专利名称：纤维素活性微生物的制作方法纤维素是很多无生命物品如消费者日常使用、穿戴或消耗的物品的主要组份。例如，纸张由纤维素以及纺织物、纸浆、木材、植物、草、水果、蔬菜和其它废弃食品加工而成。在几个重要行业如洗衣、纺织、纸浆、纸张、木材、植物、水果行业中，需要不断优化产品和/或工艺。由于含纤维素垃圾给填埋处理以及类似的处理方式带来沉重的负担，研究人员试图寻找用于减少垃圾量，尤其是含纤维素垃圾量的方法，但是他们一直未能成功确定可降解含纤维素的垃圾的有效、安全而便利的方法。因此，需要确定一种能够改变和/或降解含纤维素材料的有效、安全而便利的方法。发明概述本发明将提供对含纤维素物质显示活性的微生物即纤维素活性微生物、提供用于确定此类微生物的筛选方法和利用此类微生物降解纤维素的方法并提供包括此类微生物的各种组合物，从而实现上文中确定的需要。本发明的一个目的是提供一个微生物筛选法，此方法能鉴定出对含纤维素的底物显示可接受的酶活性的微生物，该方法包括a)提供一种或多种微生物；b)利用下文所述的“筛选程序”筛选上述一种或多种微生物；c)可任选地，根据“筛选程序”鉴定所述一种或多种显示可接受的酶活性的微生物。本发明的另一个目的是提供对含纤维素的物质显示活性的微生物。
本发明的另一个目的是提供纤维素活性(即降解)微生物。
本发明的另一个目的是提供一种利用本发明提供的有效数量的微生物和/或由其产生的酶来处理含纤维素的物质，从而使其降解的方法。
本发明的另一个目的是提供处理含纤维素的物质(底物)从而使其降解的体系。
本发明的另一个目的是提供包括依据本发明提供的微生物的各种组合物。
本发明的另一个目的是提供能产生对纤维素显示活性的介质(agent)(即酶、变体、突变等)的微生物。
据此，本发明提供了一个能够鉴定对纤维素显示活性的微生物(即纤维素活性微生物)的微生物筛选法、利用此类微生物处理含纤维素物质的方法，并提供包括此类微生物的各种组合物。
除非另外说明，否则本发明的所有百分比、比率和比例均按产品净重计。本文引用的所有文献均引入本文以供参考。
发明详述定义本文中使用的“体系”一词是指常常(但不总是)由各种不同部分(即材料、组合物、设备、器具、过程、方法、条件等)形成的复杂统一体，而这些部分将受共同计划的制约或用于实现共同目的。
生物材料的保藏A.波氏足肿菌(Pseudallescheria boydii)N12分离株于2000年6月9日根据布达佩斯条约保藏于“比利时微生物保藏中心”(在本文中称为“BCCM”)Mycothèque de l′UniversitéCatholique de Louvain(在本文中称为“MUCL”)(比利时布鲁塞尔)，该菌株的保藏号为MUCL 42873。关于保藏菌株的可获得性的全部限制均已去除。更具体地讲，该菌株在公布(issuance)之后不可撤回地(irrevocably)和没有任何限制或条件地交付公众使用。提供保藏菌株只是为了给熟悉本领域的人员提供方便，并不表示必须使用保藏的菌株，比如按照35 U.S.C.§112规定必须使用的情况。
B.波氏足肿菌Q12分离株于2000年6月9日根据布达佩斯条约保藏于“比利时微生物保藏中心”(在本文中称为“BCCM”)Mycothèque del′UniversitéCatholique de Louvain(在本文中称为“MUCL”)(比利时布鲁塞尔)，该菌株的保藏号为MUCL 42874。关于保藏菌株的可获得性的全部限制均已去除。更具体地讲，该菌株在公布之后不可撤回地和没有任何限制或条件地交付公众使用。提供保藏菌株只是为了给熟悉本领域的人员提供方便，并不表示必须使用保藏的菌株，比如按照35 U.S.C.§112规定必须使用的情况。
C.黄球瘤孢(Sepedonium cfr.Chrysospermum)Z9分离株于2000年6月9日根据布达佩斯条约保藏于“比利时微生物保藏中心”(在本文中称为“BCCM”)Mycothèque de l′Université Catholique de Louvain(在本文中称为“MUCL”)(比利时布鲁塞尔)，该菌株的保藏号为MUCL 42875。关于保藏菌株的可获得性的全部限制均已去除。更具体地讲，该菌株在公布之后不可撤回地和没有任何限制或条件地交付公众使用。提供保藏菌株只是为了给熟悉本领域的人员提供方便，并不表示必须使用保藏的菌株，比如按照35 U.S.C.§112规定必须使用的情况。
制造、使用或销售这些保藏菌株以及由这些菌株派生的化合物必须持有许可，但不据此授予任何此类许可。
上述保藏的菌株是按照布达佩斯条约中有关微生物保藏的条款和规定进行保藏的，保藏期限至少为三十(30)年并且应在存放处接到对保藏菌株样品设备的最新申请之后至少保藏五(5)年，或者将专利有效期作为保藏期限，取时间较长者，如果该菌株在此期限内不能存活，将进行更换。
本发明的微生物可包括真菌菌株和/或属于相同属和/或种的真菌菌株的突变株。
筛选程序“筛选程序”用于对含纤维素物质显示较高活性的新微生物进行鉴定。依据本发明，以下两种筛选程序可用于鉴定此类微生物。满足以下至少一种筛选程序的微生物在本发明的范围之内。同时满足两种筛选程序的依据本发明提供的微生物更佳。而特别合适的微生物则从瘤孢属和/或足肿菌属获得。
程序I-棉织物筛选程序步骤1.固态筛选培养基SSM制备下列筛选培养基。
步骤2.筛选实验制备小块的细棉布布样[例如约5cm×5cm]预先用洗涤剂洗涤[3x 60℃，在Miele洗衣机中用Ariel Ultra洗衣粉洗涤]。将布样消毒(消毒条件可在多数微生物学手册中找到[例如，可参阅Dictionary of Microbiology and Molecular Biology-第69页-JohnWiley & Sons-ISBN 0 471 94052 6]。一个合适的方法为在约1.1大气压下[1个大气压＝101.325kPa]，用高压灭菌器在121℃温度下蒸21分钟)。
制备消毒过的SSM[21’，121℃]将上述筛选培养基[热]装满佩氏培养皿，然后使其固化。当固化开始后，在每个佩氏培养皿中加入一小块布样。
注入纯化株。
在30℃温度下培养10天。
将布样从佩氏培养皿中回收[例如，使用镊子]，从布样中手动去除多数琼脂，然后将布样放入Miele洗衣机，在60℃温度[仅限水]下进行洗涤。
查看该织物是否有可见性损坏和/或重量和/或拉伸强度上的损失。对棉织物有实质影响的菌株将被视为合适的菌株。我们所说的“实质影响”指的是织物在从固态培养基中回收时均带有可见性损坏。[例如，撕裂的布样、洞]和/或回收布样呈现较大的重量损失[至少10％，优选至少25％]和/或拉伸强度损失[至少10％，优选至少25％]。拉伸强度损失可用任意合适的方法/仪器进行测量。例如，INSTRON设备非常适合测量拉伸强度损失。优选用Krefeld棉布试验织物11A，但细棉布也适用。
程序II-纸张程序步骤1.液态筛选培养基CM制备下面的液态筛选培养基。
步骤2.筛选试验将非印刷纸[新闻纸质地]切碎、筛分[以获得直径在2.3毫米和4.5毫米之间的纸屑]，然后进行消毒。消毒条件可在多数微生物学手册中找到[例如，可参阅Dictionary of Microbiology andMolecular Biology-第69页-John Wiley & Sons-ISBN 0 471 94052 6]。一个合适的方法为在1.1大气压下[1个大气压＝101.325kPa]，用高压灭菌器在121℃温度下蒸21分钟。
将20g进行上述处理的纸张添加到一公升已消毒的液态筛选培养基中。
将250ml混合液添加到容积为500ml的锥形烧瓶中。
除一个锥形烧瓶以外，在所有锥形烧瓶中注入纯化株。将未注入菌株的锥形烧瓶用作参照。
随后，将所有锥形烧瓶在30℃和200RPM的条件下进行培养。
每天将这些锥形烧瓶与参照锥形烧瓶[未注入菌株]进行比较，目测纸张的降解情况。对纸张具有实质影响的菌株将被视为合适的菌株。我们所说的“实质”影响指的是在5到10天内，与参照锥形烧瓶相比，大部分纸张均已消失[用肉眼观察不到]。
微生物由上述“筛选程序”鉴定的微生物在本发明范围之内。此类微生物的足肿菌属菌种的非限制性实施例波氏足肿菌、Ps.africana、Ps.angusta、Ps.desertarum、Ps.ellipsoidea、Ps.fimeti、Ps.Fusoidea。
请注意，菌种也有同义名称[例如波氏足肿菌和Allescheria boydii、Petriellidium boydii]，而且也能以无性态出现[例如波氏足肿菌和anamorphsGraphium penicillioides、Graphium eumorphium、Monosporium apiospermum、Glenospora graphii、Scedosporium apiospermum、Stilbum basitruncatum、Sporocybe chartoikoon]。
2)瘤孢属(Sepedonium)其它名称Chaetomium、Hypomyces瘤孢属菌种的非限制性实施例Chaetomiumpiluliferum、Hypomyceschrysospermus、Sep.ampullosporum。
请注意，菌种也有同义名称[Sep.albo-griseum、Sep.xylogenum、Sep.chrysospermum]，而且也能以无性态出现[例如Botryotrichum piluliferum]。
突变突变可自发出现(即自发突变)和/或由诱变剂的活动引起(即诱发突变)。一些不同类型的非限制性突变为正突变或反突变，插入突变或缺失突变，渗出突变，错义、无义或同义突变，点、随机或多位点突变，极性突变，阻遏突变等等。[例如，可参阅Dictionary of Microbiology and MolecularBiology-John Wiley & Sons-ISBN 0 471 94052 6]。
突变可用不同方法诱发。可用化学诱变剂来产生突变。一些实施例为亚硝酸、羟胺、甲基甲烷磺酸酯、2-氨基嘌呤、亚硝基胍等。
可用物理方法来获得突变，例如致电离辐射(X、β、γ射线)、紫外线、热辐射等。
其它诱变剂(例如ICR化合物、二氨基吖啶、吖啶)可诱发框移突变，导致突变株的形成。
显然，在本领域中已知的任何其它方法均可用来产生选定菌株的突变株。
如果野生型微生物的一种或多种特性经改进后优于野生型，则将优先选用其突变株。例如，由于特定活性和/或表达产物的提高而导致酶活性增强。另外，其它特性(如最佳pH值、稳定性等)对于突变研究来说也是很有吸引力的挑战。目标特性的变动将视应用条件而定。
酶和变异体酶可由选定的微生物产生，但为了提高如表达量、纯度等，也可在宿主生物中进行克隆。
酶可用于液体制备及固体化合物中。可使用酶的组合物的物理形式非限制性实施例为晶粒、颗粒、附聚物、糊剂、凝胶、液体、泡沫、粉末和片剂。
显然，可通过熟悉本领域的一般技术人员根据目前技术手段的发展状况(诸如蛋白质与遗传工程和/或定向进化)改变酶。
此类改变的目标是改进特性，即，改变酶使之适应于应用条件，从而优于野生型酶。一些非限制性实施例包括较高的特定活性改变的最佳pH值增强的稳定性[例如，与温度、组合物成分、应用环境相比]氧化稳定性改变的等电点使用方法依据本发明提供的微生物和/或由其产生的酶可用于降解纤维素，尤其可降解含有纤维素的物质。
这包括在纺织、造纸、纸浆、水果、蔬菜、洗涤、清淤[排水、管道、化粪池等]、废物处理、堆肥处理等行业领域中的应用。
组合物依据本发明提供的微生物和/或由其产生的酶可合并为一个组合物。此类组合物可为液体、固体[例如颗粒、棒状物、片剂、条状物、粉末等]、凝胶、糊剂、泡沫等。液体组合物可为含水物质或非含水物质。这些组合物可为浓缩物或非浓缩物。
在本领域的任何形式应用中都可使用微生物，如活菌剂、眠态剂、冻干剂等等。
依据本发明提供的组合物可进一步添加营养剂、溶剂、增稠剂、表面活性剂、香料、染料、粘土、沸石、酶稳定剂及本领域中已知的其它成分，从而将微生物和/或酶转移和/或带到应用领域。
尽管已用具体实施方案描述了本发明，但显而易见的是，对于熟悉本领域的技术人员，可在不背离本发明的宗旨和保护范围的情况下进行各种更改和修改，因此所附的权利要求书旨在包括在本发明保护范围之内的所有这些修改。
尽管已根据非限制性实施方案对本发明进行了详细描述，但显而易见的是，熟悉本领域的技术人员可在不背离本发明的范围的情况下进行各种更改和修改，而且本发明也不限于本说明书中的描述。


本发明提供了对纤维素和/或含纤维素的物质显示活性的微生物。本发明还提供了此类微生物和/或由此类微生物产生的介质的使用方法以及用于鉴定此类微生物的筛选法。