专利名称：一种提高泰乐菌素组分a转化率的方法泰乐菌素是由弗氏链霉菌经发酵提取而得到的一种大环内酯类抗生素，有泰乐菌素碱、磷酸盐和酒石酸盐三种形态。泰乐菌素是一种禽、畜专用的高效、无残留抗菌促生剂。对鸡败血症、猪流行性肺炎等疾病有独特的疗效，且对禽、畜的生长具有明显的促进作用。泰乐菌素作为动物专用抗生素，避免了人畜共用抗生素易产生交叉耐药性的问题，用于防治猪、禽支原体病。 在泰乐菌素发酵生产过程中影响泰乐菌素A生物转化的关键因素是泰乐菌素生物合成的最后一步限速反应大菌素(C) +盐酸甜菜碱(甲基供体作)-油歷纖隻廢— 泰乐菌素(A)，在该过程中，大菌素甲基转移酶属于胞内酶，其活性易受到发酵产物及产物类似物的反馈抑制。泰乐菌素发酵周期中，发酵前期大菌素甲基转移酶活力较强，酶反应抑制剂没有或较少(泰乐菌素及其他泰乐菌素类似物等)，所以绝大部分大菌素C能够迅速合成泰乐菌素A，菌体以产组分A为主，随着发酵时间的延长，酶反应抑制剂逐渐增多，酶活力降低，部分大菌素C不能被甲基化，此时菌体以产组分C为主。目前，工业生产泰乐菌素的发酵工艺控制仍然是针对发酵过程中的PH值、温度、罐压等等，其发酵水平为10000 12000u/ml,泰乐菌素A组分为80 85%。组分转化过程中存在一定的困难,当前针对泰乐菌素转化困难的相关文献或专利至今尚未见报道。
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高泰乐菌素A组分转化率的方法。为实现本发明目的所采取的技术方案为一种提高泰乐菌素A转化率的方法，该方法是以弗氏链霉菌为产生菌，经一级种子罐发酵培养、二级种子罐发酵培养和发酵罐发酵培养发酵生产泰乐菌素，其特征是在发酵罐发酵培养结束对数生长期进入稳定期时，向发酵培养基中添加质量浓度为0. 5 2.5%的非离子型表面活性剂。所述的非离子型表面活性剂为聚氧乙烯型非离子表面活性剂、多元醇型非离子型表面活性剂和烷基醇酰胺型非离子型表面活性剂。所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂为烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、聚乙二醇或聚氧乙烯胺。所述多元醇型非离子型表面活性剂为失水山梨醇酯、吐温、司盘或蔗糖酯。所述烷基醇酰胺型非离子型表面活性剂为十二烷基二乙醇酰胺或烷基醇酰胺磷酸酯。所述在发酵罐发酵培养结束对数生长期进入稳定期是指发酵罐发酵培养40小时后。本发明通过在发酵培养至稳定期时向培养基中添加非离子型表面活性剂来增强菌丝体细胞膜通透性，从而促使细胞内的代谢物迅速释放到细胞外，进而解除了大菌素甲基转移酶的反馈抑制，提高了该酶的活力，最终促使泰乐菌素组分C向组分A的快速转化。当前工业生产中泰乐菌素A组分普遍为80 85%。通过本发明能够最终使泰乐菌素A组分含量达到90 94%。

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。实施例II)发酵菌株的选择弗氏链霉菌(Strepyomyce fradiae)。2) Im3 一级种子发酵罐培养基为豆饼粉10kg、盐酸甜菜碱0. 5kg、玉米浆3kg、磷酸氢二铵0. 2kg、碳酸钙I. 6kg、豆油13L。3) IOm3 二级种子发酵罐培养基为豆饼粉150kg、盐酸甜菜碱5kg、磷酸氢二铵2kg、碳酸|丐15kg、混合鱼粉80kg、玉米衆30kg、豆油100L。4) IOOm3发酵罐发酵培养基为豆油2000L、豆饼粉1500kg、混合鱼粉700kg、磷酸氢二铵30kg、碳酸韩200kg、盐酸甜菜碱70kg、氯化钴500g、氯化钾50kg、氯化钠100kg、硫酸镁80kg。具体发酵工艺步骤如下I) 一级种子罐发酵培养采用火焰接种法，将培养成熟的弗氏链霉菌种子液接入一级种子罐中进行培养，罐压0. 03MPa ;罐温28 29°C;空气流量0 20h 55m3/h ；20h 移种100/h ;搅拌转速80r/min ；pH值6. 5 6. 8 ;培养时间20h。2) 二级种子罐发酵培养将一级种子罐中发酵液全部移入二级种子罐进行培养；罐压0. 03 0. 05MPa ;罐温28 29°C ;空气流量800m3/h ;搅拌转速120r/min ;pH 6 7 ;h培养时间30h ；3)三级发酵罐发酵培养将二级种子罐发酵液全部移入发酵罐进行培养。培养条件为a发酵开始 40h :培养温度28 29°C、搅拌转速200r/min。b在发酵培养40h时，向发酵培养基中添加质量浓度为0. 5%的聚氧乙烯型非离子表面活性剂如烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯或者聚氧乙烯胺。c40h 结束温度 28 29°C、转速 260r/min。d 罐压 0. 04 0. 05MPa。f发酵过程中pH6. 0 6. 5。g 空气流量0h 40h 1600m3/h ；40h 发酵结束1500m3/h。i发酵结束，培养时间144h。
发酵培养6天后，取发酵滤液Iml加甲醇1ml、蒸馏水8ml，混匀，用0. 45ul滤膜过滤。以2mol/L高氯酸钠溶液(用lmol/L盐酸溶液调节pH值至2. 5±0. I)-乙腈(60 40)为流动相；检测波长为280nm，检测泰乐菌素组分A的含量为91%。实施例2I)发酵菌株的选择弗氏链霉菌(Strepyomyce fradiae)。2) Im3 一级种子发酵罐培养基为豆饼粉10kg、盐酸甜菜碱0. 5kg、玉米浆3kg、磷酸氢二铵0. 2kg、碳酸钙I. 6kg、豆油13L。3) IOm3 二级种子发酵罐培养基为豆饼粉150kg、盐酸甜菜碱5kg、磷酸氢二铵2kg、碳酸|丐15kg、混合鱼粉80kg、玉米衆30kg、豆油100L。4) IOOm3发酵罐发酵培养基为豆油2300L、豆饼粉1600kg、混合鱼粉750kg、磷酸氢二铵35kg、碳酸韩230kg、盐酸甜菜碱80kg、氯化钴550g、氯化钾55kg、氯化钠120kg、硫酸镁85kg。具体发酵工艺步骤如下I) 一级种子罐发酵培养采用火焰接种法，将培养成熟的弗氏链霉菌种子液接入一级种子罐中进行培养，罐压0. 04MPa ;罐温28 29°C;空气流量0 20h 55m3/h ；20h 移种100/h ;搅拌转速80r/min ；pH值6. 5 6. 8 ;培养时间20h。2) 二级种子罐发酵培养将一级种子罐中发酵液全部移入二级种子罐进行培养；罐压0. 03 0. 05MPa ;罐温28 29°C ;空气流量800m3/h ;搅拌转速120r/min ;pH 6 7 ; h培养时间30h ；3)三级发酵罐发酵培养将二级种子罐发酵液全部移入发酵罐进行培养。培养条件为a发酵开始 40h :培养温度28 29°C、搅拌转速210r/min。b在发酵培养40h时，向发酵培养基中添加质量浓度为I. 0%的非离子表面活性剂聚乙二醇系列如PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800 或者 PEG-1000。c40h 结束温度 28 29°C、转速 270r/min。d 罐压 0. 04 0. 05MPa。f发酵过程中pH6. 0 6. 5。g 空气流量0h 40h 1600m3/h ；40h 发酵结束1500m3/h。i发酵结束,培养时间144h。发酵培养6天后，取发酵滤液Iml加甲醇1ml、蒸馏水8ml，混匀，用0. 45ul滤膜过滤。以2mol/L高氯酸钠溶液(用lmol/L盐酸溶液调节pH值至2. 5±0. I)-乙腈(60 40)为流动相；检测波长为280nm，检测泰乐菌素组分A的含量为93%。实施例3I)发酵菌株的选择弗氏链霉菌(Strepyomyce fradiae)。2) Im3 一级种子发酵罐培养基为豆饼粉10kg、盐酸甜菜碱0. 5kg、玉米浆3kg、磷酸氢二铵0. 2kg、碳酸钙I. 6kg、豆油13L。3) IOm3 二级种子发酵罐培养基为豆饼粉150kg、盐酸甜菜碱50kg、磷酸氢二铵20kg、碳酸|丐15kg、混合鱼粉80kg、玉米衆30kg、豆油100L。4) IOOm3发酵罐发酵培养基为豆油2500L、豆饼粉1700kg、混合鱼粉800kg、磷酸氢二铵30kg、碳酸韩250kg、盐酸甜菜碱80kg、氯化钴600g、氯化钾70kg、氯化钠130kg、硫酸镁90kg。具体发酵工艺步骤如下I) 一级种子罐发酵培养采用火焰接种法，将培养成熟的弗氏链霉菌种子液接入一级种子罐中进行培养，罐压0. 03MPa ;罐温28 29°C;空气流量0 20h 55m3/h ；20h 移种100/h ;搅拌转速80r/min ；pH值6. 5 6. 8 ;培养时间20h。2) 二级种子罐发酵培养将一级种子罐中发酵液全部移入二级种子罐进行培养；罐压0. 03 0. 05MPa ;罐温28 29°C ;空气流量800m3/h ;搅拌转速120r/min ;pH 6 7 ;h培养时间30h。3)三级发酵培养先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压(压力0.01
0.02MPa)，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。培养条件为a发酵开始 40h :培养温度28 29°C、搅拌转速210r/min。b在发酵培养40h时，向发酵培养基中添加质量浓度为I. 5%的多元醇型非离子型表面活性剂如失水山梨醇酯、司盘或者蔗糖酯。c40h 结束温度 28 29°C、转速 280r/min。d 罐压 0. 05 0. 06MPa。f发酵过程中pH6. 2 6. 5。g 空气流量0h 40h 1700m3/h ；40h 发酵结束1500m3/h。i发酵结束,培养时间144h。发酵培养6天后，取发酵滤液Iml加甲醇1ml、蒸馏水8ml，混匀，用0. 45ul滤膜过滤。以2mol/L高氯酸钠溶液(用lmol/L盐酸溶液调节pH值至2. 5±0. I)-乙腈(60 40)为流动相；检测波长为280nm，检测泰乐菌素组分A的含量为94%。实施例4I)发酵菌株的选择弗氏链霉菌(Strepyomyce fradiae)。2) Im3 一级种子发酵罐培养基为豆饼粉10kg、盐酸甜菜碱0. 5kg、玉米浆3kg、磷酸氢二铵0. 2kg、碳酸钙I. 6kg、豆油13L。3) IOm3 二级种子发酵罐培养基为豆饼粉150kg、盐酸甜菜碱50kg、磷酸氢二铵20kg、碳酸|丐15kg、混合鱼粉80kg、玉米衆30kg、豆油100L。4) IOOm3发酵罐发酵培养基为豆油2650L、豆饼粉1680kg、混合鱼粉800kg、磷酸氢二铵30kg、碳酸韩250kg、盐酸甜菜碱80kg、氯化钴600g、氯化钾70kg、氯化钠130kg、硫酸镁90kg。具体发酵工艺步骤如下I) 一级种子罐发酵培养采用火焰接种法，将培养成熟的弗氏链霉菌种子液接入一级种子罐中进行培养，罐压0. 03MPa ;罐温28 29°C;空气流量0 20h 55m3/h ；20h 移种100/h ;搅拌转速80r/min ；pH值6. 5 6. 8 ;培养时间20h。2) 二级种子罐发酵培养将一级种子罐中发酵液全部移入二级种子罐进行培养；罐压0. 03 0. 05MPa ;罐温28 29°C ;空气流量800m3/h ;搅拌转速120r/min ;pH 6 7 ;h培养时间30h。
3)三级发酵培养先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压(压力0.01
0.02MPa)，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。培养条件为a发酵开始 40h :培养温度28 29°C、搅拌转速210r/min。b在发酵培养40h时，向发酵培养基中添加质量浓度为I. 5%的非离子型表面活性剂吐温系列，如吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80或者吐温-85。c40h 结束温度 28 29°C、转速 280r/min。d 罐压 0. 05 0. 06MPa。
f发酵过程中pH6. 2 6. 5。g 空气流量0h 40h 1700m3/h ；40h 发酵结束1500m3/h。i发酵结束,培养时间144h。发酵培养6天后，取发酵滤液Iml加甲醇1ml、蒸馏水8ml，混匀，用0. 45ul滤膜过滤。以2mol/L高氯酸钠溶液(用lmol/L盐酸溶液调节pH值至2. 5±0. I)-乙腈(60 40)为流动相；检测波长为280nm，检测泰乐菌素组分A的含量为94%。实施例5I)发酵菌株的选择弗氏链霉菌(Strepyomyce fradiae)。2) Im3 一级种子发酵罐培养基为豆饼粉10kg、盐酸甜菜碱0. 5kg、玉米浆3kg、磷酸氢二铵0. 2kg、碳酸钙I. 6kg、豆油13L。3) IOm3 二级种子发酵罐培养基为豆饼粉150kg、盐酸甜菜碱50kg、磷酸氢二铵20kg、碳酸I丐150kg、混合鱼粉80kg、玉米衆30kg、豆油100L。4) IOOm3发酵罐发酵培养基为豆油2800L、豆饼粉1700kg、混合鱼粉800kg、磷酸氢二铵30kg、碳酸韩250kg、盐酸甜菜碱80kg、氯化钴600g、氯化钾70kg、氯化钠130kg、硫酸镁90kg。具体发酵工艺步骤如下I) 一级种子罐发酵培养采用火焰接种法，将培养成熟的弗氏链霉菌种子液接入一级种子罐中进行培养，罐压0. 03MPa ;罐温28 29°C;空气流量0 20h 55m3/h ；20h 移种100/h ;搅拌转速80r/min ；pH值6. 5 6. 8 ;培养时间20h。2) 二级种子罐发酵培养将一级种子罐中发酵液全部移入二级种子罐进行培养；罐压0. 03 0. 05MPa ;罐温28 29°C ;空气流量800m3/h ;搅拌转速120r/min ;pH 6 7 ;h培养时间30h。3)三级发酵培养先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压(压力0.01
0.02MPa)，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。培养条件为a发酵开始 40h :培养温度28 29°C、搅拌转速220r/min。b在发酵培养40h时，向发酵培养基中添加质量浓度为2. 5%的烷基醇酰胺型非离子型表面活性剂如十二烷基二乙醇酰胺或者烷基醇酰胺磷酸酯。c40h 结束温度 28 29°C、转速 300r/min。d 罐压 0. 04 0. 06MPa。f发酵过程中pH6. 4 6. 5。
g 空气流量0h 40h 1800m3/h ；40h 发酵结束1600m3/h。i发酵结束,培养时间168h。发酵培养7天后，取发酵滤液Iml加甲醇1ml、蒸馏水8ml，混匀，用0. 45ul滤膜过滤。以2mol/L高氯酸钠溶液(用lmol/L盐酸溶液调节pH值至2. 5±0. I)-乙腈(60 40)为流动相；检测波长为280nm，检测泰乐菌素组分A的含量为93%。实施例6对比实例发酵工艺中没有添加非离子型表面活性剂，此发酵工艺也是当前工业生产中普遍使用的工艺。I)发酵菌株的选择弗氏链霉菌(Strepyomyce fradiae)。
2) Im3 一级种子发酵罐培养基为豆饼粉10kg、盐酸甜菜碱0. 5kg、玉米浆3kg、磷酸氢二铵0. 2kg、碳酸钙I. 6kg、豆油13L。3) IOm3 二级种子发酵罐培养基为豆饼粉150kg、盐酸甜菜碱50kg、磷酸氢二铵20kg、碳酸I丐150kg、混合鱼粉80kg、玉米衆30kg、豆油100L。4) IOOm3发酵罐发酵培养基为豆油2500L、豆饼粉1700kg、混合鱼粉800kg、磷酸氢二铵30kg、碳酸韩250kg、盐酸甜菜碱80kg、氯化钴600g、氯化钾70kg、氯化钠130kg、硫酸镁90kg。具体发酵工艺步骤如下I) 一级种子罐发酵培养采用火焰接种法，将培养成熟的弗氏链霉菌种子液接入一级种子罐中进行培养，罐压0. 03MPa ;罐温28 29°C;空气流量0 20h 55m3/h ；20h 移种100/h ;搅拌转速80r/min ；pH值6. 5 6. 8 ;培养时间20h。2) 二级种子罐发酵培养将一级种子罐中发酵液全部移入二级种子罐进行培养；罐压0. 03 0. 05MPa ;罐温28 29°C ;空气流量800m3/h ;搅拌转速120r/min ;pH 6 7 ;h培养时间30h。3)三级发酵培养先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压(压力0.01 0. 02MPa)，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。培养条件为a发酵开始 120h :培养温度29°C、搅拌转速210r/min。cl20h 结束(组分转化):温度36. 5 37°C、转速260r/min。d 罐压 0.06MPa。f发酵过程中pH6. 5 6. 7。g空气流量0h 120h 1735m3/h ；120h 发酵结束(组分转化)1568mVh0h发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌。i发酵结束,培养时间158h。发酵培养结束后，取发酵滤液Iml加甲醇1ml、蒸馏水8ml，混匀，用0. 45ul滤膜过滤。以2mol/L高氯酸钠溶液(用lmol/L盐酸溶液调节pH值至2. 5±0. I)-乙腈(60 40)为流动相；检测波长为280nm，检测泰乐菌素组分A的含量为84%。


本发明涉及一种提高泰乐菌素A转化率的方法，该方法是以弗氏链霉菌为产生菌，经一级种子罐发酵培养、二级种子罐发酵培养和发酵罐发酵培养发酵生产泰乐菌素，其特征是在发酵罐发酵培养结束对数生长期进入稳定期时，向发酵培养基中添加质量浓度为0.5～2.5%的非离子型表面活性剂。本发明通过在发酵培养至稳定期时向培养基中添加非离子型表面活性剂来增强菌丝体细胞膜通透性，从而促使细胞内的代谢物迅速释放到细胞外，进而解除了大菌素甲基转移酶的反馈抑制，提高了该酶的活力，最终促使泰乐菌素组分C向组分A的快速转化。当前工业生产中泰乐菌素A组分普遍为80～85%。通过本发明能够最终使泰乐菌素A组分含量达到90～94%。