专利名称：一种用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物及其应用的制作方法一种用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物及其应用技术领域本发明属于生物检测领域，涉及一种用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物及其应用。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是一种地理分布和寄主范围均很广泛的革兰氏阳性细菌，在土壤、水体、植物、牛奶、人畜肠道中都可以被发现。凝结芽孢杆菌耐热，耐酸，耐盐，可以形成芽孢；能分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。1989年美国FDA公布的41种可用于饲料的安全菌株及1992年再次批准42种中(包括的5种芽孢杆菌)，凝结芽孢杆菌排在第一位。该种菌具有一定的纤维素分解能力。凝结芽孢杆菌在工业上可以用来生产乳酸，在农业方面可以饲料添加剂，在医药方面是极具潜力的益生菌。但有些时候它也是令人头疼的有害菌，其会导致果酱和蔬菜酱等罐头产品的酸败以及牛奶的凝结。因而发展快速、准确的检测方法对凝结芽孢杆菌的应用研究会很有帮助。PCR检测方法速度快、灵敏度高、成本低，是当前细菌鉴定中一种快速有效的方法。但此前国内外尚未公布凝结芽孢菌的全基因组序列，故没有从样品DNA中扩增出凝结芽孢杆菌靶标序列的特异性引物。发明内容本发明是为了解决目前缺乏引物从样品DNA中扩增出凝结芽孢杆菌靶标序列的问题，提供一种用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物。一种用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物BCF/BCR，正向引物BCF 序列为gatcattttcttccatggtatg(SEQ ID No. 1)，反向引物 BCR 序列为 gaaacgatggcgctggatac(SEQ ID No. 2)。所述的用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物在凝结芽孢杆菌的分子检测中的应用。有益效果相对于使用常规通用引物扩增后还需测序、比对等繁琐的步骤才能判断菌株的类型，使用该特异性引物来扩增凝结芽孢杆菌中异常保守的comK基因，可直接根据是否扩增出comK基因来判断是否是凝结芽孢杆菌，这样既节约了实验成本，也将大大加快实验的进程。本发明的引物是根据凝结芽孢杆菌comK基因存在特异性的特点而设计的。应用本发明的引物BCF/BCR可从各类样品DNA中直接扩增出长度大约为400bp的凝结芽孢杆菌目的片段。


图1为实施例1中BCF/BCR引物对10种属细菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。
其中，M泳道为标准marker DL2000,1-9号泳道为9株凝结芽孢杆菌的扩增结果，10-17号泳道分别为含有枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、链霉菌属(Streptomyces)、鞘月旨单胞菌属(Sphingomonadales)、红球菌属(Rhodococcus) 克氏菌(BurW10Ideria)属DNA的扩增结果，18号泳道为空白对照的扩增结果。
图2为实施例2中BCF/BCR弓丨物对土壤样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。
其中，M泳道为标准DL2000，1-4号泳道分别为河北廊坊市土壤样品DNA的扩增结果，5-8号泳道分别为湖北武汉市土壤样品DNA的扩增结果，9号泳道为空白对照的扩增结^ ο
实施例1
分别以凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) (9个不同菌株)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、链霉菌属(Sti^ptomyces)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonadales)、红球菌属(Rhodococcus)细菌DNA为模板进行引物BCF/BCR的特异性验证试验。
PCR扩增体系为25 μ L由0. 5 μ L DNA模板(约IOng)、0. 5 μ L正向引物 BCF(10yM)、0.5yL 反向引物 BCR(10 μ Μ)、0· 5 μ L dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L IOXPCR buffer (withMgC12)、0· 2 μ 1 TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)，灭菌双蒸水补足 25 μ L。PCR 扩增反应条件为预变性95°C 5min，变性94°C 30s，退火60°C 30s，延伸72°C 45s，共35个循环， 72°C 延伸 5min，4°C 保存。
将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，从图1中可以看出本实施方式用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物BCF/BCR能够准确的扩增出凝结芽孢杆菌的靶标序列片段，而未能从其他属细菌DNA和空白对照中扩增出核酸片段。将1-9号泳道对应的序列片段于T载体连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞、测序， 序列长度大约为400bp，并且经blast分析，为凝结芽孢杆菌comk基因的特异序列。
实施例2
应用引物BCF/BCR对8份土样(采自河北廊坊市和湖北武汉市)DNA进行PCR扩增试验。PCR扩增体系为25yL由IyL DNA模板(约IOng)、1 μ L正向引物BCF (10 μ M)、 1 μ L反向引物BCR(10 μ Μ)、12. 5 μ L，灭菌双蒸水补足25 μ L。PCR扩增反应条件为预变性 950C 3min，变性 94°C 30s，退火 59°C 30s，延伸 72°C 45s，共；35 个循环，72°C延伸 5min，4°C保存。
将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，从图2中可以看出本实施方式用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物BCF/BCR能够准确的扩增出所有土壤样品DNA中的凝结芽孢杆菌的靶标序列片段。随机挑选1、3、5、7号泳道对应的序列片段分别于T载体连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞测序，测序结果为序列长度大约为400bp，blast分析结果显示皆为凝结芽孢杆菌comk基因的特异序列。


本发明属于生物检测领域，公开了一种用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物及其应用。用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物BCF/BCR，正向引物BCF序列为SEQ ID No.1，反向引物BCR序列为SEQ ID No.2。所述的用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物可在凝结芽孢杆菌的分子检测中应用。本发明的引物是根据凝结芽孢杆菌comK基因存在特异性的特点而设计的。应用本发明的引物BCF/BCR可从各类样品DNA中直接扩增出长度大约为400bp的凝结芽孢杆菌目的片段。