专利名称：由红藻类制备无毒性紫外线屏蔽用提取物的方法及利用该方法的无毒性紫外线屏蔽剂的制作方法太阳紫外线不仅会引起以红斑为代表的急性皮肤反应，而且长时间暴露于太阳紫外线环境时，将引发皮肤老化和皮肤癌。到达地表上的太阳光线中包含的紫外线(Ultraviolet Ray,UV ray)根据波长大致划分为两个区域,分为长波UV-A (320nm_400nm)和中波 UV-B (280nm-320nm)o其中，当能量相对大的UV-B被皮肤层吸收时，将引发急性皮肤脱落、DNA变异或致癌。另一方面，据有关报告内容，UV-A的能量虽然小于UV-B，但相比UV-B，可渗透至皮肤更深层，引起早期皮肤老化现象，而且它将导致生成活性氧或者引发IL-I P和TNF-a等炎症症状，最终引起基因表达的变化，UV-A将激活NF-k B和AP-I等转录因子。因UV-A激活转录因子，将引发称为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP’ s)的一系列胶原蛋白溶解酶和弹力蛋白溶解酶，由此导致的胶原蛋白量的减少和纤维素的分段现象最终将引发典型的光老化现象。并且，UV-A很容易被作为皮肤色素体的尿刊酸(urocanicacid)或DNA等吸收，最终生成活性氧，与蛋白质和脂类等重要分子产生反应，从而破坏重要的生命分子或导致其丧失功能。UV-B的量随着不同季节、同一天的不同时间、云量、纬度等发生变化，而UV-A则是常年以比较恒定量到达地表上，因此，要想实现持续的皮肤护理，应更多地保护皮肤远离UV-A。为了保护皮肤免受紫外线的破坏而使用的紫外线屏蔽剂(Sunscreen)大致划分为无机粒子形态和有机化合物形态。无机粒子形态的紫外线屏蔽剂包括作为超微矿物粒子的氧化锌、二氧化钛、二氧化铁等类型的无机粒子，上述无机粒子粘附于皮肤表面，起到反射太阳光线(紫外线)的屏障作用。无机粒子形态的紫外线屏蔽剂可保持皮肤的清凉，防御自然的太阳光线(紫外线)，而且不会被皮肤吸收，因此，不会造成皮肤问题，但它会对皮肤造成厚重感，而且在皮肤上留下残留物。另一方面，有机化合物形态的紫外线屏蔽剂包含聚娃氧烧 _15 (Dimethico-diethylbenzalmalonate, Parsol)、苯甲酮(Sodium DihydroxyDimethoxy 0丨8111:1^0&6112(^116110116)、对氨基苯酸(口-4111；[110&61120；[。acid, PABA)等紫外线吸收性非常好的活性合成化合物，可阻挡UV-A渗透至皮肤深层并在胶原蛋白纤维或其他组织中引起老化的现象和由UV-B引起晒斑(Sunburn)或皮肤癌等现象,但容易引起皮炎或过敏，容易被溶解或生成活性氧。最近有报告还称，上述有机化合物可能引起包括内分泌系统障碍的副作用。因此，迫切需要开发一种不会对皮肤造成厚重感和因残留物导致的异物感，同时不会导致刺激性皮炎、接触性皮炎、光过敏性皮炎或光毒性皮炎等皮肤刺激或过敏反应以及毒性等副作用的紫外线屏蔽剂用天然素材
技术问题 本发明是为了解决上述的问题而提出的，本发明的一个目的是提供一种无光毒性或细胞毒性等并且因具有出色的紫外线吸收能力而能够作为紫外线屏蔽剂的主要成分使用的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法。并且，本发明的再一个目的是提供一种利用无毒性紫外线屏蔽用提取物的无毒性紫外线屏蔽剂。解决问题的手段 本发明的发明人经无数次实验发现，从红藻类中的紫菜和角叉菜中提取包含被认为是UV-A屏蔽物质的类菌胞素氨基酸(Mycosporine-like amino acids, MAA)的紫外线屏蔽用提取物时，相比从其他绿藻类、褐藻类及红藻类植物提取的情况，具有更高的产出率，还发现从上述紫菜和角叉菜中提取的紫外线屏蔽用提取物的光毒性及细胞毒性非常低，由此完成了本发明。为了达到本发明的一个目的，本发明提供一种无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法，其包括步骤(a)，准备好从紫菜或角叉菜中选择的一种以上红藻类；步骤(b)，在上述准备好的红藻类中添加碳原子数为I至5的酒精与水的体积比为1:9至9:1的混合溶齐[J，在30°C 60°C的温度保持以提取有效成分；以及步骤(C)，对包含上述有效成分及剩余红藻类固体成分的混合溶剂进行过滤来分离为上清液与剩余红藻类固体成分。优选地，本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法还可包括步骤(d)，在该步骤(d)中，使上述分离出的上清液通过薄膜过滤器，来去除杂质。并且，优选地，本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法还可包括步骤(e)，在该步骤(e)中，对上述分离出的上清液或去除杂质后的上清液进行浓缩和干燥，来获得固体化的粗提取物。并且，优选地，在上述固体化的粗提取物未经薄膜过滤器去除杂质的情况下，本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法还可包括步骤(f)，在该步骤(f)中，使上述固体化的粗提取物溶解于水并通过薄膜过滤器，来去除杂质。并且，优选地，本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法还可包括步骤(g)，在该步骤(g)中，使通过上述步骤(f)去除杂质后的粗提取物水溶液以水和碳原子数为I至5的酒精的浓度梯度展开，来获得吸收280nm 400nm的紫外线波长的粗提取馏分。此时，为了测量是否吸收紫外线波长，可使用紫外检测器(UV detector)，还可补充使用折射率(refractive index, RI)。并且，优选地，本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法还可包括步骤(h)，在该步骤(h)中，使上述粗提取馏分通过疏水性色谱柱，，来获得第一次提纯提取物。并且，优选地，本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法还可包括步骤(i)，在该步骤(i)中，使上述第一次提纯提取物通过大小排斥柱(Size ExclusionColumn)，来获得第二次提纯提取物。并且，优选地，本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法还可包括步骤(j )，在该步骤(j )中，对上述二次提纯提取物进行浓缩和干燥，来获得固体化的提纯提取物。为了达到本发明的再一个目的，本发明提供一种包含通过上述制备方法制备的无毒性紫外线屏蔽用提取物的无毒性紫外线屏蔽剂。此时，紫外线屏蔽用提取物含有类菌胞素氨基酸(Mycosporine-like amino acids, MAA)作为有效成分,所含类菌胞素氨基酸(Mycosporine-like amino acids, MAA)的种类有帕里盯(Palythine)、海燕属-330(Asterina-330)及施诺啉(Shinorine),还补充包含紫菜属-334 (Porphyra-334)。由于类菌胞素氨基酸(Mycosporine-like amino acids, MAA)具有环己酮(cyclohexanone)或环己胺(cyclohexenimine)色素体结构，因此,很好地吸收UV-A (320nm 400nm)区域的紫、外线，其吸光系数与人造紫外线屏蔽剂(Sunscreen)的吸光系数相似。发明的效果
本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法，由于使用紫菜或角叉菜作为提取原料，因此，含有类菌胞素氨基酸(Mycosporine-like amino acids, MAA)的紫外线屏蔽用提取物的产出率相对地明显高于从其他绿藻类、褐藻类及红藻类植物中提取时的产出率。并且，从紫菜或角叉菜中提取的紫外线屏蔽用提取物，由于其光毒性和细胞毒性非常低，不会对皮肤造成厚重感甚至由残留物导致的异物感，同时还可用作没有刺激性皮炎、接触性皮炎、光过敏性皮炎或光毒性皮炎等皮肤刺激或过敏反应以及毒性等副作用的紫外线屏蔽剂的主要成分。


图I表示本发明的一优选实施例的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法的流程。图2为表示根据利用人类红血细胞的光溶血试验法得出的从紫菜中提取的无毒性紫外线屏蔽用粗提取物(PE)和第二次提纯提取物(P7)的光毒性结果的曲线图。图3为表示从紫菜中提取的无毒性紫外线屏蔽用粗提取物(PE)的浓度为500 U g/ml时的、由利用人类红血细胞的光溶血试验法得出的光毒性结果的照片。图4为表示从紫菜中提取的无毒性紫外线屏蔽用第二次提纯提取物(P7)的浓度为250ii g/ml时的、由利用人类红血细胞的光溶血试验法得出的光毒性结果的照片。

在粗碎的紫菜或角叉菜等红藻类中添加提取溶剂，保持规定温度以提取有效成分。此时，使用水、酒精或者水与酒精的混合溶剂作为提取溶剂，优选地，使用酒精与水的体积比为1:9至9:1的混合溶剂，更优选地，使用酒精与水的体积比为4:1的混合溶剂。酒精与 水的体积比小于1:9的情况下，酒精含量过少，导致提取速度及提取产出率降低；而酒精与水的体积比大于9:1的情况下，酒精含量的增加带来的提取速度及提取产出率的增加率不高，导致经济性降低，酒精与水的体积比为4:1的情况下，提取速度、提取产出率及经济性表现最佳。酒精使用碳原子数为I至5的酒精，优选地使用甲醇或乙醇，更优选地使用甲醇。使用甲醇的情况下，其提取速度及提取产出率高于其他酒精。提取温度的范围不受到很大限制，优选地约为30°C 60°C。提取温度小于30°C的情况下，提取速度及提取产出率过低；提取温度超过60°C的情况下，导致部分酒精气化，而无法用于提取。通过过滤来分离上清液与剩金红藻类固体成分的步骤S3
利用提取溶剂提取完有效成分后，对包含有效成分及剩余红藻类固体成分的混合溶剂进行过滤，来分离为上清液与剩余红藻类固体成分。关于用于过滤的过滤材料，只要能够有效分离上清液与剩余红藻类固体成分，则其种类不受到很大限制，具体可使用过滤纸(Filter paper)或过滤布等,气孔大小约在0. I ii m 0. 005mm范围内。另一方面，完成第一次提取后，通过过滤而分离出的剩余红藻类固体成分中存在未提取的类菌胞素氨基酸(Mycosporine-like amino acids,MAA)等有效成分,为了提高最终提取产出率，将上述剩余红藻类固体成分添加至混合溶剂，反复进行一次至三次提取后通过过滤来分离上清液与剩余红藻类固体成分的过程。并且，虽然未在图I中表示，但本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法还可选择性地包含使分离出的上清液通过薄膜过滤器(Membrane filter)来去除杂质的步骤。薄膜过滤器是具有纳米大小的气孔(约小于IOOnm)的膜，起到一种从上清液去除包含在过滤上清液中的杂质或污染物质等的作用。从上清液获得固体化的粗提取物的步骤S4
对经过滤分离或薄膜过滤器处理后的上清液进行浓缩及干燥过程来实现固体化，从而获得粗提取物。优选地，上清液的浓缩采用减压浓缩方法，上清液的干燥采用冻结干燥方法。在采用减压浓缩方法的情况下，在低温条件下可容易使提取溶剂蒸发，采用冻结干燥方法的情况下，由于在低温条件下提取物实现固体化，因而能够防止提取物的有效成分在热作用下改性。制备固体化的耜.提取物水溶液并进行薄膜过滤器处理的步骤S5
将固体化的的粗提取物溶解于水，来制备粗提取物水溶液。另一方面，在粗提取物水溶液的粗提取物在其制备过程中未经薄膜过滤器处理的情况下，使粗提取物水溶液通过薄膜过滤器来去除杂质等。去除杂质后的粗提取物水溶液经过后述的分馏及提纯步骤。并且，虽未在图I中图示，但通过过滤来分离上清液与剩余红藻类固体成分的步骤S3中，经过滤及薄膜过滤器处理后的上清液也可进行后述的分馏及提纯处理。对耜.提取物水溶液进行分馏的步骤S6
使去除杂质后的粗提取物水溶液或在通过过滤来分离上清液与剩余红藻类固体成分的步骤S3中经过滤及薄膜过滤器处理后的上清液，以水和酒精的浓度梯度展开，从展开的粗提取物水溶液中，获得吸收280nm 400nm的紫外线波长的粗提取馏分。此时，酒精使用碳原子数为I至5的酒精，优选地使用甲醇。关于水-酒精浓度梯度的展开，具体例子 可以例举依次展开水、50体积％的酒精水溶液的方法。另一方面，为了测量展开的粗提取物水溶液或上清液中吸收80nm 400nm的紫外线波长的分馏部分，使用紫外检测器(UVdetector),还可补充使用折射率(refractive index, RI)。用疏水性色谱柱对耜.提取馏分进行第一次提纯的步骤S7
使所搜集的粗提取馏分通过疏水性色谱柱，来获得第一次提纯提取物。此时，使用的疏水性色谱柱其类型不受限制，具体而言，在由琼脂糖胶(agarose gel)、硅胶或有机高分子树脂形成的基体粒子的表面结合有从疏水性烷基、疏水性芳基、疏水性氰基及疏水性胺基构成的组中选择的一个疏水性官能团。疏水性烷基有丁基、辛基、十八烷基等；疏水性芳基有苯基乙基；疏水性氰1基有氰1基丙基；疏水性胺基有氣基丙基。并且，优选地，本发明使用的疏水性色谱柱的硅胶表面结合有从疏水性烷基、疏水性芳基、疏水性氰基及疏水性胺基构成的组中选择的一个疏水性官能团，作为这种疏水性色谱柱，市面上有日本资生堂公司的CAPCELL PAK C8, CAPCE11 PAk C18等。其中，CAPCELL PAK C18是在胶囊类型的硅胶的表面蒸镀(vacuum evaporation )娃(Si I icone )高分子来形成单层,在单层的表面结合十八烷基。尤其，在本发明中，使用CAPCELL PAK C18 UG120作为疏水性色谱柱的情况下，流动相(mobile phase)则使用醋酸水溶液。用大小排斥梓对第一次提纯提取物讲行第二次提纯的步骤S8
使第一次提纯提取物通过大小排斥柱(Size Exclusion Column),来获得第二次提纯提取物。此时，使用的大小排斥柱若可用于水溶性系统，则其类型不受很大限制，具体地可以是资生堂公司的二氧化硅基水溶系列大小排斥柱(KW-800系列、KW-400系列)、多羟甲基丙烯酸酯(Polyhydroxy Methacrylate)基的大小排斥柱(OHpak系列)等。从第二次提纯提取物获得固体化的提纯提取物的步骤S9
对第二次提纯提取物进行浓缩和干燥，来获得固体化的提纯提取物。特征在于，优选地，第二次提纯提取物的浓缩采用减压浓缩方法，干燥则采用冻结干燥方法。采用减压浓缩方法的情况下，在低温条件下可容易使水等溶剂蒸发，采用冻结干燥方法的情况下，由于在低温条件下提纯提取物实现固体化，因而能够防止提纯提取物的有效成分在热作用下改性。本发明的再一实施方式涉及一种利用通过本发明的制备方法制备的无毒性紫外线屏蔽用提取物的无毒性紫外线屏蔽剂。本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物含有类菌胞素氨基酸(Mycosporine-likeamino acids,MAA)作为有效成分，含有帕里盯(Palythine)、海燕属-330 (Asterina-330)及施诺啉(Shinorine)作为类菌胞素氨基酸(Mycosporine-like amino acids,MAA),选择性地还含有紫菜属-334(Porphyra-334)，因而UV-A吸收性能出色。并且,本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物(尤其是第二次提纯提取物)的光毒性或细胞毒性非常低，可用作无毒性紫外线屏蔽剂的主要成分 。有关紫外线屏蔽剂的具体组成，包含约0. 05 10重量％的本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物、约5 40重量％的乳状介质、约I 10重量％的乳化剂、微量的辅助剂以及余量的水等水状介质作为活性成分。乳状介质有链烧烃(paraffin)或矿物油等碳氢油、石腊(paraffin wax)、天然油、硅油、棕榈酸异丙酯等脂肪酸酯、硬脂醇等脂肪醇等，乳状介质构成“油中水”(water inoil)或“水中油”(oil in water)状态的乳状成分。乳化剂(Emulsifier)有山梨醇酯(Sorbitan eser,商标名SPAN)、乙氧基化山梨醇酯(Ethoxylated Sorbitan ester,商标名 Tween)、娃多兀醇(Silicone Polyol)、硬脂酸
钟、乙氧基化脂肪酸酷等。辅助剂有通常包含在紫外线屏蔽剂中的润滑剂(Emolient)、保湿剂、抗氧化剂、乳化稳定剂、增粘剂、防腐剂、芳香剂、着色剂等。以下，通过具体实施例对本发明进行更明确的说明。但下述实施例并不限定本发明的保护范围。I.提取原料的甄别
从国内海水中采取绿藻类(Green algae,绿藻门)、褐藻类(Brown algae,褐藻门)、红藻类(Red algae,红藻门)样本,使用滤纸去除水分后在乳钵进行粗碎,每个样本准备IOOg的提取原料。在IOOg提取原料中添加IOml的具有80体积％甲醇浓度的水溶液(由甲醇体积80及水体积20组成的混合溶剂)，在约45°C温度条件下使用搅拌机搅拌5分钟，提取有效成分后，使用过滤纸进行过滤，以约280nm 400nm波长的紫外线进行扫描，检索提取液的紫外线吸收能力。表I表示从绿藻类样本提取的提取液的紫外线吸收能力结果；表2表示从褐藻类样本提取的提取液的紫外线吸收能力结果；表3表示从红藻类样本提取的提取液的紫外线吸收能力结果。表I
蔡藻类种类I显示吸收峰值的紫外线波长(mn)
石莼(UlvalactucaL. )_未检狈J出_
孑 L 石莼(UlvapertUSAKj el Iman )_未检狈 J 出_
牡丹菜(UlvaconglobataKjellman )_未检狈 J 出_
表2
褐藻类种类I显示吸收峰值的紫外线波长(mn)
筛状孑L叶藻(AgarumcribrosomBory)_未检狈J出_
绳藻(Cordaf i IumLamouroux )未检测出
葡萄昆布(Ekloniastolonifera)_未检狈J出_
带形解氏藻(KjellmanielacrassifoliaMiyabe)未检测出


本发明提供一种无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法，该方法包括步骤(a)，准备好从紫菜或角叉菜中选择的一种以上红藻类；步骤(b)，在上述准备好的红藻类中添加碳原子数为1至5的酒精与水的体积比为1:9至9:1的混合溶剂，在30℃～60℃的温度保持以提取有效成分；以及步骤(c)，对包含上述有效成分及剩余红藻类固体成分的混合溶剂进行过滤来分离为上清液与剩余红藻类固体成分。本发明的无毒性紫外线屏蔽用提取物的制备方法，由于使用紫菜或角叉菜作为提取原料，因此，含有类菌胞素氨基酸的紫外线屏蔽用提取物的产出率相对地明显高于从其他绿藻类、褐藻类及红藻类植物中提取的产出率。并且，从紫菜或角叉菜中提取的紫外线屏蔽用提取物，由于其光毒性和细胞毒性非常低，不会对皮肤造成厚重感甚至由残留物导致的异物感，同时还可用作没有对刺激性皮炎、接触性皮炎、光过敏性皮炎或光毒性皮炎等皮肤刺激或过敏反应以及毒性等副作用的紫外线屏蔽剂的主要成分。