专利名称：多黏菌素E₁组合物及其制备方法和用途的制作方法多黏菌素E(Colistin)是一个由多种组份组成的多肽类抗生素，主要由E1和E2组成(或称为A或B)。在20世纪50年代，多黏菌素E就应用于临床，主要用于革兰氏阴性菌引起的感染，特别是由多重耐药绿脓杆菌(P. aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(AcinetcAacter baumannii)等引起感染的治疗。临床使用的多黏菌素E有两种，一种是口服或局部使用的硫酸多黏菌素E(也称硫酸黏菌素)，另一种是供注射用的多黏菌素E甲磺酸钠 (ColistimethateSodium)。这两种药物都是多组份药物，在硫酸多黏菌素E中，含有包括 E1, E2, E3等至少5种组份(参见欧洲药典5. 0)，同样在多黏菌素E甲磺酸钠也至少含有多黏菌素E1甲磺酸钠和多黏菌素氏甲磺酸钠等5种组份。自上世纪80年代开始因高发的肾脏毒性和神经毒性，多黏菌素E(Colistin)的应用受到限制，并几乎被临床弃用。但是近年来，由于革兰氏阴性菌耐药株尤其是多耐药菌株感染病例的出现以及新药开发有限的情况下多黏菌素E(Colistin)再次引起了全球医疗界的重视。同样如何提高多黏菌素E(Colistin)的抗菌活性、降低其毒性从而扩大临床适用人群也成为了药学研究者所面临的技术难点。多黏菌素E的结构通式见式IOV- L-DAB L-Thr L-DAB L-DAB 一 L-DAB 今 X L-Leu 〈R3L-Thr - L-DAB - L-DAB ^SVr2I R1DAB=2，4-二氨基丁酸式I多粘菌素EX■ RlR2R3分子式分子量E1D-LeuCH3CH3Hc53t ΟθΝι Ο 31170E2D-LeuCH3HHC52I1155E3D-LeuHCH3HC52I^98Νι60 31155Ei-ID-IleCH3CH3Hc53tΙ ΟθΝ Ο 31170El-7M0AD-LeuHCH3CH3C53^IiooNuOn1170 众所周知多组份药物制剂的稳定性较难控制，特别是对于注射剂而言多组分药物的理化稳定性、渗透压、澄明度、酸碱度等方面因易受组分间相互作用，不容易形成稳定的药物制剂，并且由于储存、温度、光照等因素多组份药物制剂更容易出现变色、沉淀、分解等变化。此外，多组分药物的有效性和潜在的安全性也存在一定的缺陷。另外，多组份药物由于组份间的化学结构差异会导致它们在体内的药代动力学行为的差异，增加了药代动力学研究的难度，从而对设计安全的药物剂量以及合理的给药方式带来技术障碍。因此，发明一种含有单一组份的多黏菌素E或者其衍生物的药物组合物是非常必要的。当前，对多黏菌素E的组份分析已有成熟的、法定的分析方法，如美国药典和欧洲药典都收录有HPLC法测定多黏菌素E。不过遗憾的是，尽管多黏菌素E甲磺酸钠也被这些药典所收录，但是却没有相应HPLC法来分析该产品中各组份的组成，仅仅是用硅钨酸显色法来控制多黏菌素E甲磺酸钠中不含有多黏菌素E。Li Jian等报道了使用强碱阴离子交换HPLC分析多黏菌素E甲磺酸钠(参见Li J, Milne Rff, Nation RL,et al.Stability of Colistin and ColistinMethanesulfonate in Aqueous Media and Plasma as Determined byHigh-Performance Liquid Chromatography. ANTIMICROBIAL AGENTS ANDCHEMOTHERAPY ；2003,47 (4) : 1364-1370.)。虽然使用这种方法也分出7个色谱峰，但是并不能表征出这7个色谱峰分别是何种组份。同时，他们也报道了在水、磷酸盐溶液或者血浆中多黏菌素E甲磺酸钠能转化为多黏菌素E， 但是并不能完全转化，用了 72小时最高也只转化了 79.6%。Li Jian等也报道使用硫酸酸水解的方法把大鼠血浆中的多黏菌素E甲磺酸钠转化为多黏菌素E，再反相HPLC法测定多黏菌素E的组成。(参见Li J，MilneRff, Nation RL, et al. Simple Method for Assaying Colistin Methanesulfonatein Plasma and Urine Using High-Performance Liquid Chromatography. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY ；2002, 46 (10) :3304-3307.)这种方法仅局限在较低浓度的多黏菌素E甲磺酸钠(0.025mg/ml)并需要有血浆的存在才能转化，而且也没有证明能完全转化为多黏菌E ο
本发明的目的在于提供一种多黏菌素E1组合物，该组合物中多黏菌素E1的含量大于等于80 %，优选大于等于90 %，更优选大于等于95 %。该组合物中除了多黏菌素E1之外，还含有少量的其它多粘菌素E，例如多黏菌素E2、多黏菌素&等。其中多黏菌素E1优选为硫酸多粘菌素E1或多粘菌素E1甲磺酸钠。如无特别说明，本发明中所述多黏菌素E1是指多粘菌素E1或其衍生物，例如硫酸多粘菌素E1或多粘菌素E1甲磺酸钠。本发明中所述多黏菌素E1组合物主要含有多粘菌素 E1,也包括E2, E3、Eh和Ewmoa等其它成分。本发明的另一个目的在于提供了多黏菌素E1组合物在制备治疗革兰氏阴性菌感染药物中的用途。所述的革兰氏阴性菌优选绿脓杆菌(P. aeruginosa)和鲍氏不动杆菌 (Acinetobacter baumannii)。本发明的再一个目的在于提供多黏菌素仏组合物的制备方法，该方法低污染、低能耗，工艺相对简单、重现性好、生产水平高。本发明提供的制备方法包括如下步骤(a)将硫酸多粘菌素E溶解，上样于反相层析介质；(b)用含有机溶剂的硫酸溶液洗脱，使用色谱分析，收集并合并含硫酸多粘菌素E1 的洗脱液；(C)取上步骤中合并的洗脱液，去除硫酸和/或有机溶剂；⑷干燥，即得硫酸多黏菌素EJi合物；(e)如需要，采用现有技术制备成多黏菌素E1甲磺酸钠或其它衍生物。一种优选的制备方法包括如下步骤(a)将原料硫酸多粘菌素E加水溶解，上样于已处理好的反相层析介质上；(b)用含有机溶剂的硫酸溶液，把不同成分的硫酸多黏菌素E 依次洗脱，使用色谱分析，收集并合并含硫酸多粘菌素E1的洗脱液；(c)取上步骤中合并的洗脱液，为去除硫酸和有机溶剂可以是先使用减压蒸馏去除有机溶剂后，再使用膜分离技术去除硫酸，也可以仅使用膜分离去除有机溶剂和硫酸，若仅为去除有机溶剂可以单独使用减压蒸馏；(d)使用常规干燥技术，如喷雾干燥和真空干燥等，把上步得到的硫酸多黏菌素&溶液干燥，即得到硫酸多黏菌素EJi合物；(e)如需要，采用现有技术制备成多黏菌素 E1甲磺酸钠或其它衍生物。本发明所提供的制备方法，其中步骤(a)中所说的“原料硫酸多粘菌素E”，是指工业级的硫酸多粘菌素E，也可以是质量符合欧洲药典(5.0)或美国药典09)所规定的硫酸多黏菌素E。硫酸多粘菌素E溶解后浓度可以为1-20%，优选为10-15%;步骤(a)中选用的反相层析介质可以为以二氧化硅(硅胶)或聚合物为骨架的反相层析介质，反相硅胶可由链长在C1-C3tl ((；丄8和C18最为常见)的直链烷烃基或其它疏水配基(如苯基或氰基)衍生而来，以聚合物为骨架的反相层析介质，通常指以聚苯乙烯/ 二乙烯苯或聚丙烯酸酯为骨架并键合苯基的反相层析介质；其中步骤(b)中使用的含有机溶剂的硫酸溶液是指以乙醇、甲醇或乙腈配制的硫酸溶液，优选用乙醇配制的硫酸溶液，有机溶剂的浓度一般在5-50%，优选15-30%。硫酸的浓度一般在0. 1-5 %，优选为0. 3-1 %，溶液的pH值控制在1. 0-5. 0，优选pH值控制在 2.0-3.0。洗脱方式可以是等度分段洗脱，也可以是梯度洗脱。该步骤中所述的色谱分析方法为欧洲药典(5.0)颁布的硫酸多黏菌素E分析方法。步骤(c)中膜分离技术使用的膜指纳滤膜，其截流分子量在200-1000，优选截流分子量在400-800的纳滤膜。本发明所使用的纳滤膜可以是有机材料膜，如有机纤维素膜、 聚砜膜和聚乙烯醇膜等，也可以是各种无机材料膜，如陶瓷膜、黏土膜和金属膜等，优选使用纤维素膜和聚砜膜。步骤(d)中所说的常规干燥技术为生化产品常用的干燥技术如喷雾干燥、真空干燥及低温冷冻干燥等。步骤(e)中所述的“现有技术”是指已经公开的由起始原料多黏菌素E硫酸盐制备多黏菌素E甲磺酸钠的所有公知技术。例如申请号为200810020478. 5的中国发明专利所公开的技术内容。通过生物效价测定发现本发明提供的多黏菌素E1组合物的生物活性均比其相对应的多组份生物活性高。由此本领域技术人员可以推断出当在临床上使用相同生物活性单位时，本发明提供的药物组合物其用量(用质量表示)必然减少，因此其毒性也将明显降低。本发明人通过实验也证实了这一推断。多黏菌素E1组合物在药代动力学的研究方面也具有突出的优势，为设计安全的药物剂量以及合理给药方式提供了有利条件。本发明所采用的生物效价测定方法为精密称取已在60°C减压干燥3小时的样品和标准品适量，标准品购置于美国药典委员会，批号H1D234，加灭菌水溶解并定量制成浓度约10mg/ml的溶液，然后用灭菌缓冲液[pH6. O的磷酸缓冲液(取磷酸氢二钾2. Og与磷酸二氢钾8. Og，加水溶解并定容至IOOOml)]混勻，用18mol/L的磷酸或者lOmol/L的氢氧化钾调节pH为6. 0士0. 05，滤过，115°C灭菌30分钟。稀释至lmg/ml，按照抗生素微生物检定法(中国药典2005年版二部附录XI A第一法)测定。试验菌为支气管炎博德特菌 (Bordetellabronchis印tica，ATCC4617)。生物效价单位以每毫克样品含有多少微克的多黏菌素E计算，表示为μ g/mg。


图1 硫酸多黏菌素E1HPLC分析结果；

上样量500ml收集100ml/管收集样品的分析及处理用分析型HPLC分析，合并纯度在90%以上的硫酸多黏菌素E1洗脱液，然后进行减压蒸馏除去乙醇后，真空干燥即得。结果得到M克硫酸多黏菌素E1组合物，其中硫酸多黏菌素E1的含量在90%以上。实施例3 硫酸多黏菌素E1组合物的制备称取工业级硫酸多黏菌素E适量，加水溶解，制成每Iml含120mg的溶液，上色谱柱分离，色谱条件如下层析填料聚苯乙烯/ 二乙烯苯为骨架并键合苯基，型号为NM-100，产自苏州纳微生物科技有限公司柱规格25X 2OOcm,柱体积(CV)98. 13L流速200. Oml/min洗脱条件先用含23%的乙醇硫酸稀溶液(用0. 05mol/L硫酸调溶液的pH值为 2. 3。)洗脱^CV,再用30%的乙醇硫酸稀溶液(用0. 05mol/L硫酸调溶液的pH值为2. 5。) 洗脱25CV。上样量IOOL检测波长215nm收集10L/管收集样品的分析及处理用分析型HPLC分析，合并纯度在80%以上的硫酸多黏菌素E1洗脱液，然后进行减压蒸馏除去乙醇后，纳滤膜过滤，去除部分硫酸，调整硫酸的含量占16-18%，即得。结果得到5. 8公斤硫酸多黏菌素E1组合物，其中硫酸多黏菌素E1的含量在80% 以上。实施例4 多黏菌素E1甲磺酸钠组合物的制备称取IOOg实施例3方法制备的硫酸多黏菌素E1，加水溶解并定容至500ml，然后加甲醛溶液50ml，搅拌并用lOmol/L NaOH溶液调节pH至7. 0，维持反应30min后，向其中加入40%的亚硫酸氢钠溶液200ml，然后再用NaOH溶液调节pH至7，并在搅拌下反应IOh后停止反应。取此反应液，用截流分子量为3000的超滤膜(为美国MILLIP0RE公司的产品，为醋酸纤维素膜)超滤至约50ml，然后加水至约500ml，再超滤浓缩至50ml，如此反复5次，得超滤截留液约50ml。在整个反应和超滤期间控制温度在20 25°C。取超滤截留液，用低温冷冻干燥法，进行样品的干燥，得到多黏菌素E1甲磺酸钠组合物63g，生物效价为590yg/ mg0称取多黏菌素E2甲磺酸钠适量，加水溶解，制成每Iml含5mg的溶液。取此溶液 5ml，用0. 5mol/L的硫酸溶液调节pH值为1. 5，然后加水稀释，并定容至10ml，制成2. 5mg/ ml的溶液。取此溶液于玻璃安瓿中，熔封后置于115°C烤箱中，放置30min，然后取出、放凉， 用HPLC法测定硫酸多黏菌素氏的含量，进而换算得到多黏菌素氏甲磺酸钠的含量为83%。实施例5 硫酸多黏菌素E1组合物的制备称取硫酸多黏菌素E适量，加水溶解，制成每Iml含IOOmg的溶液，上色谱柱分离，色谱条件如下色谱柱CWSunFire Prep OBD(IOym) ； 19X 150mm，购自美国 WATERS 公司柱体积(CV)42. 5ml流速10. Oml/min流动相含30%的乙醇硫酸稀溶液(用0. 05mol/L硫酸调溶液的pH值为2. 3。)上样量10ml检测波长215nm收集10ml/管收集样品的分析及处理用分析型HPLC分析，合并纯度在95%的以上多黏菌素E1 洗脱液，然后进行减压蒸馏除去乙醇后，低温冷冻干燥，即得。实施例6 多黏菌素E1甲磺酸钠制备称取1. Og硫酸多黏菌素E1 (多黏菌素E1的含量为83% )，加水溶解并定容至5ml， 然后加甲醛溶液0. 5ml，搅拌并用lmol/L NaOH溶液调节pH至7. 0，维持反应30min后，向其中加入40%的亚硫酸氢钠溶液anl，然后再用NaOH溶液调节pH至7，并在搅拌下反应IOh 后停止反应。取此反应液，用截流分子量为3000的超滤膜(为美国MILLIP0RE公司的产品， 为醋酸纤维素膜)超滤至约:3ml，然后加水至约20ml，再超滤浓缩至:3ml，如此反复5次，得超滤截留液约5ml。在整个反应和超滤期间控制温度在20 25°C。取超滤截留液，用低温冷冻干燥法，进行样品的干燥，得到多黏菌素E1甲磺酸钠样品0. Sg。实施例7 硫酸多粘菌素E1组合物与硫酸多粘菌素E对大鼠毒性的比较1.实验材料1. 1药品与试剂氯化钠注射液500ml :4. 5g，南京正大天晴制药有限公司，1003022 ；硫酸多粘菌素E1组合物采用实施例3方法制备。硫酸多粘菌素E (质量符合欧洲药典(5. 0))硫酸多粘菌素E1组合物、硫酸多粘菌素E 用生理盐水溶解和稀释，调节PH中性， 在制备后的30min内使用完。1. 2实验动物SD大鼠雄性，180-200g,上海必凯西普尔实验动物有限公司， SCXK (沪)2008-0016 ；1. 3实验仪器全自动生化分析仪欧霸XL-300 ；天平QE-400 ；2.实验方法选用180_220g雄性大鼠随机分成3组，每组6只对照组、硫酸多粘菌素仏组(SC 20mg/kgX2/d)、硫酸多粘菌素E组(SC 20mg/kgX2/d)。按10mg/ml皮下给药，一日两次， 连续2天，对照组给予生理盐水。取血，收集尿液，测定生化及尿蛋白含量。麻醉处死后取肾，常规固定后作病理检查，组织学形态按照下列方案进行评分O分无可见异常。1分近端曲小管囊下近端部分的刷状缘有最低程度的损害。2分近端曲小管近端部分的刷状缘和细胞有明显的损害。一些远端曲小管有早期的退化。3分近端曲小管的近端部分管型。在近端曲小管的两端部分有一些细胞呈碘酸西佛氏染色阳性的颗粒。在一些远端曲小管有明显的细胞退化。4分如同3，但是变化部分也涉及到近端曲小管的两端。5分近端曲小管近端部分和远端曲小管几乎完全或者完全退化。近端曲小管的远端部分有相当大的损害。6分皮质完全退化。3.实验结果综合死亡率、肾脏病理检查及生化指标结果提示硫酸多粘菌素仏毒性明显低于硫酸多粘菌素E (多组分的组合物)。表一、对血液生化的影响


本发明属于医药技术领域，具体涉及多黏菌素E1组合物及其制备方法和用途。所述组合物主要含有多粘菌素E1，也包括E2、E3、E1-1和E1-7MOA等其它成分。本发明提供的用途是指该组合物在制备治疗革兰氏阴性菌感染药物中的用途。