专利名称：血管内皮生长因子2的制作方法发明领域本发明涉及新鉴定的多核苷酸，编码该多核苷酸的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用。以及这些多核苷酸和多肽的生产。本发明的多肽已确定为血管内皮生长因子家族的成员。更具体地，本发明的多肽是人血管内皮因子2(VEGF-2)。本发明还涉及对这些多肽作用的抑制。另外，本发明涉及抗本发明多肽的抗体。本发明还涉及施用血管内皮生长因子2(VEGF-2)多核苷酸和多肽以治疗感光细胞失调或损伤的方法。现有技术新血管的形成，或者称血管发生，是胚胎发育，随后的生长，和组织修复的关键。血管发生还是某些特定的病理状况，如瘤发生(即，肿瘤和神经胶质瘤)的基本部分。异常的血管发生还与其他的疾病如，炎症，类风湿性关节炎，牛皮癣，和糖尿病视网膜病相关(Folkman，J和Klagsbrun，M，科学，235442-447(1987))。酸性和碱性成纤维细胞生长因子分子是内皮细胞和其它细胞类型的促细胞分裂剂。血管紧张素和血管生成素能够诱导血管发生，尽管它们的功能还不十分清楚(Folkman，J，癌症医学，Lea and Febiger出版社，pp153-170(1993))。血管内皮细胞的高度选择性促细胞分裂剂为血管内皮生长因子或称VEGF(Ferrara，N等，内分泌学评论，1319-32(1992))，也被称为血管通透因子(VPF)。血管内皮生长因子是分泌的血管促细胞分裂剂，其靶细胞特异性表现为只限于血管内皮细胞。鼠的VEGF基因已经被鉴定并且它在胚胎形成时的表达类型也已分析。已发现VEGF在靠近有孔内皮，如脉络丛和肾小球的上皮细胞中持久表达。这些数据与VEGF作为内皮细胞生长和分化的多功能调节因子的作用相一致(Breier，G等，发育，114512-532(1992))。VEGF与人血小板衍生的生长因子，PDGFa和PDGFb具有序列同源性(Leung，D.W.，等，科学，2461306-1309，(1989))。同源性的范围分别为约21％和23％。8个半胱氨酸残基形成的二硫键结构在这些蛋白中是严格保守的。虽然它们很相似，但是VEGF和PDGF有着特异性差别。PDGF是结缔组织的主要生长因子，而VEGF则是对内皮细胞高度特异的。在VEGF，PLGF和PDGF中都鉴定出了不同剪接的mRNA，并且这些不同的剪接产物在生物学活性上和受体结合的特异性上有差异。VEGF和PDGF以同源二聚体或异源二聚体形式作用，并在受体二聚体化之后与表现出内在的酪氨酸激酶活性受体结合。按照不同的剪接，VEGF有121，165，189和206个氨基酸的四种不同的形式。VEGFI21和VEGF165是可溶性的并能够血管生成，而VEGF189和VEGF206与细胞表面的含有蛋白多糖的肝磷脂结合。VEGF的时相性和空间性表达与血管的生理增殖相关(Gajdusek，C.M.和Carbon，S.J.，细胞生理学，139570-579(1989)；McNeil，PL.等，细胞生物学杂志，109811-822(1989))。其高度亲和性结合位点在组织切片中只定位于内皮细胞(Jakeman，L.B.等，临床调查，89244-253(1989))。该因子可以从垂体细胞和其它几种肿瘤细胞系中分离到，并在人神经胶质瘤中有所显现(Plate，K.H.，自然，359845-848(1992))。令人感兴趣的，VEGF121和VEGF165的表达使得中国仓鼠卵细胞具有了在裸鼠上形成肿瘤的能力(Ferrara，N.等，临床调查杂志，91160-170(1993))。抗VEGF的单克隆抗体对VEGF功能的抑制作用显示出免疫缺陷的小鼠上对肿瘤生长的抑制(Kim，K.J.，自然，36281-844(1993))。而且，一种VEGF受体的结构域-阴性突变显示出可以抑制小鼠的成胶质细胞瘤的生长。还发现血管渗透因子(VPF)也负责着持久的、甚至在伤害停止时的微血管对血浆蛋白的高渗透性，这表明VPF是创伤愈合中的一种重要的因子。Brown，L.F.等，实验医学杂志，1761375-1379(1992)。VEGF的表达在血管化的组织中很高，(例如，肺、心、胎盘和固体肿瘤)并与血管生成在时相和空间上都相关。VEGF还显示出诱导体内血管生成。由于血管生成对于正常组织，尤其是血管组织的修复是最基本的，所以VEGF被期望用于促进血管组织的修复(例如，在动脉粥样硬化之中)。Chen等在1991年12月17日授权的美国专利5,073,492号公开了一种在适当的环境下用以协同增强内皮细胞生长的方法，其中包括在环境中加入VEGF，效应物和来自血清的因子。另外，血管内皮细胞生长因子C亚单位的DNA已经通过聚合酶链反应技术得以制备。此DNA编码一个可能以异源二聚体或者同源二聚体的形式存在的蛋白。该蛋白是哺乳动物血管内皮细胞的促细胞分裂剂，并且因而可用于促进血管发育和修复，正如欧洲专利申请No.92302750.2，1992年9月30日公开。
视网膜分化的视网膜由7种细胞组成感觉细胞(视杆细胞和视锥细胞)，神经胶质细胞(Muller细胞)，和二种神经元，中间神经元(水平，双极和amacrine神经元)，及投射神经元。视网膜中各种类型细胞的发育并不与大多数视锥细胞同步发生，且神经节和水平细胞在出生之前发育。相反，鼠视网膜的主要细胞大多数视杆细胞的分化在出生后发生。视网膜前体细胞子代的克隆分析已证实，这些祖细胞能产生视网膜细胞类型的各种组合，表明至少一些祖细胞是多潜能性的。另外，通过体内和体外研究发现推测此细胞的最终表型是广泛非谱系依赖性的，由此推测视网膜内微环境的改变在确定祖细胞的细胞潜能以及子代的分化表型中起作用。
在体外，视网膜细胞增殖和分化由各种因子调节，例如FGF-2，CNTF，LIF，视黄酸和BDNF，以及由胞外基质和细胞吸附分子调节，如S-层粘连蛋白。Yang和Cepko(神经学杂志16(19)6089-6099(1996))及最近的Wen等(生物化学杂志273(4)2090-2097(1998))已鉴别并定性了VEGFR-2/FLK-1的表达配体，一个VEGF受体家族的成员。VEGFR转录首先在与视网膜血管结构发育及神经视网膜中心区相关的E11.5中检测到(Yang和Cepko，神经学杂志16(19)6089-6099(1996))。尽管未知这两种情况是否相关，此发育阶段仍由神经节细胞发育开始而标志。通过发育15天，VEGFR-2表达趋于视网膜的外周，与视网膜发育的明显梯度相一致。在围产期期间，当神经生成在峰值及大量有丝分裂后的神经元形成时，VEGFR-2表达广泛定位于室区(ventricular zone)。
PDGF/VEGF超家族目前包括7个成员。VEGF亚家族的5个成员与4种不同的具有明显重迭特异性VEGF酪氨酸激酶受体结合。VEGF，一个是原型家族成员的34-36KDa同源二聚体糖蛋白，与VEGFR-1和VEGFR-2结合。VEGF-B和VEGF-D只分别与VEGFR-1或VEGFR-3结合。而VEGF-C，VEGF-2与VEGFR-3具有最高亲和性，其也与VEGFR-2较低亲和性结合。一旦激活VEGF受体酪氨酸磷酸化许多信号转导途径下游的蛋白质，包括磷脂酰肌醇3-激酶，磷脂酶C，GAP和Nck。
遗传性视网膜变性疾病(HRD疾病)是一组遗传性疾病，其中视网膜结构的进行性、对称性变性导致视网膜功能丧失；这些疾病例如包括年龄相关的黄斑变性，导致年长者视力减弱；Leber’s先天黑蒙，其导致患者出生即眼睛失明；和视网膜色素沉积(RP)。RP是那些特征在于缺失视网膜感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)，视网膜对光线电应答(即电视线或“ERGs”)在振幅中减弱的先天性视网膜病变的名称。随着疾病进展，患者显示出视网膜小动脉变细，随之出现视网膜的“骨刺”色素沉着及视神经盘蜡样苍白。
在美国RP的发生率估计大约为1∶3500出生率。RP的家族情况通常在9岁儿童中出现，并由于在外周视网膜中缺失视杆细胞而丧失外周中央视野。随着疾病进展，视野的缩小最后导致失明。进展阶段中眼底检查症状包括视网膜血管变细，外周眼底视网膜内色素沉积，及视神经盘蜡样苍白。患者具有异常的光线引起的视网膜电应答(即电视线或ERGs)，甚至在早期缺乏眼底检查的可见异常改变的情况下。组织病理学研究揭示在进展阶段普通缺失感光细胞。因此，需要一种治疗感光细胞失调及损伤的方法。
发明概述本发明的多肽基于与人VEGF的氨基酸序列同源性已经鉴别为是一种新的血管内皮生长因子。
根据本发明的一方面，提供了新的成熟多肽，及其生物学活性的和有诊断或治疗作用的片段，类似物及衍生物。本发明的多肽是人源的。
根据本发明的另一方面，提供了包含多核苷酸的分离的核酸分子，此多核苷酸编码具有SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的全长或截短的VEGF-2多肽，或编码具有由在1995年5月12日保藏在ATCC，保藏号、97149的，或1994年3月4日保藏在ATCC，保藏号75698的保藏在细菌宿主中的cDNA克隆编码的氨基酸序列的全长或截短的VEGF-2多肽。
本发明还涉及VEGF-2的生物学活性及诊断或治疗有用的片段，类似物和衍生物。
根据本发明的另一方面，提供了通过重组技术生产这种多肽的方法，包括在促进所述蛋白质表达及随后回收所述蛋白质的条件下培养重组的含有编码本发明多肽的核酸序列的原核和/或真核宿主细胞。
根据本发明的另一方面，提供了抗这种多肽的抗体和生产这种抗体的方法。
根据本发明的又一方面，提供了核酸探针，其包含长度足够与本发明的核酸序列特异杂交的核酸分子。
根据本发明的又一方面，提供了诊断与本发明的核酸序列及由这种核酸序列编码的蛋白质中突变相关的疾病或疾病易感性的方法。
根据本发明的又一方面，提供了利用这种多肽，或编码这种多肽的多核苷酸，在体外进行DNA合成及DNA载体生产及科学研究的方法。
根据本发明的又一方面，提供了利用这种多肽，或编码这种多肽的多核苷酸，进行例如保护或刺激感光细胞生长的治疗目的的方法。
根据本发明的又一方面，提供了这种多肽的拮抗剂，其可例如用于抑制或阻止感光细胞生长。
根据本文教导，本领域技术人员将清楚本发明的这些及其它方面。
附图简述

图1A～1E示出VEGF-2的全长核苷酸序列(SEQ ID NO1)和相应推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。该多肽包含大约419个氨基酸残基，其中大约23个代表前导序列。使用标准的单字母缩写代表氨基酸。用Model 373自动DNA测序仪(AppliedBiosystems.Inc.)进行测序。测序准确度预测高于97％。
图2A-2D示出VEGF-2的截短的，生物活性形式的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和相应推导的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。该多肽包含大约350个氨基酸残基，其中大约开始的24个氨基酸代表前导序列。
图3A-3B例证了PDGFa(SEQ ID NO5)，PDGFb(SEQ ID NO6)，VEGF(SEQ ID NO7)和VEGF-2(SEQ ID NO4)之间的氨基酸序列同源性。框内区域代表保守的序列及8个保守的半胱氨酸残基的位置。
图4以表的形式示出PDGFa，PDGFb，VEGF和VEGF-2之间的同源性百分比。
图5示出在人乳腺癌细胞系中VEGF-2 mRNA的存在情况。
图6示出在成人组织中VEGF-2的Northern印迹分析结果。
图7示出本发明的多肽在体外转录，翻译及电泳后SDS-PAGE凝胶的照片。泳道114C和彩虹M.W.标记；泳道2FGF对照；泳道3由M13-反向及正向引物产生的VEGF-2；泳道4由M13反向引物和VEGF-F4引物产生的VEGF-2；泳道5由M13反向和VEGF-F5引物产生的VEGF-2。
图8A和8B示出SDS-PAGE凝胶的照片。VEGF-2多肽在由Sf9细胞组成的杆状病毒系统中表达。取自培养基和细胞的胞质的蛋白质在非还原(图8A)和还原(图8B)条件下经SDS-PAGE分析。
图9是SDS-PAGE凝胶的照片。沉淀用本发明的核酸序列感染的Sf9细胞的培养基。重悬浮的沉淀物经SDS-PAGE分析并用考马斯亮蓝染色。
图10是SDS-PAGE凝胶的照片。自培养基上清液中纯化VEGF-2，并在有或无还原剂β-巯基乙醇的条件下经SDS-PAGE分析，并用考马斯亮蓝染色。
图11示出用RP-300层析柱(0.21×3cm，Applied Biosystems，Inc.)对纯化的VEGF-2进行反向HPLC分析。该层析柱用0.1％三氟乙酸(溶剂A)平衡，且蛋白质在7.5分钟内用0～60％梯度的溶剂B洗脱，溶剂B由含有0.07％TFA的乙腈组成。蛋白质洗脱液通过在215nm(红线)和280nm(兰线)的吸光度监测。溶剂B的百分率由绿线示出。
图12示出pHE4-5表达载体(SEQ ID NO9)和亚克隆的VEGF-2 cDNA编码序列的图式。表明了卡那霉素抗性标记基因，VEGF-2编码序列，oriC序列，和lacIq编码序列的位置。
图13示出pHE启动子的调节元件的核苷酸序列(SEQ ID NO10)。表明了二个lac操纵基因序列，Shine-Delgarno序列(S/D)，和末端Hind III和Nde I限制位点(斜体字处)。
图14A-D示出VEGF-2处理提高了视紫红质蛋白的水平和感光细胞的数量。分离的视网膜细胞制备自P1动物，以425个细胞/mm2的密度铺板，并用VEGF-2(A和B)或VEGF-2(C和D)处理。在2(空心正方形)，5(实心正方形)，7(空心圆)，或9(实心圆)天之后，培养物中细胞总数通过测定calcein发射而估算。然后将培养物固定并通过ELISA确定视紫红质蛋白的数量。
图15示出作为VEGF-2浓度的函数的，视紫红质免疫阳性细胞数的增加。视网膜细胞存在VEGF-1或VEGF-2的情况下在体外保持8天。然后将培养物固定并对视紫红质进行免疫组织化学染色。
图16A-C示出VEGF-2以发育限制方式提高视网膜培养物中BrdU和[3H]胸苷掺入的水平。细胞分离自P1动物并以425个细胞/mm2的密度铺板。培养物在铺板后最初用VEGF或VEGF-2处理4小时。在1，2或3天后，将培养物用BrdU标记4小时。然后将细胞固定并处理以进行BrdU免疫组织化学。
图17A-B示出作为在分离细胞和初始加入因子之间滞留时间的函数的对VEGF-2或VEGF-1的应答的丧失。一系列培养物在铺板后(9/0)最初用因子处理4小时，另一系列培养物在铺板后24或48小时(分别为8/1或7/2)处理。在培养9天后，将细胞固定并通过ELISA分析确定视紫红质蛋白的数量。
图18A-C示出VEGF提高Amacrine而不提高Muller或内皮细胞数量。视网膜细胞用指定浓度的VEGF-2处理8天。然后将细胞固定并对突触融合蛋白(A)进行免疫组织化学染色，分析高亲和性GABA吸收(B)，或GFAP(C)的水平。
图19A-C示出发育年龄对对VEGF-2应答的作用。衍生自E15(A)，E20(B)或P1(C)动物的视网膜细胞以212(空心正方形)，318(实心正方形)，或425个细胞/mm2的密度铺板。铺板4小时后，培养物用指定浓度的VEGF-2处理。24小时后，将培养物转换至无血清培养基中，并再一次加入因子。然后在48小时后将培养物用[3H]胸苷标记。
图20A-B对比了视网膜细胞对VEGF-2和其它因子的应答。培养物以425个细胞/mm2的密度种植并处理9天。A组示出用calcein估算的培养物中细胞总数，B组示出通过ELISA分析测定的视紫红质蛋白的水平。
图21A-C示出了CNTF抑制感光细胞祖细胞对VEGF-2的应答。视网膜培养物在铺板后用指定浓度的CNTF在含有或无150ng/mlVEGF-2的情况下处理24小时。在体外培养8天后，确定视紫红质蛋白的数量(A)及确定培养物中细胞总数(B)。(C)为确定CNTF处理对由VEGF-1诱导的早期增殖应答的作用，将培养物用指定浓度的VEGF-2在有或无100ng/ml CNTF的情况下处理。48小时后，将培养物用[3H]胸苷标记4小时。
图22示出对VEGF-2和抗体处理应答的增加的LEC增殖。
图23示出对VEGF-2和VEGF-2抗体组合应答的LEC增殖。
图24示出鼠抗VEGF-2单克隆抗体的表位图。
图25示出鼠VEGF-2单克隆抗体的情况。
优选的实施方案详述本发明一方面提供了包含编码VEGF-2多肽的多核苷酸的分离的核酸分子，VEGF-2多肽具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ IDNO2)，它是通过对克隆的cDNA测序而确定的。SEQ ID NO1所示核苷酸序列是通过对cDNA克隆测序而得的，该cDNA克隆于1995年5月12日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，获得的保藏号为97149，ATCC位于美国弗吉尼亚州马那萨斯大学道10801号，邮编VA20110-2209。
本发明另一方面提供了包含编码截短的VEGF-2多肽的多核苷酸的分离的核酸分子，该截短的VEGF-2多肽具有图2的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO4)，其是通过对克隆的cDNA进行测序而确定的。SEQ ID NO3所示的核苷酸序列是通过对一个cDNA克隆测序而得的，该cDNA克隆于1994年3月4日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号75698，ATCC位于美国弗吉尼亚州马那纳萨斯大学道10801号，邮编VA 20110-2209。
除非另外说明，本文中所有通过测序DNA分子而确定的核苷酸序列都是利用自动DNA测序仪(如Applied Biosystems公司的373型)确定的，而本文中所有的由DNA分子所编码的多肽的氨基酸序列都是通过对上述确定的DNA序列翻译而预测的。因此，正如本领域对通过自动化方法确定的任何DNA序列所了解的那样，本文所确定的任何一个核苷酸序列都可能有误差。自动化确定的核苷序列与实际的核苷酸序列典型地具有至少大约90％，更典型地至少大约95％～至少大约99.9％的相同性。实际的序列可以通过本领域所熟知的其它方法包括手工DNA测序方法而更为精确地测定。同样正如本领域所了解的，相对实际序列，在确定的核苷酸序列中的领域所了解的，相对实际序列，在确定的核苷酸序列中的单个插入或缺失，将会导致该核苷酸序列翻译上的移框，因而由确定的该核苷酸序列推导出的所编码的氨基酸序列将会从该插入或缺失点开始，完全不同于该测序DNA分子所编码的实际氨基酸序列。
编码本发明多肽的多核苷酸可得自早期人胚胎(8～9周)的破骨细胞瘤，成人心脏或一些乳腺癌细胞系。本发明的多核苷酸在衍生自早期9周龄人胚胎的cDNA文库中发现。它与VEGF/PDGF家族在结构上相关。它含有一编码有419个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，此蛋白质的大约头23个氨基酸残基是推定的前导序列，这样成熟的蛋白质包含396个氨基酸，此蛋白质与人血管内皮生长因子(30％相同性)，PDGFa(24％)和PDGFb(22％)具有最高度氨基酸序列同源性。尤为重要的是所有8个半胱氨酸残基在此家族的全部4个成员中都是保守的(见图3的加框区)。另外，PDGF/VEGF家族的特征，PXCVXXXRCXGCCN(SEQ ID NO8)在VEGF-2中是保守的(见图3)。VEGF-2，VEGF和二个PDGFs之间的同源性是在蛋白质序列水平的。核苷酸序列同源性未能检测到，因此难以通过简便方法和低严格性杂交而分离VEGF-2。
本发明的VEGF-2多肽包括全长多肽和编码任何前导序列和编码全长多肽的活性片段的多核苷酸序列。活性片段包括全长氨基酸序列的任何部分，其具有少于SEQ ID NO2所示全长氨基酸序列的全部419个氨基酸，但仍含有在图3中示出是保守的8个半胱氨基残基，及仍具有VEGF-2活性。
正常组织中有至少二个可变剪接的VEGF-2 mRNA序列。这二个条带示于图7，泳道5表明存在编码本发明VEGF-2多肽的可变剪接的mRNA。
本发明的多核苷酸可以是RNA或DNA形式。DNA包括cDNA，基因组DNA及合成的DNA。此DNA可以是双链或单链的，且如果是单链的则可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可与图1或图2所示编码序列相同，或与保藏的克隆的编码序列相同，或者可以是由于遗传密码简并或丰余所得的，编码如图1，图2或保藏的cDNAs相同的成熟多肽的不同编码序列。
编码图1或图2的成熟多肽的，或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括只是成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列及附加编码序列如前导或分泌序列，或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(及任选地附加编码序列)及非编码序列如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖了只含有该多肽的编码序列的多核苷酸，以及包括有附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明进而还涉及上文所述的多核苷酸的变异体，该多核苷酸编码具有图1或2中推导的氨基序列的多肽的片段、类似物和衍生物，及编码具有由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然存在的等位基因变异体，也可以是非天然存在的该多核苷酸的变异体。
因此，本发明包括的多核苷酸编码图1或2所示相同的成熟多肽，或者由保藏的克隆cDNA编码的成熟多肽，以及这些多核苷酸的变异体，这些变异体编码图1或2所示多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物。这种核苷酸变体包括缺失变体，取代变体及添加或插入变体。
如上所述，该多核苷酸序列可以具有图1所示编码序列或保藏的克隆的编码序列的天然存在的等位基因变异体的编码序列。正如本领域所熟知的，等位基因变异体是一个多核苷酸序列的另一种形式，它含有一个或多个核苷酸的取代，缺失或添加，而不实质地改变所编码的多肽的功能。
本发明还包括这样的多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列以相同的阅读框，与有助于多肽从宿主细胞中表达和分泌的多核苷酸相融合，例如，作为分泌序列控制多肽从细胞中转运的前导序列。具有前导序列的多肽是一前蛋白，且可以由宿主细胞切割前导序列以形成成熟形式的多肽。多核苷酸还可编码蛋白原(proprotein)，即成熟多肽加上另外的5’氨基酸残基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是一蛋白原，且是该蛋白的非活性形式。一旦该原序列被切割，则剩下活性的成熟蛋白。
因此，本发明的多核苷酸例如可编码成熟蛋白质，或具有原序列的蛋白质，或具有原序列及前序列(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸还可具有融入标记序列读框中的编码序列，从而使本发明的多肽纯化。在使用细菌宿主的情况下，标记序列可以是pQE-9载体的6个组氨酸标签，以利于纯化融合了该标记的成熟多肽，或者，例如，在使用哺乳动物宿主如COS-7细胞的情况下，标记序列可以是血凝素(HA)标签。HA标签相应于来自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson等，细胞37767(1984))。
本发明的另外实施方案涉及包含多核苷酸的分离的核酸分子，该多核苷酸的核苷酸序列至少95％，更优选至少96％，97％，98％或99％与选自以下一组核苷酸序列相同；(a)编码具有SEQ ID NO2中氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO2中除N末端甲硫氨酸外的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO2中1-396位氨基酸所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由包含于ATCC保藏号97149的cDNA克隆编码的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)编码具有由ATCC保藏号97149的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟VEGF-2多肽的核苷酸序列；及(f)互补于以上(a)，(b)，(c)，(d)，或(e)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的另外实施方案涉及包含多核苷酸的分离的核酸分子，该多核苷酸的核苷酸序列至少95％，更优选至少96％，97％，98％，或99％与选自以下一组核苷酸序列相同(a)编码具有SEQ ID NO4中氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO4中除N末端甲硫氨酸外氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO4中1-326位氨基酸所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由包含于ATCC保藏号75698的cDNA克隆编码的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)编码具有由ATCC保藏号75698的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟VEGF-2多肽的核苷酸序列；或(f)互补于以上(a)、(b)(c)(d)或(e)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
具有至少例如95％与编码VEGF-2多肽的参照核苷酸序列“相同”的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列与参照序列是相同的，除了相对于每100个参照的编码VEGF-2多肽的核苷酸序列的核苷酸之中该序列最多可包含5个点突变之外。换言之，为获得具有与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的一个多核苷酸，在参照序列中最多5％的核苷酸可缺失或用另外的核苷酸取代，或在参照序列可最多插入参照序列总核苷酸数5％的核苷酸。参照序列的这些突变可发生在参照核苷酸序列的5N或3N末端，或发生在这些末端位之间的任何位置，分散在参照序列的核苷酸之间或以一或多个连续组分散在参照序列中。
事实上，任何特定的核酸分子是否与例如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列，或与保藏的cDNA克隆的核苷酸序列至少95％，96％，97％，98％或99％相同，可常规应用已知计算机程序确定，如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 forUnix，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)。Bestfit利用Smith和Waterman的局部源算法(Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981)，以发现二序列间最佳同源片段。当利用Bestfit或任何其它序列对比程序确定一特定序列是否例如95％相同于本发明参照序列，当然要设定参数，由此在全长参照序列之上计算相同性百分比，且允许最高达参照序列总核苷数5％的同源性缺口。
VEGF-2变体可含有编码区改变，非编码区改变，或二区均改变。尤为优选的是多核苷酸变体含有产生沉默取代，添加或缺失的改变，但不改变编码的多肽的性质或活性。由于遗传密码简并通过沉默取代产生的核苷酸变体是优选的。另外，其中5-10，1-5或1-2个氨基酸以任何组合取代，缺失或添加的变体也是优选的。VEGF-2多核苷酸变体可由于各种原因而生产，例如针对特定宿主优化密码子表达(将人mRNA中密码子改变为细菌宿主如大肠杆菌所优选的密码子)。
例如，在VEGF-2的氨基酸水平的定点改变可通过用保守的氨基酸置换特定的氨基酸进行。优选的保守突变包括用A，G，I，L，S，T，或V置换M1；用K或R置换H2；用A，G，I，L，T，M或V置换S3；用A，G，I，S，T，M或V置换L4；用A，I，L，S，T，M或V置换G5；用W或Y置换F6；用W或Y置换F7；用A，G，I，L，T，M或V置换S8；用A，G，I，L，S，T或M置换V9；用G，I，L，S，T，M或置换A10；用A，G，I，L，T，M或置换S12；用A，G，I，S，T，M或V置换L13；用A，G，I，S，T，M或V置换L14；用G，I，L，S，T，M或V置换A15；用G，I，L，S，T，M或V置换A16；用G，I，L，S，T，M或V置换A1 7；用A，G，I，S，T，M或V置换L18；用A，G，I，S，T，M或V置换L19；用A，I，L，S，T，M或V置换G21；用H或K置换R23；用D置换E24；用G，I，L，S，T，M或V置换A25；用G，I，L，S，T，M或V置换A27；用G，I，L，S，T，M或V置换A28；用G，I，L，S，T，M或V置换A29；用G，I，L，S，T，M或V置换A30；用G，I，L，S，T，M，或V置换A31；用W或Y置换F32；用D置换E33；用A，G，I，L，T，M或V置换S34；用A，I，L，S，T，M或V置换G35；用A，G，I，S，T，M或V置换L36；用E置换D37；用A，G，I，S，T，M或V置换L38；用A，G，I，L，T，M或V置换S39；用E置换D40；用G，I，L，S，T，M或V置换A41；用D置换E42；用E置换D44；用G，I，L，S，T，M或V置换A45；用A，I，L，S，T，M或V置换G46；用D置换E47；用G，I，L，S，T，M或V置换A48；用A，G，I，L，S，M或V置换T49；用G，I，L，S，T，M或V置换A50；用F或W置换Y51；用G，I，L，S，T，M或V置换A52；用A，G，I，L，T，M或V置换S53；用H或R置换K54；用E置换D55；用A，G，I，S，T，M或V置换L56；用D置换E57；用D置换E58；用N置换Q59；用A，G，I，S，T，M或V置换L60；用H或K置换R61；用A，G，I，L，T，M或V置换S62；用A，G，I，L，S，T或M置换V63；用A，G，I，L，T，M或V置换S64；用A，G，I，L，T，M或V置换S65；用A，G，I，L，S，T或M置换V66；用E置换D67；用D置换E68；用A，G，I，L，S，T，M或V置换L69；用A，G，I，L，S，T或V置换M70；用A，G，I，L，S，M或V置换T71；用A，G，I，L，S，T或M置换V72；用A，G，I，S，T，M或V置换L73；用F或W置换Y74；用D置换E76；用F或W置换Y77；用F或Y置换W78；用H或R置换K79；用A，G，I，L，S，T或V置换M80；用F或W置换Y81；用H或R置换K82；用N置换Q84；用A，G，I，S，T，M或V置换L85；用H或K置换R86；用H或R置换K87；用A，I，L，S，T，M或V置换G88；用A，I，L，S，T，M或V置换G89；用F或Y置换W90；用N置换Q91；用K或R置换H92；用Q置换N93；用H或K置换R94；用D置换E95；用N置换Q96；用G，I，L，S，T，M或V置换A97；用Q置换N98；用A，G，I，S，T，M或V置换L99；用Q置换N100；用A，G，I，L，T，M或V置换S101；用H或K置换R102；用A，G，I，L，S，M或V置换T103；用D置换E104；用D置换E105；用A，G，I，L，S，M或V置换T106；用A，G，I，L，S，T，M或V置换107；用H置换K108；用W或Y置换F109；用G，I，L，S，T，M或V置换A110；用G，I，L，S，T，M或V置换A111；用G，I，L，S，T，M或V置换A112；用K或R置换H113；用F或W置换Y114；用Q置换N115；用A，G，I，L，S，M或V置换T116；用D置换E117；用A，G，L，S，T，M或V置换I118；用A，G，I，S，T，M或V置换L119；用H或R置换K120；用A，G，I，L，T，M或V置换S121；用A，G，L，S，T，M或V置换I122；用E置换D123；用Q置换N124；用D置换E125；用F或Y置换W126；用H或K置换R127；用H或R置换K128；用A，G，I，L，S，M或V置换T129；用N置换Q130；用A，G，I，L，S，T或V置换M132；用H或K置换R134；用D置换E135；用A，G，I，L，S，T或M置换V136；用A，G，L，S，T，M或V置换I138；用E置换D139；用A，G，I，S，T或M置换V140；用A，I，L，S，T，M或V置换G141；用H或R置换K142；用D置换E143；用W或Y置换F144；用A，I，L，S，T，M或V置换G145；用A，G，I，L，S，T或M置换V146；用G，I，L，S，T，M或V置换A147；用A，G，I，L，S，M或V置换T148；用Q置换N149；用A，G，I，L，S，M或V置换T150；用W或Y置换F151；用W或Y置换F152；用H或R置换K153；用A，G，I，L，S，T或M置换V157；用A，G，I，L，T，M或V置换S158；用A，G，I，L，S，T或M置换V159；用F或W置换Y160；用H或K置换R161；用A，I，L，S，T，M或V置换G163；用A，I，L，S，T，M或V置换G164；用Q置换N167；用A，G，I，L，T，M或V置换S168；用D置换E169；用A，I，L，S，T，M或V置换G170；用A，G，I，S，T，M或V置换L171；用N置换Q172；用A，G，I，L，S，T或V置换M174；用Q置换N175；用A，G，I，L，S，M或V置换T176；用A，G，I，L，T，M或V置换S177；用A，G，I，L，S，M或V置换T178；用A，G，I，L，T，M或V置换S179；用F或W置换Y180；用A，G，I，S，T，M或V置换L181；用A，G，I，L，T，M或V置换S182；用H或R置换K183；用A，G，I，L，S，M或V置换T184；用A，G，I，S，T，M或V置换L185；用W或Y置换F186；用D置换E187；用A，G，L，S，T，M或V置换I188；用A，G，I，L，S，M或V置换T189；用A，G，I，L，S，T或M置换V190；用A，G，I，S，T，M或V置换L192；用A，G，I，L，T，M或V置换S193；用N置换Q194；用A，I，L，S，T，M或V置换G195；用H或R置换K197；用A，G，I，L，S，T或M置换V199；用A，G，I，L，S，M或V置换T200；用A，G，L，S，T，M或V置换I201；用A，G，I，L，T，M或V置换S202；用W或Y置换F203；用G，I，L，S，T，M或V置换A204；用Q置换N205；用K或R置换H206；用A，G，I，L，S，M或V置换T207；用A，G，I，L，T，M或V置换S208；用H或K置换R210；用A，G，I，L，S，T或V置换M212；用A，G，I，L，T，M或V置换S213；用H或R置换K214；用A，G，I，S，T，M或V置换L215；用E置换D216；用A，G，I，L，S，T或M置换V217；用F或W置换Y218；用H或K置换R219；用N置换Q220；用A，G，I，L，S，T，或M置换V221；用K或R置换H222；用A，G，I，L，T，M或V置换S223；用A，G，L，S，T，M或V置换I224；用A，G，L，S，T，M或V置换I225；用H或K置换R226；用H或K置换R227；用A，G，I，L，T，M或V置换S228；用A，G，I，S，T，M或V置换L229；用G，I，L，S，T，M或V置换A231；用A，G，I，L，S，M或V置换T232；用A，G，I，S，T，M或V置换L233；用N置换Q235；用N置换Q237；用G，I，L，S，T，M或V置换A238；用G，I，L，S，T，M或V置换A239；用Q置换N240；用H或R置换K241；用A，G，I，L，S，M或V置换T242；用A，G，I，L，S，M或V置换T245；用Q置换N246；用F或W置换Y247；用A，G，I，L，S，T或V置换M248；用F或Y置换W249；用Q置换N250；用Q置换N251；用K或R置换H252；用A，G，L，S，T，M或V置换I253；用H或K置换R255；用A，G，L，S，T，M或V置换L257；用G，I，L，S，T，M或V置换A258；用N置换Q259；用D置换E260；用E置换D261；用W或Y置换F262；用A，G，I，L，S，T或V置换M263；用W或Y置换F264；用A，G，I，L，S，T或V置换S265；用A，G，I，L，T，M或V置换S266；用E置换D267；用G，I，L，S，T，M或V置换A268；用A，I，L，S，T，M或V置换G269；用E置换D270；用E置换D271；用A，G，I，L，T，M或V置换S272；用A，G，I，L，S，M或V置换T273；用E置换D274；用A，I，L，S，T，M或V置换T275；用W或Y置换F276；用K或R置换H277；用E置换D278；用A，G，L，S，T，M或V置换T279；用A，I，L，S，T，M，或V置换G281；用Q置换N283；用H或R置换K284；用D置换E285；用A，G，I，S，M，T或V置换L286；用E置换D287；用D置换E288；用D置换E289；用A，G，I，L，S，M或V置换T290；用N置换Q292；用A，G，I，L，S，T或M置换V294；用H或K置换R296；用G，I，L，S，T，M或V置换A297；用A，I，L，S，T，M或V置换G298；用A，G，I，S，T，M或V置换L299；用H或K置换R300；用G，I，L，S，T，M或V置换A302；用A，G，I，L，T，M或V置换S303；用A，I，L，S，T，M或V置换G305；用K或R置换H307；用H或R置换K308；用D置换E309；用A，G，I，S，T，M或V置换L310；用E置换D311；用H或K置换R312；用Q置换N313；用A，G，I，L，T，M或V置换S314；用N置换Q316；用A，G，I，L，S，T或M置换V318；用H或R置换K320；用Q置换N321；用H或R置换K322；用A，G，I，S，T，M或V置换L323；用W或Y置换F324；用A，G，I，L，T，M或V置换S326；用N置换Q327；用A，I，L，S，T，M或V置换G329；用G，I，L，S，T，M或V置换A330；用Q置换N331；用H或K置换R332；用D置换E333；用W或Y置换F334；用E置换D335；用D置换E336；用Q置换N337；用A，G，I，L，S，M或V置换T338；用N置换Q340；用A，G，I，L，S，T或M置换V342；用H或R置换K344；用H或K置换R345；用A，G，I，L，S，M或V置换T346；用H或K置换R349；用Q置换N350；用N置换Q351；用A，G，I，S，T，M或VL置换L353；用Q置换N354；用A，I，L，S，T，M或V置换G356；用H或R置换K357；用G，I，L，S，T，M或V置换A359；用D置换E361；用A，G，I，L，S，M或V置换T363；用D置换E364；用A，G，I，L，T，M或V置换S365；用N置换Q367；用H或R置换K368；用A，G，I，S，T，M或V置换L370；用A，G，I，S，T，M或V置换L371；用H或R置换K372；用A，I，L，S，T，M或V置换G373；用H或R置换K374；用H或R置换K375；用W或Y置换F376；用K或R置换H377；用K或R置换H378；用N置换Q379；用A，G，I，L，S，M或V置换T380；用A，G，I，L，T，M或V置换S382；用F或W置换Y384；用H或K置换R385；用H或K置换R386；用A，G，I，L，S，M或V置换T389；用Q置换N390；用H或K置换R391；用N置换Q392；用H或R置换K393；用G，I，L，S，T，M或V置换A394；用D置换E396；用A，I，L，S，T，M或V置G398；用W或Y置换F399；用A，G，I，L，T，M或V置换S400；用F或W置换Y401；用A，G，I，L，T，M或V置换S402；用D置换E403；用D置换E404；用A，G，I，L，S，T或M置换V405；用H或K置换R407；用A，G，I，L，S，T或M置换409；用A，G，I，L，T，M或V置换S411；用F或W置换Y412；用F或Y置换W413；用N置换Q414；用H或K置换R415；用N置换Q417；用A，G，I，L，S，T或V置换M418；和/或用A，G，I，L，T，M或V置换S419。
所得构建体可通过常规筛选本发明说明书所述的及本领域已知的活性或功能。优选地，所得构建体的一种VEGF-2活性或功能提高和/或降低，而剩余VEGF-2活性或功能仍保留。更优选地，所得构建体有一种以上VEGF-2活性或功能提高或降低，而剩余VEGF-2活性或功能仍保留。
除了保守氨基酸取代，VEGF-2的变体包括(i)具有一或多个非保守氨基酸残基的取代，其中取代的氨基酸残基可以或不是由遗传密码编码的；或(ii)具有一或多个含有取代基团的氨基酸残基的取代；或(iii)成熟多肽与另外化合物融合，如提高多肽稳定性和/或可溶性的化合物(例如聚乙烯乙二醇)；或(iv)多肽与另外氨基酸的融合，如IgGFc融合肽，或前导或分泌序列，或促进纯化的序列。这种变体多肽根据本文教导包括在本领域技术人员知识范围内。
例如，含有用其它极性或中性氨基酸取代极性氨基酸的氨基酸取代的VEGF-2多肽变体，可产生具有改良特征的蛋白质，如低聚集性。由于聚集体的免疫原活性，药物配方的聚集会降低活性并提高清除率(Pinckard等，免疫学临床实验2331-340(1967))；Robbins等，糖尿病36838-845(1987))；Cleland等，治疗性药物载体系统综述10307-377(1993))。
例如，优选的VEGF-2的非保守取代包括用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M1；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H2；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S3；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L4；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G5；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F6；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F7；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S8；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V9；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A10；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C11；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换C12；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L13；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L14；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A15；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A16；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A17；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L18；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L19；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P20；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G21；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P22；用D，E，A，G，I，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R23；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E24；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，D或C置换A25；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P26；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A27；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A28；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A29；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A30；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A31；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F32；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E33；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S34；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G35；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L36；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D37；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L38；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S39；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D40；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换E41；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E42；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P43；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D44；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A45；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G46；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E47；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A48；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T49；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A50；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y51；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A52；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S53；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K54；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D55；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L56；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E57；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E58；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q59；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L60；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R61；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S62；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V63；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S64；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S65；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V66；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D67；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E68；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L69；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M70；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T71；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V72；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L73；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y74；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C置换P75；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E76；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y77；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W78；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K79；用D，E，H，E，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M80；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y81；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K82；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P置换C83；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q84；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换L85；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R86；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换K87；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G88；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G89；用D，E，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换W90；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q91；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C，置换H92；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C，置换N93；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C，置换R94；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C，置换F95；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C，置换Q96；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C，置换A97；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N98；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L99；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N100；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S101；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R102；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T103；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E104；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E105；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T106；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I107；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K108；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F109；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A110；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A111；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A112；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H113；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y114；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N115；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T116；用H，K，R，N，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E117；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I118；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L119；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K120；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S121；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C换I122；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D123；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N124；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E125；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换W126；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R127；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K128；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T129；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q130；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C131；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M132；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P133；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R134；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E135；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V136；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C137；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I138；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D139；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V140；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G141；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K142；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E143；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F144；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G145；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V146；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A147；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T148；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N149；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T150；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F151；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F152；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K153；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P154；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P155；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C156；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V157；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S158；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V159；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y160；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R161；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C162；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G163；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G164；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C165；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C166；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N167；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S168；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E169；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G170；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L171；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q172；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C173；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M174；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N175；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T176；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S177；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T178；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S179；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y180；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L181；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S182；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K183；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T184；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L185；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F186；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E187；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I188；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T189；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V190；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P191；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L192；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S193；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q194；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G195；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P196；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K197；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P198；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V199；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T200；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I201；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S202；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F203；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换A204；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N205；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换N205；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H206；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T207；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S208；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C209；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R210；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C211；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M212；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S213；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K214；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L215；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D216；用D，E，H，K，R，N，QF，W，Y，P，或C置换V217；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y218；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R219；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q220；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V221；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H222；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S223；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I224；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I225；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R226；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R227；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S228；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L229；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换P230；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A231；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T232；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L233；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换P234；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q235；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C236；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q237；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A238；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A239；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N240；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K241；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，或P，置换T242；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换T243；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P244；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T245；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N246；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y247；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M248；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换W249；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N250；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N251；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H252；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I253；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C254；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R255；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C256；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L257；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A258；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q259；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E260；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D261；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F262；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M263；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F264；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S265；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S266；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D267；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A268；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换G269；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D270；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D271；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换S272；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T273；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D274；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G275；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F276；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H277；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D278；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，或C置换I279；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C280；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G281；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P282；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N283；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K284；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E285；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L286；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D287；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E288；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E289；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T290；用D，E，H，K，R，N，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C291；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q292；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C293；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V294；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C295；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R296；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A297；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G298；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L299；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R300；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P301；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A302；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，或C置换S303；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C304；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G305；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P306；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H307；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K308；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E309；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L310；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D311；用D，E，，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R312；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N313；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S314；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换C315；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换Q316；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C317；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V318；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C319；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K320；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N321；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K322；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L323；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F324；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换P325；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S326；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q327；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换Q328；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G329；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A330；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N331；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，，F，W，Y，P，或C置换R332；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E333；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F334；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换D335；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E336；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N337；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T338；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C339；用D，E，H，K，R，A，