专利名称:克隆限制修饰系统的方法本发明是有关克隆限制修饰系统的方法，由此产生的克隆，和用克隆生产限制酶和(或)修饰酶的方法。具体讲是有关DdeⅠ和BamHⅠ限制性核酸内切酶和修饰性甲基化酶的克隆以及这些克隆和酶的生产方法。限制性核酸内切酶是天然存在于细菌中的一类酶，细菌中含有此酶的成分经分离提纯可在实验室中用于裂解DNA分子成为DNA片断。此类酶的这种性质便于DNA分子的鉴定和基因成分的分部分离。已经证明限制性内切酶是现代遗传学研究所不可缺少的工具，在遗传工程和遗传分析中被誉为生物化学的“剪刀”。限制性核酸内切酶能够识别DNA分子并结合在专一的核苷酸序列(“识别序列”)上。限制性核酸内切酶一旦与DNA结合上，就能在专一序列的内部或端部进行切割。不同的限制性核酸内切酶对不同的识别序列亲和性也不同。目前从数百种细菌中已鉴定出有将近一百种不同的限制性核酸内切酶。在每一种细菌中往往只含有极少量的限制性核酸内切酶。这类酶多根据来源菌的名称命名。比如埃及噬血菌(Haemophilus aeqyptius)所合成的三种不同的限制性核酸内切酶分别命名为HaeⅠ，HaeⅡ和HaeⅢ。这三种酶的识别序列及切点分别为(AT)GGCC(AT)，Pu GCGCPy和GGCC。再例如大肠杆菌RY(Escherichia coli RY13)只合成一种限制性核酸内切酶，定名为EcoRⅠ，其识别序列为GAATTC。事实上，限制性核酸内切酶对细菌细胞的生长具有保护作用，它可使细菌抵御外源DNA分子的入侵，如病毒和质粒DNA，这种外源DNA可破坏或寄生于细菌细胞。限制性核酸内切酶可沿外源DNA分子扫描，每发现一个识别序列就进行切割，从而使细菌对外源DNA具有抗性。切断了的外源DNA不能成为入侵基团并且对非专一性核酸内切酶的进一步降解作用更加敏感。细菌保护系统的另一成分是修饰性甲基化酶。这类酶与限制性核酸内切酶在功能上互补能够识别和区分内外源DNA。修饰性甲基化酶在DNA上的识别及结合序列与相应的限制性核酸内切酶相同，但不打断DNA。此酶只在识别序列内某一个或另一个核苷酸残基上进行化学修饰即加上一个甲基基团。甲基化后的识别序列不再被限制性核酸内切酶结合或切断。细菌细胞的DNA在甲基化酶的作用下充分甲基化，因而细菌DNA对内源性限制性核酸内切酶的存在丝毫不敏感，只有未被甲基化的，外源性的DNA才易被限制性核酸内切酶所识别和攻击。随着遗传工程技术的发展，目前有可能用克隆基因的方法来生产蛋白质和酶，比起常规提纯的方法其基因的编码量要大得多。分离限制性核酸内切酶克隆的关键是找到一种简单可靠的方法在复杂的“库”中鉴别出这种克隆。即在克隆频率为10-4到10-3用“鸟枪法”诱导克隆的程序。较优选的方法是能使大量不需要的克隆被破坏掉，而少量理想中的克隆被保留下来。Ⅱ型限制修饰系统越来越快地被克隆。首先克隆的系统是用细菌噬菌体感染作为选择性分离限制性核酸内切酶克隆手段(Pst I Walder et al.，Proc.Nat.Acad.Sci，74 1503-1507(1981)，Hha I IMann et al.Gene 397-112(1981))。由于限制修饰系统的存在使得细菌能够抵御细菌噬菌体的感染。被噬菌体感染的存活细胞原则上能选择性地分离出携带限制修饰系统基因克隆细胞。这种方法已经建立但有很大的局限性，特别是用这种方法克隆的限制修饰基因不能持久地为经选择存活下来的细胞提供极显著的噬菌体抗性。另一种克隆方法是转移系统本身具有负载质粒进入E.coli后形成克隆质粒的特性(Eco RV Bougueleret et al.，Nucl.Acid.Res.1293659-3676 1984;PacR7，Gingeras and Brooks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80402-406 1983，Theriault and Roy，1982;RvuⅡ，Blumenthal et al;J，Bacteriol，164501-509 1985.)。最终为了选择一个具有活性的甲基化酶基因，目前正在克隆着若干个系统(Bsu RI，Kiss et al.，Nucl.Acid.Res.136403-6421 1986;Taq I);由于这两个基因经常是紧密连锁，所以两个基因可同时被克隆。然而筛选的甲基化酶常不能带有完整的限制性系统(Bsp RI，Szomolanyi et al.，Gene 10219-225 1980;MspI，Walder et al.J，Biol.Chem.2581235-1241 1983)。尽管试图克隆与甲基化酶基因相邻的较大区段也未能产生出具有活性的核酸内切酶基因。在某些系统中克隆的难点在于导入宿主的核酸内切酶基因不能靠被甲基化加以适当的保护。如果甲基化酶基因和核酸内切酶基因被引入一个普通DNA片段，则甲基化酶基因产物势必会在核酸内切酶基因产物裂解宿主基因组之前将宿主DNA加以修饰。在Ecoli中克隆限制修饰酶系统的另一障碍是在克隆分支甲基化酶的过程中发现的。许多Ecoli菌株(包括通常用于克隆的菌株)具有阻止带有甲基化胞苷的异源DNA导入宿主细胞的系统。(Raleigh and Wilson，submitted for publication)。因此有必要仔细考虑哪一种Ecoli菌株适于克隆。
因为提纯的限制性核酸内切酶和少量的修饰性甲基化酶对于在实验室中描述DNA性质及DNA重排仍是很有用的工具，所以找到一种能使菌株合成大量酶的方法则更具有商业性的刺激作用。由于这种菌株能简化提纯过程并同时能提供商业性产量，因而这种菌株将是非常有用的。
按照本发明，一种克隆限制修饰系统的方法包括将修饰基因导入克隆载体并在适当的宿主细胞中表达以及将限制基因导入含有修饰基因的宿主细胞。
本发明提供了一种生产限制性酶和(或)与之相应的修饰酶的方法，该方法是通过克隆编码上述二类酶的基因并在高水平上排列待表达的基因进行的。更明确地说是提供了一种克隆这些酶的新方法，这样生产的克隆以及生产这些酶本身的方法，首先是在合适的宿主内克隆和表达甲基化酶基因，目的在于靠甲基化来适当保护宿主;第二步，将核酸内切酶内切基因克隆并转导到含有甲基化酶克隆的宿主中，载体上核酸内切酶基因的表达水平低于甲基化酶基因的表达水平。
脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)和淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens)的DdeⅠ和BamHⅠ限制及修饰基因中该方法的应用，以及所产生的克隆将分别进行详细的描述，所产生的克隆构成纯化DdeⅠ和BamHⅠ限制及修饰酶的一套新的，极有用的克隆方法的基础。
本发明将根据实施例加以说明，有关附图如下图1为带质粒的pDde 3.0a甲基化酶Tn5基因图及DdeⅠ甲基化酶高表达克隆pDdeM 1.6的组建。
图2为体内M.DdeⅠ克隆保护性测定结果的说明。
图3表明M.DdeⅠ是胞苷甲基化酶。
图4为DdeⅠ克隆的Southern杂交分析及限制性图谱的说明。图4A.是用3.0Kb HindⅢ插入pDdeM 3.0a中与基因组DNA探针的Southern杂交说明。图4B是脱硫脱硫弧菌基因组内含有DdeⅠ系统和衍生质粒的限制性图谱说明。
图5是用处理的甲基化酶质粒的Bam HⅠ酶切图谱图6是用BamHⅠ处理的带核酸内切酶基因的pDH2质粒的BamH酶切图谱。
图7是Bam染色体的说明。
用两步法克隆限制修饰系统以及收集由此产生的限制酶如下所述。此方法的优点在于克隆和带有克隆的宿主均含有修饰基因，如果克隆或宿主中存在相应限制基因的识别序列，那么修饰基因就在该顺序内进行自身DNA的甲基化，同时对体外相应的限制性核酸内切酶的消化作用产生抗性。而后在含有这些克隆的宿主中引入限制性核酸内切酶基因，从而只有那些被甲基化酶保护的宿主选择性地存活下来。
第一步将所需限制基因相对应的甲基化酶基因克隆并最好将诱导的高水平表达的甲基化酶组建。第二步将限制基因克隆到含有甲基化酶基因的宿主中，并根据核酸内切酶活性加以筛选。克隆到有相应甲基化酶基因保护的宿主细胞中的核酸内切酶能够表达。
虽然不能只局限于理论上的成立，但以往之所以不能克隆有活性的核酸内切酶基因就是因为导入宿主内带有甲基化酶基因和核酸内切酶基因的普通DNA片段不能使宿主细胞和克隆被充分的甲基化，相反却使得宿主基因组被相应的核酸内切酶所裂解。若首先引入甲基化酶基因并提尚其表达，同时使克隆到载体上的核酸内切酶基因的表达水平低于甲基化酶基因的表达，那么上述问题就能被解决。
克隆和表达限制性基因优选的方法包括如下步骤A.克隆甲基化酶基因。
1.用于克隆的细菌DNA要被纯化。最近发现某些病毒内也含有限制修饰系统，因而也可作为材料来源。
2.用适当的限制性核酸内切酶将DNA部分消化或完全消化。
3.消化得到的DNA片段连接到克隆载体上，如pBR322，pUC8，9，18或19，pBR328或者一种含有其它末端连接的衍生载体，然后用带有目的基因的载体去转化适当的宿主细胞，如Ecoli细胞。
4.将DNA与细胞的混合物涂布于抗生素选择平板培养基上。经培养将转化的细胞菌落合并，悬浮并生长达到饱和从而形成初级的细胞库。
5.重组质粒从初级细胞库中被大量纯化形成初级质粒库。
6.在体外用所需甲基化酶基因相对应的限制性酶对质粒库消化完全。在消化中加一些核酸外切酶和(或)磷酸酶可以增强对非甲基化酶基因克隆的破坏性。
7.消化过的DNA转化Ecoli并且再次用抗生素选择平板培养基筛选转化的克隆。其中一些菌落，即二级细胞群可以甲基化酶基因的存在为标准加以筛选和DNA分析。将其余的菌落一起刮下形成二级细胞库，然后可制备二级质粒库。
8.二级质粒库再次用限制性核酸内切酶(加或不加核酸外切酶和磷酸酶)消化来重复筛选，最终得到三级细胞个体、三级细胞库和三级质粒库。
9.每次限制性核酸内切酶的消化都能选择性地破坏非甲基化酶的克隆，使得所需要的携带甲基化酶的克隆频率相对增加。
10.二级和三级细胞群中存活下来的菌落以甲基化酶基因的存在与否进行挑选和分析。
11.甲基化酶的筛选可按下述四项加以验证(a).克隆的重组质粒DNA分子要被纯化并在体外用有选择的限制性核酸内切酶作用以确定其对酶的消化作用具有抗性。如果载体质粒有几个核酸内切酶位点，抗性就是修饰的结果而不是位点丢失的突变。
(b)最初用酶消化的重组质粒是供体细菌DNA片断，存在于克隆中的DNA片段应当具有相当的容量足够编码甲基化酶基因(例如大于500碱基对)，最重要的是为各种已形成的独立的克隆所共用，其所有克隆必须具有同样的一种片段或一些片段。
(c)克隆的全部染色体DNA或者是转导到细胞内的二级质粒DNA以及生长在细胞中的噬菌体DNA可被纯化和受到选择性限制核酸内切酶的作用。如果克隆携带了甲基化酶基因，那么细菌染色体、质粒或噬菌体DNA都应能部分或全部地被甲基化并且对酶的消化作用表现出抗性。
(d)从克隆中抽取出细胞在体外检测其甲基化酶活性(甲基化酶的保护作用和放射性标记)。要经常能看到专一性甲基化酶活性。
12.甲基化酶基因对胞苷或腺苷甲基化酶的性质取决于适当宿主内所克隆的相应的核酸内切酶基因。一系列宿主用于克隆甲基化酶基因，然后决定其甲基化的专一性。
B.核酸内切酶基因的克隆1.因为核酸内切酶与甲基化酶基因经常是紧密连锁的，所以基因组内甲基化酶基因附近的区段已经被定位，即以含有甲基化酶基因的克隆作为探针，和从同源蛋白质中制取的限制性核酸内切酶探针进行Southern杂交。甲基化酶克隆与细菌染色体在图谱上产生的任何差异都可能标志着有DNA的重排发生并且事实上也就表明有核酸内切酶基因存在。
2.利用限制性内切酶图谱，将各种细菌的DNA用适当的限制酶再次消化。提纯能杂交到探针上的适当大小的片段，连接到克隆载体上，其核酸内切酶的表达水平要相对低于甲基化酶。应优选那些带有甲基化酶基因的克隆载体作为合适的载体。然后用克隆载体混合物转化带有甲基化酶质粒的宿主细胞。尽管不是很理想，但只要核酸内切酶基因的表达低或受启动子的严格控制，核酸内切酶就能转导到带有甲基化酶基因的克隆载体上。用克隆载体混合物同时转化带有和不带有甲基化酶质粒的宿主细胞。不论在什么情况下，DNA和细胞的混合物都可以靠抗生素培养基来筛选转化细胞。
3.限制性核酸内切酶的筛选可以三种方式进行(a)从克隆中抽取出细胞在体外检测其对敏感DNA的消化能力应具有限制性核酸内切酶活性。
(b)在体内检测细胞自身抗噬菌体感染能力。对噬菌体侵染抗性证明有限制修饰系统存在。
(c)转化的菌落还可以通过与限制性核酸内切酶基因和(或)相邻区段制成的寡聚核苷酸探针杂交来检验互补序列的存在。但所用探针不包括在甲基化酶基因探针内。
含有DdeⅠ和BamHⅠ的限制和修饰基因的克隆已生产出来了，供体基因的DNA来源于脱硫脱硫弧菌(Desulforibrio desulfuricans)(DdeⅠ)(NCIB83120)和淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens H)BamHⅠ(样品已保藏在美国典型培养物保藏中心-ATCC 53495)。
一个影响到限制和修饰基因克隆成败的重要因素是用来作宿主的Ecoli菌株。许多细菌都有限制修饰系统，包括Ecoli。在Ecoli中最普通的系统是宿主专一性决定簇或“Hsd”系统，还有其它一些系统，象较重要的P1和EcoR系统(Roberts，R.J.，Nucl，Acids Res.12SR167-204(1984))。这些系统能干扰克隆的形成，因为它们可以破坏转化进来的DNA，导致转化子数量极低和没有意义的库。因此通常优选的Ecoli菌株是限制系统因突变或缺失而失活的菌株，较好的菌株是这些系统均失活或缺陷，因而可以用来作一般克隆用途，其中包括HB101(hsd R M)ATCC 33694，RRI(hsd R-M-)ATCC 31343，K802(hsd R-M-)ATCC 33526，K803(hsd R-M-)ATCC 27065和MM294(hsd R-M-)ATCC 33625和ER1467(hsd R-M-)，其菌株样品已保藏在美国典型培养物保藏中心，ATCC 53496。
尤其是在外源限制和(或)修饰基因克隆到Ecoli中时有一个附加系统能干扰到克隆的成功。该系统还未搞清楚，将其归于“Rgl”系统(Revel，H.R.，Bacteriophage T，pp.156-165 American Society of Microbiology(1983)和Revel et al.，Annual Review of Genetics 4177-192(1970))。最特殊的是EcoliRgl系统能限制带有甲基化胞苷残基的DNA分子，因此妨碍了自身己甲基化的克隆质粒被分离。最近已证明Rgl系统是受叫做“mcr B”(Modified Cytosine restriction，Raleigh和Wilson，如上所述)位点的控制。因此，为了克隆甲基化酶基因，最好所用宿主Ecoli的Hsd(普遍性)系统和Rgl(专一性)系统均为缺陷型。现已建成一种新的克隆菌株系列，此系列是利用Tn10插入因子使‘Mcr B’位点失活。一个用于克隆胞苷型甲基化酶基因的较好的菌株是ER1467。ER1467是从JC1552菌株中衍变而来的。在‘Mcr B’位点含有Tn 10插入序列(Bachman，Bacteriol.Rev.36525;1972)。然而并不是所有克隆到的甲基化酶基因都具有易感性，特别是与甲基化胞苷残基的基因相比，甲基化腺苷残基的甲基化酶基因丝毫不受Rgl系统的影响。
尽管不能局限于理论，但可以肯定Rgl系统由两种成份组成，命名为“RglA”和“RglB”。在功能上RglB可限制许多含有DNAs的胞苷甲基化酶而Rg1A目前已知只能专一地限制一种克隆(HpaⅡ)。
要选择一种宿主，其克隆的限制和(或)修饰基因不带有限制修饰系统的特性，或者该宿主已知在胞苷上甲基化，这个优选的宿主就是Ecoli三突变体，即Hsd、RglA和RglB系统均缺陷的菌株，其中还包括K802。用DdeⅠ优选的宿主是ER1467，此菌株基因型为hst R-M-和RglA+B-。换句话说，如果修饰系统已知是腺苷甲基化类型的，则可忽略宿主内Rgl活性。虽然Rgl系统不能干扰腺苷甲基化酶，但可作用于Ecoli中其它特性较弱的系统来影响腺苷的甲基化。因此，宿主的选择取决于被克隆的修饰基因的性质。表1简要介绍几种适合于克隆几种修饰基因的Ecoli菌株。
下面将本发明用实施例加以说明并配有附例实施例1DdeⅠ限制性修饰基因的克隆A.甲基化酶基因的克隆及其活性特征1.提纯DNA脱硫脱硫弧菌DNA的纯化采用下述方法5克冰冻细胞重悬浮于20ml的25%蔗糖溶液，50mM Tris，PH8.0中;加入10ml 0.25M EDTA，PH8.0，并在0.25M Tris PH8.0中加入6.0ml的10mg/ml的溶菌酶，悬浮液在冰浴中放置2小时。2小时后，加入24ml裂解缓冲液(1% Triton x-100，50mM Tris，PH8.0，67mM EDTA)加上5ml 10% SDS混匀使细胞裂解。加入等体积的苯酚(用100mMtris.PH8.0平衡)振动使溶液乳化。加入70ml氯仿摇10分钟。然后在贝克曼离心机中离心30分钟，速度为10K。上层含有DNA的水层转移到干净瓶中重新用苯酚和氯仿的混合液抽提两次以上。
使水层在10mM Tris，1mM EDTA，PH8.0中透析24小时，透析时换四次溶液。透析后的DNA溶液用0.1倍体积的DNA酶(10mg/ml)在37℃下处理1小时。加入5M Na Cl溶液，最终浓度为0.4M Na Cl并在上面加入一层2倍体积的乙醇。将DNA用玻璃棒搅拌起用70%的乙醇洗涤一次，然后溶解在15ml的10mM Tris，1mM EDTA，PH8.0中。DNA在-20℃下冰冻保存。从5克细胞中能回收1.5毫克纯化DNA。
2.完全消化10μg提纯的脱硫脱硫弧菌DNA用15单位的HindⅢ在100μl HindⅢ缓冲溶液体系中于37℃反应1小时，经培养建立脱硫脱硫弧菌DNA库。(HindⅢ缓冲液10mM Tris，PH7.5;10mM Mg Cl2;50mM Na Cl;10mM β-巯基乙醇)。
3.连接
4μg消化过的DNA连接到2μg经HindⅢ裂解并脱磷酸的pBR322(新英格兰生物实验室)上，100μl反应液含有50mM Tris，PH7.5，10mM Mg Cl，10mM DTT，0.5mMATP和1000单位的T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室)。连接反应在16℃下持续进行4小时。样品经氯仿处理转化到200μl的冰冻的感受态RRI细胞(溶在50mM Ca Cl2)中细胞在42℃下被“热激”2分钟，然后稀释到5ml LB培养基中(L-Broth)并在37℃下生长达到饱和。
4.通过离心收集转化细胞(4K，10分钟，贝克曼离心机)，离心后将细胞重新悬浮在250μl的L-Broth中，涂布在含100μg/ml氨苄青霉素琼脂平板培养基上，37℃培养过夜。用2.5ml 10mM Tris，PH7.5，10mM Mg Cl2缓冲液冲洗平板，混合细胞群中约有10-5转化子从平板上洗脱下来。
5.混合物接种到500ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中，37℃培养过夜。在37℃振荡培养物过夜然后再收集细胞(4K，5分钟)。室温下再将细胞悬浮于10ml 25%蔗糖，50mM Tris，PH8.0中，加入5ml 0.25M EDTA，PH8.0和3ml 10μg/ml的溶菌酶。溶液在4℃下放置1小时;然后加入12ml裂解缓冲液使悬浮的细胞逐渐混匀。裂解后，裂解液在速度15K下离心1小时，上清液用滤布倾析。加入固体氯化铯(0.93g/ml)和溴化乙啶，终浓度为100μg/ml。将溶液装入试管，平衡离心，使用贝克曼离心机Ti 70转头，在44，000rpm，17℃下超速离心48小时。被乙啶着色的DNA区带用注射器抽提并将DNA沉淀在冷冻的乙醇中。转速在12K离心20分钟收集质粒DNA。重新悬浮在1ml 10mM Tris，PH8.0，1mM EDTA的DNA用苯酚抽提一次，氯仿抽提一次，然后沉淀在2倍体积的乙醇中，干燥后重新悬浮于100μl 10mM Tris，PH8.0，1mM EDTA缓冲液中。
6.DdeⅠ降解
5μg的初级质粒库用80单位的DdeⅠ核酸内切酶在总体积为100μl 10mM Tris，PH7.5，10mM Mg Cl2，10mMβ-巯基乙醇，100mM Na Cl溶液中反应消化1小时。
7.转化用10μl反应混合物转化200μl前面提到过的RRⅠ细胞。经2分钟热处理，转化的混合物马上涂布在加有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂培养基上。37℃培养过夜。DdeⅠ处理过的与未处理的重组质粒相比较收率为103。将菌落接种到10ml含有氨苄青霉素的L-Broth中，制备一个微量培养物并在含氨苄青霉素的LB平板上划线。
8.微量提取过程每次培养的过程如下10ml过夜培养物经6K rpm离心5分钟后形成的小球重新悬浮到1ml 25mM Tris，PH8.0，10mM EDTA，50mM葡萄糖和1mg/ml溶菌酶中，室温下放置10分钟。然后加2ml 0.2M NaOH，1%SDS溶液，在试管内混匀，4℃下放置5分钟;再加上1.5ml 3M醋酸钠、PH4.8，混匀后在冰上培养5分钟。混合物在15K rpm条件下离心10分钟。上清液倒入装有3.0ml的异丙醇的离心管中，室温放置10分钟后离心10分钟，速度为15K rpm。沉淀物在室温下空气干燥后重悬浮在0.85ml10m M Tris，1mM EDTA，PH8.0中。加入75ml 5M Na Cl再使DNA室温下在异丙醇中沉淀。在eppendorf离心机中离心1分钟后，使沉淀物空气干燥并重悬浮于50μl 10mM Tris，PH8.0，含有20μg/ml RNA酶的1mM EDTA中。
9.甲基化酶基因克隆质粒的微量提取先用DdeⅠ降解，然后用HindⅢ消化进行分析。在存活下来的质粒中有两类对DdeⅠ核酸内切酶降解具抗性的质粒。这两类质粒在pBR322相反方向上携带有3.0Kb的HindⅢ片段而且后来证明这些质粒带有DdeⅠ修饰性甲基化酶基因。这两类质粒被称做pDdeM3.0a和pDdeM 3.0b，所使用的标准命名法是Gingeras和Brooks等人建立的(PNAS(USA)80402(1985))。经粗提过的这些克隆(参见下文B-5)没有表现出任何DdeⅠ核酸内切酶的活性。
甲基化酶基因在3.0Kb HindⅢ片段内的位置是由一系列Tn5诱变实验确定的(图1A)(Berg.D.E.(1977)in DNA Insertions Elements，Plasmids，and Episomes，Bukhari，A.I.，Shapiro，J.A.and Adhya，S.L.Eds.，pp.205-212 Cold Spring Harbor Laboratoires，New York)。携带甲基化酶基因质粒pDdeM3.0a或pDdeM3.0b的HB101(rec A)细胞在L-Broth中30℃培养过夜，培养基还要加100μg/ml氨苄青霉素及0.2%的麦芽糖。将饱和的培养物以1∶100稀释到加有氨苄青霉素和麦芽糖的5ml LB中继续培养到细胞密度大约在109细胞/毫升为止。取1ml细胞培养液与带有Tn5的细菌噬菌体(λ467∶∶Tn5 from N.kleckner via E.Raleigh)在m.o.i.＝0.1的条件下混匀。得到的混合物在30℃中培养2小时。将0.2ml的液体涂在含有50μg/ml卡那霉素，100μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上30℃培养48小时。
用5ml 25mM Tris，PH8.0，10mM EDTA，50mM葡萄糖将平板上的菌落洗脱下来。根据上述方法进行微量提取。(见8.微量提取)用微量提取物来转化200μl的冷冻感受态细胞HB101(在50mM Ca Cl中)。细胞在42℃下热激2分钟，然后稀释到1ml L-Broth中培养1小时，再将细胞涂布在含有50μg/ml卡那霉素，100μg/ml氨苄青霉素的L-Broth平板上。
用HindⅢ消化微量提取的质粒DNA来筛选带有Tn5质粒的转化子。再用DdeⅠ核酸内切酶作用微量提取的质粒DNA来检测带Tn5质粒中DdeⅠ甲基化酶的活性。
如图1A所示，只有当Tn5插入到ClaⅠ和HindⅢ位点中才能导致DdeⅠ甲基化酶活性的丧失，从而说明甲基化酶基因位于这两个位点区间。靠建立一个由ClaⅠ作用而有缺失的pDdeM0.3a，能建立一个具有甲基化酶活性的pDdeM1.6作为亚克隆，从而进一步确定整个甲基化酶基因位于1.6Kb区间内(图1B)。
用体内保护性测定和体外3H-甲基掺入测定可比较三个M.DdeⅠ克隆的甲基化酶活性，步骤如下a.体外3H-甲基掺入测定(Gingeras and Brooks，见上)为了测定甲基化需制备下列三种混合物1.10X甲基化缓冲液1M Na Cl，0.5M Tris，PH7.5，0.1mM EDTA，H和50mMβ-巯基乙醇。
2.甲基化反应混合物底物，由EcoRⅠ酶切变成线状的pBR322制备方法如下pBR322与20倍的EcoRⅠ在100mM Na Cl，10mM Tris，PH7.5，10mM Mg Cl2中培养，pBR322最终浓度为20μg/ml。37℃培养1小时后，线型质粒用苯酚抽提，乙醇沉淀，空气干燥沉淀物。将DNA重新悬浮于10mM Tris，PH8.0，1m MEDTA中，最终浓度为1mg/ml线型质粒。甲基化反应混合物包括1μg(＝1μl线型pBR322，2.5μl 10X甲基化缓冲液，0.5μl3H-S-腺苷-甲硫氨酸和H2O，总体积20μl。
3.细胞提取物制备如下5ml被测克隆培养液在含100μg/ml氨苄青霉素的L-Broth中37℃培养过夜。达到饱和时以5K rpm离心10分钟，使细胞成团状。细胞团重悬浮于500μl超声处理缓冲液中(10mM Tris，PH7.5，10mM β-巯基乙醇)。混合液中再加入25μl溶菌酶(10mg/ml)和50μl EDTA(100mM)。此样品冰冻后再冻融，用超声波处理进行一次10秒钟的裂解，加入5μl1M Mg Cl2后，样品在小离心管中离心5分钟。
为了测定细胞提取物，将5μl提取液加到20μl甲基化反应混合物中在37℃下培养30分钟，然后将全部25μl反应液用移液管转移到1英寸见方的纸上。将纸空气干燥，用10%三氯乙酸，(150ml)冲洗两次，再用200ml异丙醇冲洗两次。再次将纸空气干燥，将纸浸泡在加有闪烁液(Omniflour，NEN)的试管中进行3H-甲基掺入计数以检测样品甲基化的水平。
b.体内λ保护性测定含甲基化酶基因的质粒pDdeM 3.0a、pDdeM 3.0b、pDdeM 1.6依前述转化程序转化到ER1467菌株中。在加有100μg/ml氨苄青霉素的L-Broth中使克隆生长达到饱和，以1∶100接种到含有氨苄青霉素的的10ml L-Broth中，当细胞生长到对数期时离心5分钟，转速为5K rpm。离心得到的细胞团重悬浮于1ml噬菌体缓冲液中，其成分为10mM Tris，PH7.4，5mM Mg Cl2，0.2MNa Cl，0.1%的凝胶。然后再加入100μlλ噬菌体(1011噬菌体/ml)，混匀，在37℃下培养30分钟。培养后的混合液用9ml噬菌体缓冲液稀释后再离心10分钟，转速5K rpm。离心产物重悬浮于10ml含有100μg/ml氨苄青霉素的L-Broth中37℃培养过夜。
噬菌体DNA按如下方法制备。裂解的细胞转移到离心管中并加3滴氯仿，样品在试管中混匀后在10K rpm速度下离心10分钟。弃去沉淀物。将上清液加上等体积的苯酚抽提，混匀后放入离心机离心5分钟，速度5K rpm。水层用氯仿抽提，混匀再离心。上层转移到干净试管中加入2倍体积的乙醇沉淀DNA，然后以10K rpm转速离心20分钟，离心后的沉淀空气干燥后重悬浮在1ml 10mM Tris，PH8.0，1mMEDTA，20μg/ml RNA酶中。
为了检测噬菌体DNA的修饰情况，我们将20-40μl噬菌体DNA与下列溶液混合5μl 10Dde Ⅰ缓冲液(1M Na Cl，100mM Tris，PH7.5，和100mM Mg Cl)和1.5μl DdeⅠ核酸内切酶(10，000单位/ml)，总反应体积为50μl。对全部样品做凝胶电泳分析，如图2所示。
体外体内测定表明甲基化酶的活性呈梯度分布，pDdeM3.0b活性最低，而pDdeM1.6活性最高;体外体内测定结果一致证明pDdeM1.6的甲基化酶活性足够完全保护λ噬菌体DNA。因此pDdeM1.6后来被用于克隆核酸内切酶基因(见下文)。
按下列方法可以证明M.DdeⅠ是胞苷甲基化酶而不是腺苷甲基化酶λ噬菌体DNA中Sau3a(GATC)和DdeⅠ(CTNAG)在25325′-GATCTCAG-3′位点发生重叠(Suggs.S.V.，Wallace，R.B.，Hirose，T.，Kawashima，E.H.and Itakura，K.(1981)PNAS(USA)78，6613-6617，Sanger，F.，Coulson，A.R.，Hong，GF.，Hill，D.P.and Petersen，G.B.(1982)J.Moh Biol.162，729-773)。
用Sau3a裂解λ噬菌体DNA得到165bp和487bp两个片段，一个5.0Kb MluⅠ片段包含Sau 3a和DdeⅠ两个重叠位点。分离这个片段使得与Ssu3a有关的片段更易看到。我们用MDdeⅠ处理λ片段然后用Sau3a作用，如果MDdeⅠ是腺苷甲基化酶，那么就会在该序列的第二个腺苷上进行修饰并且是在Sau3a识别位点以外。因此，Sau3a的降解作用一般可产生165bp和487bp两个片段。然而，如果M.DdeⅠ是胞苷甲基化酶，修饰则发生在Sau3a识别序列内的胞苷上。Sau3a位点上的部分甲基化阻碍Sau3a的裂解，而只能在单链上产生缺口(Streek、R.E.(1980)Gene 12，267)。经Sau3a处理可出现一个新的652bp片段，如图3所示。实际上出现的一条新带表明M.DdeⅠ是一个胞苷甲基化酶。
确定M.DdeⅠ是一个胞苷甲基化酶有助于解释下列现象。当我们所被克隆的菌株RR1带有pDdeM3.0b质粒时，生产多数甲基化酶并带有pDdeM1.6质粒的克隆存活率相当低。携带pDdeM1.6的RR1菌株生长到静止期时，其存活率只相当于单纯RR1菌株的6%(表Ⅱ)。最近已证明在某些E.Coli菌株中存在阻碍含胞苷甲基化酶的DNA导入的系统(Raleigh et al.，in press);负责此系统活性的位点已命名为“mcr B”(mdified cytosine restriction)。在RR1中这个位点是从E.Coli B中诱导出的，而且专一性不同，活性也明显地弱(Raleigh et al.，见上，Revel，H.R(1967)，Virology 31，688-701)。利用Tn 10的插入使mcr B失活可建立一套新的克隆菌株。我们将甲基化克隆导入到这套菌株中的ER1467中比较pDdeM3.0a、pDdeM3.0b、pDdeM1.6，只有ER1467完全恢复了生存能力。表Ⅱ中静止生长期时菌落形成单位(c.f.u)虽有数量上的差异但可忽略不计。因此，在ER1467菌株中已进一步克隆和确定其DdeⅠ系统的特性。
B.克隆核酸内切酶基因由于核酸内切酶和甲基化酶基因常紧密连续，因而有理由推测R.DdeⅠ基因位于甲基化酶基因邻近的区域。用从pDdeM3.0a中得到的3.0Kb HindⅢ片段作为探针，对脱硫脱硫弧菌基因组甲基化酶基因周围区段进行Southern杂交分析，结果见图4A。
核酸内切酶基因5′末端的专一性寡聚核苷酸探针已合成。
步骤1纯化DdeⅠ核酸内切酶达到均一性DdeⅠ核酸内切酶的纯化。
23克冰冻脱硫脱硫弧菌细胞团冻融后重悬浮于120ml超声波处理缓冲
液中(10m M KPO4，PH6.9，10mM β-巯基乙醇，0.1mM EDTA).，50mM Na Cl。下述所有步骤均在4℃下进行。加入溶菌酶，最终浓度为300μg/ml，超声波破碎细胞。裂解的细胞在10，000xg条件下离心45分钟。
120ml上清液装上2.5×15cm磷酸纤维素柱P11(Whatman)用超声波处理缓冲液和150mM Na Cl平衡。用700ml从150mM到1M Na Cl进行线性梯度洗脱，核酸内切酶大约在0.5M Na Cl时被洗脱。洗脱峰分段收集并用超声波处理缓冲液和50mM Na Cl进行透析。
170ml酶洗脱液装到1.5×15cm肝素-琼脂糖(Pharmacia)柱上用超声波处理缓冲液和25mM Na Cl平衡。用340ml从25mM到1M NaCl进行梯度洗脱，大约在0.5M Na Cl时酶可洗脱下来。将具有核酸内切酶活性的分段收集液收集到一起用HPLC缓冲液(20mM Tris，PH7.5，10mM β-巯基乙醇)和50mM KCl进行透析。
10ml酶收集液经过单级Q柱(Pharmacia)和多级SI柱(Pharmacia)后用50mM KCl装到1×8cm单级S株上，用50mM到1M KCl分段梯度洗脱出53ml洗脱液，核酸内切酶约在0.2M KCl时有一个单独的洗脱峰。
按下述方法对要进行蛋白质序列分析的样品进行液相层析处理。DdeⅠ核酸内切酶样品(15μg)放到色谱仪Vyadac CA214 TP54(5μm，4.6×300mm)的孔经为300埃的反相柱上进行层析，用5%乙腈加0.1%三氟醋酸以线性梯度展开25分钟，流速控制在1ml/分，在214nm进行观察。人工收集各个峰并冰冻干燥。
步骤2核酸内切酶探针的蛋白质序列分析和合成蛋白质的顺序降解是采用470A型实用生物系统气相色谱顺序分析仪完成的(Strickler，J.E.，Hunkapiller，M.W.and Willson，K.S.(1984)Analytical Biochemistry 140，553-566)。根据高效液相色谱IBM Cyano-柱(um，4.5×250mm)首先鉴定出19个异苯基硫脲醋苷。此方法是前人曾使用过的，在梯度上稍有修改(Hunkapiller，M.W.and Hood，L.E.(1983)in methods in Enzymology，Hirs，C.H.W.and Timasheff，S.N.Eds.，Vol.91，pp.486-493，Academic Press，New York)。
这个蛋白质顺序可用来推导出具有最小简并性的DNA顺序。该十四聚体可用DNA合成试剂盒(新英格兰生物实验室)来合成并通过在Water Associates C8(10μm，0.5×10cm)Radial Rak柱上层析加以提纯。
核酸内切酶的前19个氨基酸是Met-Lys-Ala-Ala-Thr-Asp-Gln-Glu-Leu-Arg-Lys-Leu-Ile-Val-Leu-Tyr-Asn-Asn-Val。根据画线部分推导出的DNA顺序5′-ATG-AAR-GCN-GCN-AC-3′(R核苷酸A或G;N核苷酸A、G、C或T)可制备出一个混合的十四聚体探针。基因组DNA的消化液与探针Southern杂交。已知不能杂交到核酸内切酶探针上的3.0kb HindⅢ片段含有甲基化酶基因。
Southern杂交1.用切口转移片段1-2μg基因组DNA用大于其20倍的下列核酸内切酶消化PstⅠ，SalⅠ，BglⅡ，BclⅠ，HindⅢ，EcoRⅠ，BamHⅠ(新英格兰生物实验室)依照所要求的条件进行反应。消化产物在琼脂糖凝胶中电泳，并将消化过的DNA用Southern法转移到硝化纤维素薄膜上(Southern，E.M.(1975)J.Mol，Biol.98，503-517)。
硝化纤维素薄膜用于与从pDdeM3.0a而来的3.0kb HindⅢ片段杂交。用下述的凝胶提纯法制备这种片段用20倍过量的HindⅢ消化pDdeM3.0a后在琼脂糖凝胶上电泳，凝胶浓度为1%，含0.5μg/ml溴化乙锭。将带有DdeⅠ甲基化酶基因的3.0kb片段从凝胶上切割下来，通过规格为21.5的针头将其糜化悬浮在Tris-乙酸缓冲液中，用SW型50.1转子(见克曼)在4℃下超速离心35分钟，速度为290，000xg。上清液加到0.4M Na Cl中用异丙醇沉淀DNA。重新悬浮DNA，用苯酚抽提两次，乙醇沉淀后重新悬浮在10mM Tris，1mM EDTA，PH.8.0中。6μl提取的DNA片段(1μg)加上100pmol α P-dATP(新英格兰生物实验室Ci/mmol)、1μl 10×缺口转移缓冲液(0.5M Tris，PH7.2，0.1M Mg SO4，1mM DTT，500μg/ml BSA)、1μl dGTP(1mM)、dTTP(1mM)、dCTP(1mM)混匀，再加入1μl E.Coli DNA聚合酶Ⅰ(新英格兰生物实验室)、1μl DNA酶Ⅰ(Sigma)稀释液(将3μl 3mg/ml储备液稀释到10ml水中)使1μg的该片段缺口转移。15℃温育2小时后加入50μl 20mM EDTA和200μl 10mM Tris，PH8.0，10mM EDTA，苯酯抽提一次，氯仿抽提一次。加入6μg蛙精DNA，用10mM Tris，PH8.0，1mM EDTA使总体积增至1ml。煮沸10分钟后将缺口转移的片段作为滤膜杂交之用。
杂交缺口转移探针之前，硝化纤维素滤膜要在预杂交混合液中在室温条件下预杂交4小时。预杂交混合液3ml 50×Oenharelt储备液(5g Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g BSA，H2O总体积500ml)，4.5ml 20×SSPE储备液(174g Na Cl、27.6g Na2HPO4·H2O、7.4g EDTA;用NaOH调到PH7.4，加水至1升)，0.3ml10% SDS，3ml 50%右旋硫酸盐、4.2ml H2O。
杂交时，将缺口转移探针加到预杂交的滤膜上(包括预杂交混合液)65℃温育过夜。杂交后的滤膜在室温下用2×SSPE(100ml)冲洗两次，约5分钟，再用2×SSPE加0.5% SDS55℃冲洗两次，30分钟。滤膜空气干燥后在X光片上曝光。
2.应用寡聚核苷酸探针1-2μg基因组DNA或0.5-1μg质粒DNA经消化后凝胶电泳，按前述方法转移到硝化纤维素滤膜上。按如下方法将滤膜与寡聚核苷酸探针杂交2μl探针(25-50μg/ml)加上2.5μl10X缓冲液(0.5mM Tris，PH7.6，0.1M Mg Cl2，50mM DTT，1mM亚精胺，1mM EDTA)15μl水，5μl γ-32P-ATP(New England Nuclear，3000Ci/mmol)，0.5μl多聚核苷酸激酶(新英格兰生物实验室或Boehringer Mannheim)，在一起混匀，37℃下温育30分钟。然后将该混合物加热到65℃，加热10分钟。标记探针中加上1ml 10mM Tris，PH8.0，1mM EDTA，然后加到预杂交过的硝化纤维素滤膜上室温温育过夜。
杂交后的滤膜在室温下用2X SSPE(200ml)冲洗两次，5分钟;2X SSPE加上0.5% SDS 30℃冲洗两次，30分钟。滤膜空气干燥后在X光片上曝光。
Soathern杂交的限制性图谱如图4B所示。两种酶消化得到的片段杂交到两种探针上，而且片段的大小足以编码甲基化酶基因和(或)核酸内切酶基因。图4A(a)画箭头的部位表明两个探针均杂交到PstⅠ单个片段上，这说明核酸内切酶基因和甲基化酶基因位于这段4.8kb的DNA片段内。另外，图4A(g)中标箭头的部位表明两个探针均杂交在HamHⅠ片段的5.3kb上，这个片段包括一部分甲基化酶基因并足以编码整个核酸内切酶基因。
将核酸内切酶基因和甲基化酶基因分别转移到适当的质粒上。将脱硫脱硫弧菌DNA的2.3kb BamHⅠ片段克隆到pACYC184(Chang and Cohen.J.Bacteriol，1341131(1978))，方法如下50μg脱硫脱硫弧菌DNA用BamHⅠ降解后电泳，大小合适的片段如前法凝胶电泳纯化，大约可得到100ng的DNA。将DNA片段连接到BamHⅠ切口，同时将pACYC184用牛胰碱性磷酸酶(Boehring Man)。脱磷酸化。用这个连接混合物转化带有M.DdeⅠ基因的pDdeM1.6的ER1467细胞。在含有100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素的L-琼脂平板上选择转化子。平板在37℃培养过夜。
5.筛选限制性核酸内切酶用消毒牙签随机挑捡50个转化子放入微滴培养皿(Nunc)，每个微皿含100μl L-broth，其中有100μg/ml氨苄青霉素，30μg/ml氯霉素。37℃培养6小时后，转化子重新涂布在6个含有氨苄青霉素、氯霉素及λ病毒噬菌体稀释液(104-108噬菌体/平板)的L-琼脂平板上。这些平板培养基在37℃培养过夜，单个转化子对噬菌体的限制大约在10水平。用转化子粗提液(见前法)来检定DdeⅠ核酸内切酶活性的存在。具体方法是向1μg p BR322(＝1μl)中加入5μl 10X dDdeⅠ缓冲液(100mM Tris，PH7.5，100mM Mg Cl2和1M Na Cl)、43μl H2O和1μ1粗提液，37℃温育30分钟，然后进行琼脂糖凝胶电泳。从克隆中提取的DNA初级限制性图谱表明这个2.3kb BamHⅠ片段是pDdeM1.6中BamHⅠ与HindⅢ重叠的部分，如图6所示。因此脱硫脱硫弧菌DNA2.9kb中包含了DdeⅠ系统。
实施例ⅡBamHⅠ限制修饰基因的克隆A.BamHⅠ甲基化酶基因的克窿及其活性特征1.淀粉芽孢杆菌H DNA的制备将5g新鲜的活细胞重新悬浮于含25%蔗糖、50mM Tris，PH8.0，10ml 0.25mM EDTA，PH8.0，6.0ml 10mg/ml溶菌酶(在0.25mM Tris，PH8.0中)混合物中，冰浴中放置2小时。其后加24ml裂解缓冲液(1%Triton X-100，50mM Tris，PH8.0 67mM EDTA)、5ml 10% SDS混匀使细胞裂解。加入等体积的苯酚(用100mM Tris，PH8.0平衡)振动使溶液乳化。加70ml氯仿摇10分钟。混合物以10K离心30分钟(贝克曼离心机)。含DNA的水层转移到干净瓶中重新用大于2倍体积的苯酚-氯仿抽提。
上层溶液用4×1升TE(10mM Tris，1mM EDTA PH8.0)透析24小时以上。透析后的DNA用0.1体积的RNA酶(10μg/ml)37℃处理1小时。加上5M Na Cl溶液，最终浓度到0.4MNa Cl，最后加2倍体积的乙醇。用玻棒搅起DNA用70%EDTA冲洗一次，然后重新溶解到15mlTE中，冰冻保存在-20℃中，DNA最终浓度＝100μg/ml。
2.部分消化2ml Bam DNA(100μg/ml)加到10个试管中;(200μg/管)内装有HindⅢ缓冲液(10mM Tris，PH7.5;10mM MgCl2、50mM NaCl、10mM巯基乙醇)。HindⅢ分别稀释到2X系列试管中，即1号管40单位、2号管20单位，依此类推。在37℃消化1小时，然后在72℃处理15分钟，使酶失活。每810μg消化物凝胶电泳分析一次。部分消化的样品收集备用。
3.连接将4μg HindⅢ消化的Bam DNA与2μg碱性磷酸酶处理过的pBR322(新英格兰生物实验室)连接，16℃下连接反应4小时。反应溶液总体积100μl，其中包括50mM Tris，PH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT，0.5mM ATP及1000单位的T4DNA连接酶(N.E.Biolabs);然后样品用氯仿处理分成10份，每一份转化200μl冰冻感受态RR1细胞(加50mM Ca Cl2)。42℃下细胞热激2分钟，稀释到5ml L-Broth中，37℃下生长到饱和。
4.离心收获转化细胞(4K，10分钟)并重悬浮于250μl L-Broth中，在加有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基上37℃培养过夜。用2.5ml 10mM Tris，PH7.5;10mM Mg Cl2将转化子从平板上洗脱下来。
5.冲洗下的混合物接种到500ml含100μg/ml氨苄青霉素的L-Broth中。37℃振荡培养过夜，再次离心收集(4K，5分钟)。细胞在室温下重新悬浮于10ml 25%蔗糖，50mM Tris，PH8.0中。加入5ml 0.25M EDTA，PH8和3ml 10mg/ml溶在水中的溶菌酶。溶液在40℃下放置1小时。然后用12ml裂解缓冲液使细胞悬液混匀。裂解液离心1小时(15K)。上清液用滤布挤滤。加入固体氯化铯(0.93g/ml)和溴化乙锭;浓度到100μg/ml。装入离心管平衡，在贝克曼超速离心机中离心48小时(44，000rpm17℃贝克曼Ti70转头)。用注射器收集溴化乙锭着色的DNA带。用2倍体积乙醇沉淀质粒并冷冻。12，000rpm离心20分钟收集质粒DNA。重新悬浮到1ml TE缓冲液的DNA用苯酚抽提一次，氯仿抽提一次，2倍体积乙醇沉淀后干燥，再重新悬浮到100μl TE缓冲液中。
6.Bam作用初级质粒库(约100μg DNA/100μl)在5×100μl反应液中逐级消化。反应液包括20μg质粒DNA、10mM Tris，PH7.5、10mM Mg Cl、100mM Na Cl;10mM β-巯基乙醇。第1管加100单位BamHⅠ(N.E Biolabs)、第二管加50单位，依此类推。试管在37℃下培养1小时。
7.转化按前述方法每10μl反应物转化100μl RR1细胞。转化混合物热处理2分钟后马上涂布在加氨苄青霉素的L琼脂平板培养基上37℃培养过夜。
后来的实验中发现限制性内切酶反应中用2.5单位的核酸外切酶Ⅲ(N.E.Biolabs)或10单位的碱性磷酸酶(Boehringer)处理可使转化子增加到103或104。存活率最低的平板大约也能检出200个菌落。
8.每个菌落接种到10ml加氨苄青霉素的L-Broth中和划线接种到加氨苄青霉素的LB平板上。
每个培养物的DNA微量提取有如下法10ml培养物离心收集(6K，5分钟)，而后重新悬浮在1ml 25mM Tris、10mM EDTA、50mM葡萄糖、PH8，1mg/ml溶菌酶中。室温放置10分钟后加入2ml 0.2M NaOH、1%SDS溶液，混匀后4℃下放置5分钟。加1.5ml 3M醋酸钠，PH.4.8混匀在冰浴中培养5分钟。混合物15K离心10分钟。例出上清液加入3.0ml异丙醇，室温放置10分钟后，15K离心10分钟。沉淀部分干燥后重新悬浮于0.85mlTE，75μl5M NaCl中，室温下用乙醇沉淀一次以上。用Eppendorf离心机离心1分钟。DNA干燥后重新悬浮于50μl含20μg/ml RNA酶的TE，PH8.0中。
每个制备出的质粒要测定其HindⅢ片段和对BamHⅠ核酸内切酶的抗性。
发现有四个菌落具BamHⅠ抗性含有大量HindⅢ片段。进一步分析这四个菌落，取每种克隆的少量细胞培养物(10ml)培养并制备整个染色体DNA(见第一部分)。四个克隆中，其中一个宿主DNA上带有抗BamHⅠ降解的抗性并被进一步用于实验。
9.甲基化测定按照实施例1所述方法对BamHⅠ提取物进行体外体内测定，所不同的是将体外测定所用的底物连接到BamHⅠ接头(dp CGGATCCG)(N.E.Biolabs)上的方法如下(1)连接IO.D单位的BamHⅠ衔接物，其100μl反应物中包括1000单位T4 DNA连接酶(N.E.Biolabs)、50mM Tris，PH8;20mM DTT，2mMATP，10mM Mg Cl 50g/ml牛血清白蛋白(Pentax)，室温下过夜。反应物在70℃下加热10分钟失活。每一甲基化酶反应物中加0.005 O.D单位的衔接物，反应物用[H]-S-腺苷甲硫氨酸标记。
体内测定按实施例所1述方法使用λ噬菌体进行。
甲基化酶克隆经测定未发现核酸内切酶活性。(除用10单位PstⅠ核酸内切酶切成线性的1μg p BR322底物外，粗提物核酸内切酶测定的操作方法与实施例1相同)。
B.核酸内切酶基因的克隆1.甲基化酶质粒图谱在人工控制的条件下用一系列的限制性核酸内切酶双消化已测定出HindⅢ片段的顺序(见图5)。
另外，由BamHⅠ核酸内切酶同源基因推导出的顺序制成的寡核苷酸探针(模拟Dde探针-见实施例1)被用来测定HindⅢ片段的顺序，其方法如下150μl反应液，其中包括15μg溶在10mM Tris，PH7.5中的Bam甲基化酶质粒、10mM Mg Cl、50mM Na Cl，混匀后加到9个试管中，首先将30μl 2单位的HindⅢ核酸内切酶(N.E.Biolabs)装入第一管，然后转移一半体积到第二管，依此类推，组成一系列酶稀释液。1小时后(37℃下温育)终止消化，消化液进行0.7%琼脂糖凝胶电泳。电泳产物按实施例1所述方法转移到硝化纤维素薄膜上与寡聚核苷酸探针杂交。如实施例1所述，探针是经T4多聚核苷酸激酶作用，用γ-32P-ATP(New England Nuclear)标记的。实验中发现2.2kb片段被杂交到探针上。
2.甲基化酶基因亚克隆图谱带甲基化酶基因(命名pDHⅠ)的质粒用Ca Cl2处理转化到HB101细胞中。依据第5部分所述将质粒DNA经氯化铯梯度提纯。
a)带pDHⅠ的HB101细胞被噬菌体λ467∶∶Tn5感染致使甲基化酶功能图谱被转座子诱变。详细内容见实施例Ⅰ。
b)甲基化酶基因被证明位于2.2kb HindⅢ片段上。100μg pDHⅠ DNA用HindⅢ消化完全后在制备型0.7%琼脂糖凝胶中电泳。紫外灯下可观察到2.2kb片段。用解剖刀切下该片段在IBⅠ型UEA电动洗脱分析仪上洗脱，条件遵从制造者的要求。洗下的片段沉淀在2倍体积乙醇中，沉淀重新悬浮在300μl TE中，苯酚抽提、氯仿抽提。用加0.2M Li Cl的乙醇沉淀。将DNA片段重新悬浮在100μl TE后在-20℃冷冻保存。
c)将2μg上述DNA片段连接到0.1μg p BR322-HindⅢ或0.1μg p UC19-HindⅢ上，两种质粒均经碱性磷酸酶处理过。连接反应在室温下过夜。连接混合液(连接的详细步骤见A-3部分)氯仿抽提一次后用来转化HB101感受态细胞。微量提取转化子并检测质粒的甲基化酶活性(见A-9部分)。带有2.2kb片段的pBR322和pUC19中有产生Bam甲基化酶的结构，这两个质粒被分别命名为p BH2和p DH3。
d)用标准方法做出p DH2图谱并且核酸内切酶探针也被杂交到该片段上[图6]。在HindⅢ位点上游约450bp的地方定位3XmnⅠ位点，与被寡核苷酸探针杂交部位紧密相邻。
10μg提纯的2.2kb片段用XmnⅠ核酸内切酶剧烈地消化，反应混合物用苯酚抽提，氯仿抽提、乙醇沉淀并重新悬浮。5μg提取到的DNA连接到经HindⅢ和SmaⅠ双重消化过的0.5μg p UC8上。用连接混合物转化感受态K802细胞。微量提取各种转化子观察其质粒的结构，体内检测其克隆的Bam甲基化酶活性。发现其中一个具有1.75kbHindⅢ-Xmn片段和甲基化酶活性(其它克隆中具有与核酸内切酶探针杂交上的0.45kb片段，没有Bam甲基化酶活性)。这个仍具有Bam甲基化酶活性且被缩短的结构命名为p DH5。
e)Bam染色体上核酸内切酶基因图谱。
纯化的淀粉芽孢杆菌DNA用一系列限制性核酸内切酶在标准条件下消化，消化产物在0.5%琼脂糖凝胶中电泳。如实施例1所述将DNA转移到硝化纤维素膜上。Southern杂交转移物被平行的杂交到激酶处理的Bam寡核苷酸探针上(顺序5′TCC(T)TTC(T)TCG(TCA)ACC(T)TCCAT3′)和缺口转移提纯的2.2kb片段上[缺口转移具体步骤见实施例1)。
虽然寡核苷酸探针杂交和洗涤操作上不够严格而且没有产生更多的专一性杂交，但很显然两部分被杂交到Bam染色体的同一区域上(图7)。特别是两种探针都杂交到Bam染色体中4.5kb HindⅢ片段上。
3.寻找核酸内切酶基因100μg纯化的Bam DNA用200单位的HindⅢ核酸内切酶消化完全，消化的DNA用0.5%琼脂糖凝胶电泳，切下后电动洗脱，方法如前所述。
将10μg经纯化的4.5kb片段连接到1μg经HindⅢ消化、碱性磷酸酶处理过的pACYC184载体上。氯仿处理后，连接物从100μl稀释到300μl。用100μl转化感受态K802细胞，此菌株曾用于转化pDH5。筛选出Am PRCamR转化子。用消毒牙签将其中350个挑捡到微滴培养皿中[Nunc]，培养皿中含100μl L-Broth+Amp+Cam(氯霉素;终浓度30μg/ml)，37℃下培养过夜。第二天用一个多孔接种装置将克隆印到LB+Amp+Cam平板上。平板在37℃培养过夜;50菌落/平板。
检验核酸内切酶活性7个主平板分别各用5ml超声波处理缓冲液(100mM Tris PH8.0，10mM巯基乙醇)冲洗平板表面的菌落。将细胞悬浮液离心，5K，10分钟。收集到的细胞再悬浮于0.5ml超声波处理缓冲液中。超声波处理细胞15秒。细胞用25μl溶菌酶(10mg/ml)、50μl 0.1M EDTA，PH7.0处理后冷冻，再冻融。弃去超声波处理的细胞碎片，加入10μl 1M Mg Cl2后低速离心(5分钟，Eppendorf)，用上述每一提取物取1μl消化1μg p BR322DNA，pBR322 DNA已在10μl PstⅠ反应混合物(10mM，Tris PH8.0，10mM Mg Cl2，100mM Na Cl)中切成线状。消化液经琼脂糖凝胶电泳，在第5号平板上可看到所预计的结果。因此，将每个菌落的细胞接种到5ml LB+Amp+Cam中培养过夜，收集后分别做BamHⅠ核酸内切酶活性测定。
另外，检测菌落的噬菌体抗性[见实施例Ⅰ]。其中发现一个菌落有Bam核酸内切酶活性。


所提供的两步克隆限制修饰系统的方法包括在宿主中引入修饰基因或甲基化酶基因并表达，为保护宿主细胞使引入的限制基因或核酸内切酶基因表达能力低于被引入的修饰基因。同时提供了与生产限制酶有关的方法及BamI和Dd eI限制基因的克隆。