为香帘冲动药。”2010版《中国药典》记载 沉香的功能与主治为行气止痛，温中止呕，纳气平喘。用于胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虚气逆喘急。关于沉香的生产和获取，有多种说法，但遇到的问题基本一致，即白木香结香周期很长，数量很少，品质不一，因此有“25年以下树龄不结香”的说法，在宋《本草衍义》中“有香者百无一二”的记载。长期的实践中，劳动人民发现沉香总是存在于白木香受伤和腐朽处，因此，李时珍在《本草纲目》中有“乃膏脉凝出自朽出者”，“乃刀斧伐仆膏脉结凝者”，“乃木朽而结者”和“因蠹隙而结者”的记载。在现在的实际生产中，和传统手段一样，仍然主要依靠用刀斧砍伤的办法来促使白木香结香，比起天然结香，时间大大缩短，但这样的方法仍然需要数年甚至十多年才能使白木香结香，生产速度慢的问题仍然困扰着沉香的合理使用和医药的供应，也致使白木香野生资源的蕴藏量急剧下降。1987年，白木香被列为国家珍稀濒危三级保护植物，1999年又被国务院批准为国家二级重点保护野生植物。因此，发展快速有效的白木香结香的生产技术显得尤为迫切。在自然条件下，白木香受到虫咬、真菌侵染、风吹折枝或人为致伤等随机因素的诱导，并经过长时间的积累，才有可能形成沉香。科学研究初步发现，某些真菌能够诱导白木香产生沉香，但是，到目前为止，尚未见有高效诱导活性真菌应用于实际生产中。本专利采用人工接菌技术,将活性真菌接种到白木香树上,从而提高沉香结香率,缩短沉香的生产周期并提高结香质量。这是用科学的方法生产沉香，提高沉香的产量和质量，满足医药卫生需要、维护人民群众健康的有效途径，也是实现野生白木香资源保护和可持续利用的有效途径之一。
本发明的目的在于提供3株能够诱导白木香产生沉香的真菌，将它们接种在白木香的树干或枝干上，能够使白木香产生与沉香理化性质相似的黄褐色物质。本发明提供的3株真菌，经鉴定分别为保藏编号为CGMCC No. 4453的小球壳孢属(Microsphaeropsis sp.)真菌 YNAS-4,保藏编号为 CGMCC No. 4455 的炭角菌属(Xylariasp.)真菌YNAS-6,和保藏编号为CGMCC No. 4456的毛双抱属(Lasiodiplodia sp.)真菌YNAS-S0这3株真菌于2010年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。菌株的保藏和存活证明见附件。3株真菌的培养特性分别为YNAS-4 :在PDA培养基上培养，菌落中央隆起，呈深青绿色，外围为白色，中央到边缘颜色由深渐淡，毛状边缘，菌丝较发达，为絮状，无明显分泌物。将直径为O. 65cm的菌片接种在PDA培养基上，生长5天菌落直径为3. 44cm。菌丝有不同直径的由细变粗的多种形态，最细的菌丝直径2 μ m,最粗的菌丝直径5 μ m。细菌丝与粗菌丝相连，粗菌丝是由细菌丝发展而来的。细菌丝淡色，无隔。粗菌丝呈暗色，菌丝中圆形颗粒内容物清晰可见。不产生分生孢子。YNAS-6 :在PDA培养基上培养，菌落乳白色，中央有均匀的棉絮状隆起，菌丝的分布是辐射状条形沟纹，像羽毛状分布，一层一层由中央向外围叠放，呈绳索条纹向外辐射，无明显分泌物。将直径为O. 65cm的菌片接种在PDA培养基上，生长5天菌落直径为3. 08cm。菌落质地坚硬，干燥。培养时间超过6天之后，菌落中央开始变黄，出现黑色斑块，并出现无色油滴状分泌物。菌落背面呈绳索辐射状。菌落长满后继续培养，黑白相间放射状的菌落表面有绒毛状菌丝团不均匀分布。菌丝直径3-4μπι，有隔。菌丝由无色透明和淡色两种色调的间隔组成。不产生分生孢子。YNAS-8 :将直径为O. 65cm的菌片接种在PDA培养基上，生长2天菌落直径为4. 82cm ;生长3天菌落长满直径9cm的培养皿。培养3天之内，菌落稀疏，呈白色；菌丝絮状；菌落背面白色，泛黄。培养3天之后，菌丝开始变得发达，菌落颜色由白色渐变成灰色，最后呈黑色。培养时间超过15天后，菌落表面出现黑色油状分泌物；菌落背面呈黑色。菌丝有粗、细2种。细菌丝直径约1-2 μ m，淡色。粗菌丝直径8-10 μ m，暗色。粗菌丝是由细菌丝发育而来的。菌丝有隔。细菌丝的隔间距较长。粗菌丝的隔间距较短。不产生分生孢子。3株真菌用荞麦皮培养基培养。荞麦皮培养基的组成为荞麦皮、麦麸、玉米粉、硫酸钙和糖类成分；其中糖类成分为葡萄糖、或果糖、或麦芽糖、或蔗糖、或葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖4种糖类成分中的任意两种或两种以上以任意比例混合的混合物。荞麦皮培养基的配制方法为(I)硫酸钙和糖类成分用水配成混悬液，硫酸钙的加入量按重量百分比计算为O.5% -I. 5%，糖类成分的加入量按重量百分比计算为O. 5% -I. 5%。硫酸钙微溶于水，糖类成分能溶于水。由于它们在配方中的用量较少，采用混悬液的方式加入，可以保证它们在培养基中均匀分散。(2)荞麦皮、麦麸和玉米粉三种干料按体积比为1-5 1-3 O. 05-0. I的比例混合均匀。(3)将含有硫酸钙和糖类成分的混悬液搅拌均匀，加入荞麦皮、麦麸和玉米粉混合的干料中，搅拌，使混合均匀。干料和混悬液的重量(g)与体积(mL)比为I : O. 8-1. 6。培养基PH自然，测量值一般在7. 5-8. 5之间。试管或罐头瓶等玻璃器皿，容器装量20-60%，121°C灭菌 120-180 分钟。3株真菌的培养方法将3株真菌分别自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于PDA培养基的平皿中，恒温25°C暗培养。培养至菌落直径大约3cm左右时，挑取边缘菌块，转接于装有上述固体培养基的罐头瓶中，20-28°C暗培养。待菌丝生长充满培养基约一半时，将培养的固体菌种转接于新的、相同的培养基中，于相同条件下培养。菌丝长满培养基后的菌种可以用于接种白木香，诱导白木香产生沉香；也可以作为大规模培养真菌的种子菌种使用。将3株真菌的固体培养物接种于白木香的树干或枝干上，能够诱导白木香产生沉香。接种的时候，菌株可以分别单独使用，也可以2株或3株同时使用。当使用混合菌种接种时，先将单独培养的各菌株的固体培养物以所需要的比例混合均匀，即可用于接种使用。I.5cm,深约5cm。如果接种前孔周围植物组织比较干燥，用无菌水喷洒孔壁，使其保持湿润。4)接菌将真菌YNAS-6的培养物用无菌镊子或小勺接入接种孔中，接种量约为4克，轻轻按压，保证菌种与开孔周围植物组织的接触，但不要将接种物压得过于致密。用少量无菌棉覆盖接种孔口，再用麻绳缠绕固定。以上处理重复3次。结果2个月之后观察，在接种部位有黑或黄褐色物质形成。真菌YNAS-6诱导白木香树干或枝干变色，形成黑褐色物质的范围(左右宽度，上下宽度)数据见表I。从接种部位周围取下木料燃烧时，能产生独特的沉香香味。用手摸变色部位，有油腻的感觉，但不会把手抹成黑或黄褐色。将黑褐色部位取出，阴干，称重，数据见表I。实施例3应用真菌YNAS-8诱导白木香产生沉香(I)固体培养基的制作配制果糖浓度为O. 5 %，麦芽糖浓度为I %，硫酸钙浓度为I %的混悬液；将荞麦皮、麦麸和玉米粉这3种材料按体积比为I : 3 O. I的比例混合均匀；每公斤干料中加入混悬液I. 6升，搅拌均匀。培养基分装后，于121°C灭菌180分钟。 (2)菌种的准备挑取经PDA平板活化的YNAS-8菌落边缘的菌种块，接种到装有上述固体基质的罐头瓶中，于20-22°C暗培养5天。将生长旺盛的真菌菌丝块再一次转接到装有荞麦皮培养基的罐头瓶中，于20-22°C暗培养10天，待用。(3)接种孔的准备选取树龄5年以上，胸径> IOcm)的白木香树，在树干或枝干上按照左右间隔8cm，上下间隔IOcm的距离，用电钻或手工打孔器打孔，孔口略向上，直径为2. 0cm，深约5cm。如果接种前孔周围植物组织比较干燥，用无菌水喷洒孔壁，使其保持湿润。(4)接菌将真菌YNAS-8的培养物用无菌镊子或小勺接入接种孔中，接种量约为5克，轻轻按压，保证菌种与开孔周围植物组织的接触，但不要将接种物压得过于致密。用少量无菌棉覆盖接种孔口，再用麻绳缠绕固定。以上处理重复3次。结果2个月之后观察，在接种部位及其周围有黑褐色物质形成。真菌YNAS-8诱导白木香树干或枝干变色，形成黑褐色物质的范围(左右宽度，上下宽度)数据见表I。从接种部位周围取下木料燃烧时，能产生独特的沉香香味。用手摸变色部位，有油腻的感觉，但不会把手抹黑。将黑褐色部位取出，阴干，称重，数据见表I。比较例I(I)固体培养基的制作配制果糖、葡萄糖、蔗糖浓度均为O. 5%，硫酸钙浓度为
I.5%的混悬液；将荞麦皮、麦麸和玉米粉这3种材料按体积比为3 3 O. I的比例混合均匀；每公斤干料中加入混悬液I. 2升，搅拌均匀。培养基分装后，于121°C灭菌120分钟。(2)接种孔的准备选取树龄5年以上，胸径彡IOcm的白木香树，在树干或枝干上按照左右间隔8cm，上下间隔IOcm的距离，用电钻或手工打孔器打孔，孔口略向上，直径为
I.5cm,深约3cm。如果接种前孔周围植物组织比较干燥，用无菌水喷洒孔壁，使其保持湿润。(3)空白处理用少量无菌棉覆盖接种孔口，再用麻绳缠绕固定。以上处理重复3次。(4)阴性对照处理将灭菌后的荞麦皮培养基用无菌镊子或小勺接入接种孔中，接种量约为3克，轻轻按压，保证培养基与开孔周围植物组织的接触，但不要将接种物压得过于致密。用少量无菌棉覆盖接种孔口，再用麻绳缠绕固定。以上处理重复3次。结果2个月之后观察，空白处理的接种孔周围变化很小，仅有很小范围的颜色变化，与周围组织颜色相比，略微发黄；阴性对照处理的接种孔周围变化也很小，仅有很小范围的颜色变化，颜色变黄。从以上2种处理的接种部位周围取下木料燃烧，气味不浓。以上2种处理形成的颜色变化的范围(左右宽度，上下宽度)数据见表I。将颜色变化部位取出，阴干，称重，数据见表I比较例2(I)固体培养基的制作配制葡萄糖浓度为O. 5%、蔗糖浓度为1%，硫酸钙浓度为I. 5%的混悬液；将荞麦皮、麦麸和玉米粉这3种材料按体积比为5 3 O. I的比例混合均匀；每公斤干料中加入混悬液I. 4升，搅拌均匀。培养基分装后，于121°C灭菌150分钟。(2)菌种的准备分别挑取经PDA平板活化的真菌YNAS-4，YNAS-6和YNAS-8的菌落边缘的菌种块，接种到装有上述固体基质的罐头瓶中，于22-24°C暗培养至菌丝生长充满培养基质的1/3-2/3，待用。 (3)接种孔的准备选取树龄5年以上，胸径彡IOcm的白木香树，在树干或枝干上按照左右间隔8cm，上下间隔IOcm的距离，用电钻或手工打孔器打孔，孔ロ略向上，直径为I. 5cm,深约5cm。如果接种前孔周围植物组织比较干燥，用无菌水喷洒孔壁，使其保持湿润。(4)接菌将真菌YNAS-4和YNAS-6的培养物按体积比约为I : I的比例混合均匀；将真菌YNAS-4和YNAS-8的培养物按体积比约为2 I的比例混合均匀；将真菌YNAS-6和YNAS-8的培养物按体积比约为I : 3的比例混合均匀；将真菌YNAS-4、YNAS-6和YNAS-8的培养物按体积比约为I : I : I的比例混合均匀；用无菌镊子或小勺将以上4种混合菌种分别接入接种孔中，接种量约为4-5克，轻轻按压，保证菌种与开孔周围植物组织的接触，但不要将接种物压得过于致密。用少量无菌棉覆盖接种孔ロ，再用麻绳缠绕固定。每种混合菌种分别重复3次。结果2个月之后观察，在接种部位有黒褐色物质形成。混合菌种诱导白木香树干或枝干变色，形成黒褐色物质的范围(左右宽度，上下宽度)数据见表I。从接种部位周围取下木料燃烧时，能产生独特的沉香香味。用手摸变色部位，有油腻的感觉，但不会把手抹黒。混合接菌比起空白和阴性对照有明显的优势。将黑褐色部位取出，阴干，称重，数据见表I。表I.白木香接种3种真菌后接种部位周围形成颜色变化的扩散范围及扩散部位木材的采收重量


本发明公开了3株真菌，它们分别是保藏编号为CGMCC No.4453的小球壳孢属(Microsphaeropsis sp.)真菌YNAS-4，保藏编号为CGMCC No.4455的炭角菌属(Xylaria sp.)真菌YNAS-6和保藏编号为CGMCC No.4456的毛双孢属(Lasiodiplodia sp.)真菌YNAS-8。将它们接种到白木香的树干或枝干上，能诱导白木香产生沉香，在提高中药沉香的产量，保护白木香自然资源等方面有广阔的应用前景。