专利名称：表达mpd基因的玫瑰红红球菌及其构建方法我国是一个农业大国，农药的生产量和使用量均呈逐年递加之势。农药在农业生产上的大量应用，对于防治农作物病虫害方面起到了极其重要的作用，为粮食丰收提供了可靠的保证。但是长期大量地使用农药使得环境中的农药污染日益严重，危及人们身体健康、食品安全及其他环境问题。有机磷类农药得到长期、广泛、大量的应用，其中毒死蜱是世界上使用量最大的农药之一。在我国，毒死蜱是甲胺磷和甲基对硫磷等高毒农药的新型高效、低毒替代品种，生产量和使用量很大。虽然毒死蜱是低毒的农药，但是使用量之大、使用范围之广，已对我国大部分地区的土壤、水体造成了严重的污染。存储在土壤、水体中的毒死蜱不仅对动植物、微生物等生命体产生毒害作用，而且，毒死蜱还直接和间接地影响了人类的健康，所以，需要研发高效清除毒死蜱等有机磷残留污染的生态修复技术，为农业安全生产和环境安全提供技术支持和参考。已经报道采用降解毒死蜱的酶来清除环境中的毒死蜱残留，但这种技术的效率不高，只能进行小规模试用。采用基因工程技术构建高效降解菌株，将会提高降解效率，为污染环境的生物修复提供可实用的材料。本发明的菌种已按专利法实施细则第二十五条第三款的规定在国家知识产权局专利局指定的保藏单位——中国典型培养物保藏中心保藏，地址中国武汉武汉大学；玫瑰红红球菌rhodochrous R-D3)菌株的保藏日期2010年9月15日，保藏号CCTCC M 2010232，并附具存活性报告书；微嗜酸寡养单胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的保藏日期2010年9月15日，保藏号CCTCC M 2010231，并附具存活性报告书。
为了解决农药污染的生物修复问题，本发明提供一种生物材料及构建方法，即用于降解毒死蜱的一种表达mpd基因的玫瑰红红球菌及其构建方法。表达mpd基因的玫瑰红红球菌从-miModococcus rhodochrous R-D3)，其基因核苷酸序列如下ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG8TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCC GGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTG A0 表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的构建方法包括以下操作步骤2.1提取微嗜酸寡养单胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的基因组 DNA ；2.2以所述基因组DNA为模板PCR扩增微嗜酸寡养单胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的mpd基因，扩增引物序列如下 正向5，-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3， 反向5’ -GAATTCTCGAGCTTGGGTTGACGACCG-3，PCR扩增反应参数
预变性94 °C5分钟，
变性94 °C1分钟，
复性58 °C1分钟，
延伸72 °C1分钟，
循环30个，
终止延伸72 °C10分钟，
得到微嗜酸寡养单胞菌Gl菌株的PCR产物，简称为Gl菌株的PCR产物； 将Gl菌株的PCR产物通过1%琼脂糖电泳检测，回收片段大小11Λ的Gl菌株的PCR产
物；
2. 3将片段大小11Λ的Gl菌株的PCR产物与大肠杆菌质粒pET48a(+)连接，构建测序重组质粒pET-C，操作方法如下 2.3. 1酶切Gl菌株的PCR产物
用限制性内切酶》10 KNde I酶切片段大小11Λ的Gl菌株的PCR产物，酶切条件如
下
限制性内切酶Xhο I0. 5uL
限制性内切酶Nde I0. 5uL
Gl菌株的PCR产物如L
10倍的酶切缓冲液(H Buffer)2 uL
双蒸水(ddH20)13uL
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍上样缓冲液(10XLoading Buffer)终止酶反应；得到Gl菌株的PCR产物的酶切产物； 2.3.2回收将Gl菌株的PCR产物的酶切产物通过1%琼脂糖电泳检测，回收11Λ的Gl菌株的PCR 产物的酶切片段；
2. 3. 3酶切大肠杆菌质粒pET48a(+)
用限制性内切酶》io I ,Nde I酶切pET_28a(+)质粒，酶切条件如下
限制性内切酶Uho I)0. 5uL
限制性内切酶(Nde I)0. 5uL 大肠杆菌质粒pET48a(+) 4uL
10倍的酶切缓冲液(H Buffer)2 uL
双蒸水(ddH20)13uL
37°C水浴4h，加入1/10体积的10倍上样缓冲液(10XLoading Buffer)终止酶反应； 得到酶切的大肠杆菌质粒pET48a(+)； 2. 3. 4连接
用连接试剂盒试剂将所述11Λ的的Gl菌株的PCR产物的酶切片段和酶切的大肠杆菌质粒pET18a(+)连接起来；连接条件如下
酶切的大肠杆菌质粒pET-28a (+)IuL
Gl菌株的PCR产物的酶切片段1 μ L
双蒸水(ddH20)3μ L
溶液 I (Solusion I)5μ L
冰浴加样，混勻后16°C、30分钟，即为测序重组质粒pET-C连接反应液； 2. 3. 5大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
2.3.5. 1将大肠杆菌DHlOB接种于50ml的LB培养基中，温度37°C，摇床培养16小时， 得到培养物；
2.3.5.2取3mL培养物转接于300mL LB培养基中，在温度37°C的摇床上剧烈振荡培养 2. 5-3 小时，使其光密度=0. 4-0. 5 (0D600=0. 4-0. 5)；
2. 3. 5. 3将浓度0. 5mmol/L的氯化钙(CaCl2)溶液置于冰上预冷，分装6支50ml离心管，冰浴5分钟，4°C、1600g离心7分钟；
2. 3. 5. 4弃去上清，加入7mL预冷浓度0. 5mmol/L的氯化钙(CaCl2)溶液，轻轻悬浮细胞，在冰放置10分钟；4°C下IlOOg冷冻离心5分钟；
2. 3. 5. 5弃去上清，加入7mL预冷浓度0. 5mmol/L的氯化钙(CaCl2)溶液，轻轻悬浮细胞，在冰放置30分钟；4°C下IlOOg冷冻离心5分钟；
2. 3. 5. 6倾去上清液，加入1. 4ml浓度0. 5mmol/L的氯化钙(CaCl2)溶液，其中甘油浓度为10%，悬浮离心后沉淀的细胞，分别取悬浮的细胞100 μ 1分装到1. 5ml离心管中，将离心管_70°C保存，即为大肠杆菌DHlOB感受态细胞；
2. 3. 5. 7将10 μ 1所述测序重组质粒pET-C连接反应液加入到100 μ 1大肠杆菌DHlOB 感受态细胞中；
2. 3. 5. 8轻轻摇勻，冰上放置10分钟，充分混勻； 2. 3. 5. 9温度42 °C水浴中热击2分钟；
2. 3. 5. 10加入890 μ 1 LB液体培养基，混勻，37°C振荡培养1小时，使细胞恢复正常生长状态；得到大肠杆菌DHlOB菌液；2. 3. 5. 11分别取大肠杆菌DHlOB菌液100 μ 1涂布于含卡那霉素50mg/L的LB培养基平板，温度37°C、培养16 19小时，观察转化结果；
2.3.5. 12平板上长出的菌落即为转化子，提取转化子中的测序重组质粒pET-C，用限制性内切酶》io I ,Nde I酶切测序重组质粒pET-C，条件同上述2. 3. 3酶切大肠杆菌质粒 pET-28a(+)步骤，电泳图谱显示分别为11Λ和5. 3kb的条带，证明测序重组质粒pET_C构建正确；
2. 4测定测序重组质粒pET-C中mpd基因核苷酸序列，获得测序重组质粒pET_C中mpd 基因核苷酸序列如下
ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCG GCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA 2. 5构建表达重组质粒pDA71-C
2. 5.1用PCR扩增的方法从测序重组质粒pET-C中克隆mpd基因，扩增测序重组质粒 pET-C上mpd基因的PCR扩增引物如下
正向5，- CG TCTAGAATGCCCCTGAAGAACCGCT-3， 反向5’ - CGGGTACCTCACTTGGGGTTGACGACC-3’ PCR反应参数
预变性94 °C5分钟，
变性94 °C1分钟，
复性56 °C1分钟，
延伸72 °C1分钟，
循环30个，
终止延伸72 °C10分钟，
得到测序重组质粒PET-C的PCR产物；
2. 5. 2构建表达重组质粒pDA71-C
2. 5. 2. 1回收测序重组质粒pET-C的PCR产物
用1%琼脂糖电泳检测扩增的测序重组质粒PET-C的PCR产物，回收11Λ的测序重组质粒pET-C的PCR产物片段；
2. 5. 2. 2酶切测序重组质粒pET-C的PCR产物用两种限制性内切酶Kpn K Xba I分别酶切所述的测序重组质粒pET-C的PCR产物片段，酶切条件如下
测序重组质粒PET-C的PCR产物片段5 μ L
10倍的酶切缓冲液(10XL Buffer)2μ L
限制性内切酶KpnI0. 5yL
无菌水补至20 μ L
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍上样缓冲液，1%琼脂糖凝胶电泳，回收11Λ的测序重组质粒PET-C的PCR产物的第一次酶切产物； 第二次酶切条件如下
回收的11Λ测序重组质粒pET-C的PCR产物的第一次酶切产物 IOuL 10倍的酶切缓冲液(M Buffer)2 μ L
限制性内切酶)(ba I0. 5uL
无菌水补至20 μ L
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍的上样缓冲液(10X Loading Buffer), 1%琼脂糖凝胶电泳，回收11Λ的测序重组质粒pET-C的PCR产物的第二次酶切产物； 2. 5. 2. 3 酶切质粒pDA71 (美国标准菌种典藏中心American Type Culture Collection,缩写 ATCC，检索号 77474)
用两种酶Kpn I ,Xba I分别酶切质粒pDA71，酶切条件如下 质粒 pDA715μ L
10倍的酶切缓冲液(10 X L buffer )2 μ L
限制性内切酶KpnI0. 5yL
无菌水补至20 μ L
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍的上样缓冲液(10X Loading Buffer), 1%琼脂糖凝胶电泳，回收质粒PDA71的第一次酶切产物； 第二次酶切条件如下
回收的质粒PDA71的一次酶切产物10 μ L
10倍的酶切缓冲液(IOXM buffer)2μ L
限制性内切酶)(ba I0. 5yL
无菌水补至20 μ L
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍的上样缓冲液(10X Loading Buffer),
琼脂糖凝胶电泳，回收质粒PDA71的第二次酶切产物； 2. 5. 2. 4 连接
用连接试剂盒将所述质粒PDA71的第二次酶切产物和测序重组质粒pET-C的PCR产物的第二次酶切产物连接，构建表达重组质粒PDA71-C ；连接条件如下 质粒PDA71的第二次酶切产物如L
测序重组质粒PET-C的PCR产物的第二次酶切产物如L 10 倍连接缓冲液(10XLigase Buffer)IuL
T4 DNA 连接酶(Ligase)IuL,
16°C水浴12 - 16小时，即得表达重组质粒pDA71-C连接产物，表达重组质粒pDA71_C连接产物中含有降解农药毒死蜱的mpd基因；
2. 5. 2. 5用表达重组质粒pDA71-C连接产物转化大肠杆菌DHlOB感受态细胞大肠杆菌DHlOB感受态细胞的制备方法如上述2. 3. 5. 1 2. 3. 5. 6步骤； 用表达重组质粒PDA71-C连接产物转化大肠杆菌DHlOB感受态细胞，将10 μ 1表达重组质粒PDA71-C连接产物加入到100 μ 1大肠杆菌DHlOB感受态细胞中；操作方法如上述第 2. 3. 5. 8 2. 3. 5. 12步骤，但在第2. 3. 5. 11步骤中需用氨苄青霉素50mg/L取代卡那霉素， 获得带有表达重组质粒PDA71-C的转化子；
采用公知的方法从带有表达重组质粒PDA71-C的转化子中提取表达重组质粒 PDA71-C，具体提取方法如下
将一环表达重组质粒PDA71-C的转化子接种到3mL含有氨苄青霉素(50mg/L)的LB液体培养基，37°C振荡培养过夜；取1. 5mL菌液加入离心管中，4°C下lOOOOr/min离心Imin ； 弃上清，将管倒置吸水纸上，使液体流尽；
加入150μ 1用冰预冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris-Cl)pH 8.0,10 mM/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0)，剧烈振荡，重新悬浮菌体沉淀， 室温放置;T5min ；加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2mo 1/L氯化钠(NaOH)，1%十二烷基硫酸钠(SDS))，温和混勻，切勿剧烈振荡，室温5min ；加入450 μ 1预冷的溶液III (乙酸钾溶液，pH 4. 8)，反复颠倒数次，温和混勻，室温5 IOmin ； 12000r/min离心5min ；
将上清液转入干净的1. 5mL离心管中，加入1. 5倍体积预冷无水乙醇，冰上放置10分钟，然后12000r/min离心IOmin ；彻底弃去上清液，沿壁加入ImlL 70%乙醇漂洗沉淀，颠倒数次，立即去上清，自然干燥；将沉淀物溶于30μ1 TE缓冲液(10mM/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris .Cl)，ImM/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0，含 20μ g/mL 的核酸酶 RNaseA))中，37°C 保温30min后即为表达重组质粒pDA71-C ；
采用与上述第2. 5. 2.3节中)(ba I酶切、Kpn I酶切同样的条件酶切表达重组质粒 PDA71-C，琼脂糖电泳显示两个条带，大小分别为11Λ和6. 21Λ，分别为微嗜酸寡养单胞菌Gl菌株的mpd基因和微嗜酸寡养单胞菌Gl菌株的pDA71质粒载体，证明表达重组质粒 PDA71-C构建正确；
2. 5. 2. 6 玫瑰红红球菌 R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的转化 2. 5. 2. 6. 1玫瑰红红球菌R-D3菌株电转化感受态细胞的制备 2. 5. 2. 6. 1. 1按1%的接种量将玫瑰红红球菌R-D3菌株接种到IOOmL的LB培养基中， 温度30°C，培养18-M小时，得到玫瑰红红球菌R-D3菌株的扩大培养物，简称R-D3菌株的扩大培养物；
2. 5. 2. 6. 1. 2取IOmL R-D3菌株的扩大培养物，4000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，收集细胞，用4°C的无菌水洗涤1次，再用4°C 10%甘油洗涤2次；
2. 5. 2. 6. 1. 3离心2次后，弃去上清液，用ImL浓度10%的甘油重悬，得到玫瑰红红球菌R-D3菌株感受态细胞；
2. 5. 2. 6. 2用表达重组质粒pDA71-C电转化玫瑰红红球菌R-D3菌株感受态细胞，步骤如下
2. 5. 2. 6. 2. 1取1 μ L表达重组质粒pDA71_C与80 μ L的玫瑰红红球菌R-D3菌株感受态细胞混合，移入电击杯中，冰浴10分钟；将电击杯置于电击槽中电击，电击参数电击杯0. 2cm,电压2. OkV，电击时间3. 5ms ；
2. 5. 2. 6. 2. 2电击完毕，立即向杯中加入420 μ L的LB培养液，温度30°C、振荡培养3 小时，即为电击转化产物；
2. 5. 2. 6. 2. 3将电击转化产物涂布含50 μ g/mL氨苄青霉素和200mg/L农药毒死蜱乳油制剂的牛肉膏蛋白胨平板，30°C培养5天；
2. 5. 2. 6. 3玫瑰红红球菌R-D3中mpd基因表达的检测
平板上出现菌落，有的菌落周围出现透明的水解圈，有的菌落周围没有透明的水解圈； 有透明水解圈者，是由于这些菌落中的细胞的mpd基因表达，降解农药毒死蜱，因而形成透明的水解圈；证明微嗜酸寡养单胞菌Gl菌株的mpd基因在这些菌落的细胞中表达，降解农药毒死蜱，出现水解圈；这些菌落即为表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3 (.Rhodococcus rhodochrous R-D3)。本发明的有益技术效果体现在以下方面
1、表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3可以快速降解水体中的农药毒死蜱残留。在含有农药毒死蜱100mg/L的水中，添加构建的带有mpd基因的玫瑰红红球菌菌液，采用GC2010 岛津气相色谱测定，与没有添加玫瑰红红球菌菌液的对照比较二4小时内毒死蜱的降解达 70 %以上，说明构建的带有mpd基因的玫瑰红红球菌具有高效降解水中农药毒死蜱残留的能力。2、表达mpd基因的玫瑰红红球菌可以快速降解土壤中的农药毒死蜱残留。取2份土壤样品，模拟土壤中农药毒死蜱残留达200mg/kg;在其中一份土壤样品中加入表达mpd 基因的玫瑰红红球菌基因工程菌株菌液，另一份不加菌液为对照。将这2份土壤样品在 30°C培养2天，用GC2010岛津气相色谱测定，与对照比较，24小时内毒死蜱的降解达80% 以上，说明构建的带有mpd基因的玫瑰红红球菌能够快速降解土壤中的高浓度农药毒死蜱残留。

表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的基因序列如下ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTTGC ACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGATGC TGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGCCG GCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTCGT CAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGCGG CCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACGTG GGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTCTG GCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCTGA ACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGGCC AGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGACCT GATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGCGGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCGGC ATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA。
表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3的构建方法包括以下操作步骤
表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的构建方法， 其特征在于包括以下操作步骤
2.1提取微嗜酸寡养单胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的基因组 DNA ；
2.2以所述基因组DNA为模板PCR扩增微嗜酸寡养单胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的mpd基因，扩增引物序列如下 正向5，-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3， 反向5’ -GAATTCTCGAGCTTGGGTTGACGACCG-3， PCR扩增反应参数 预变性94 °C
变性94 °C
复性58 °C
延伸72 °C
循环30个，
终止延伸72 °C
称为Gl菌株的PCR产物；
将Gl菌株的PCR产物通过1%琼脂糖电泳检测，回收片段大小11Λ的Gl菌株的PCR产
物；
2. 3将片段大小11Λ的Gl菌株的PCR产物与大肠杆菌质粒pET48a(+)连接，构建测序重组质粒pET-C，操作方法如下 2.3. 1酶切Gl菌株的PCR产物
用限制性内切酶》10 KNde I酶切片段大小11Λ的Gl菌株的PCR产物，酶切条件如
下
限制性内切酶》ιο I0. 5uL
限制性内切酶Nde I0. 5uL
Gl菌株的PCR产物如L
10倍的酶切缓冲液(H Buffer)2 uL
双蒸水(ddH20)13uL
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍上样缓冲液(10XLoading Buffer)终止酶反应；得到Gl菌株的PCR产物的酶切产物； 2.3.2回收
将Gl菌株的PCR产物的酶切产物通过1%琼脂糖电泳检测，回收11Λ的Gl菌株的PCR 产物的酶切片段；
2. 3. 3酶切大肠杆菌质粒pET48a(+)
用限制性内切酶》io I ,Nde I酶切pET_28a(+)质粒，酶切条件如下 限制性内切酶(Xho I)0. 5uL
5分钟， 1分钟， 1分钟， 1分钟，
10分钟，得到微嗜酸寡养单胞菌Gl菌株的PCR产物，简
15限制性内切酶(Nde I)0. 5uL 大肠杆菌质粒pET48a(+) 4uL
10倍的酶切缓冲液(H Buffer)2 uL
双蒸水(ddH20)13uL
37°C水浴4h，加入1/10体积的10倍上样缓冲液(10XLoading Buffer)终止酶反应； 得到酶切的大肠杆菌质粒pET48a(+)； 2. 3. 4连接
用连接试剂盒试剂将所述11Λ的的Gl菌株的PCR产物的酶切片段和酶切的大肠杆菌质粒pET18a(+)连接起来；连接条件如下
酶切的大肠杆菌质粒pET-28a (+)IuL
Gl菌株的PCR产物的酶切片段1 μ L
双蒸水(ddH20)3μ L
溶液 I (Solusion I)5μ L
冰浴加样，混勻后16°C、30分钟，即为测序重组质粒pET-C连接反应液； 2. 3. 5大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
2.3.5. 1将大肠杆菌DHlOB接种于50ml的LB培养基中，温度37°C，摇床培养16小时， 得到培养物；
2.3.5.2取3mL培养物转接于300mL LB培养基中，在温度37°C的摇床上剧烈振荡培养 2. 5-3 小时，使其光密度=0. 4-0. 5 (0D600=0. 4-0. 5)；
2. 3. 5. 3将浓度0. 5mmol/L的氯化钙(CaCl2)溶液置于冰上预冷，分装6支50ml离心管，冰浴5分钟，4°C、1600g离心7分钟；
2. 3. 5. 4弃去上清，加入7mL预冷浓度0. 5mmol/L的氯化钙(CaCl2)溶液，轻轻悬浮细胞，在冰放置10分钟；4°C下IlOOg冷冻离心5分钟；
2. 3. 5. 5弃去上清，加入7mL预冷浓度0. 5mmol/L的氯化钙(CaCl2)溶液，轻轻悬浮细胞，在冰放置30分钟；4°C下IlOOg冷冻离心5分钟；
2. 3. 5. 6倾去上清液，加入1. 4ml浓度0. 5mmol/L的氯化钙(CaCl2)溶液，其中甘油浓度为10%，悬浮离心后沉淀的细胞，分别取悬浮的细胞100 μ 1分装到1. 5ml离心管中，将离心管_70°C保存，即为大肠杆菌DHlOB感受态细胞；
2. 3. 5. 7将10 μ 1所述测序重组质粒pET-C连接反应液加入到100 μ 1大肠杆菌DHlOB 感受态细胞中；
2. 3. 5. 8轻轻摇勻，冰上放置10分钟，充分混勻； 2. 3. 5. 9温度42 °C水浴中热击2分钟；
2. 3. 5. 10加入890 μ 1 LB液体培养基，混勻，37°C振荡培养1小时，使细胞恢复正常生长状态；得到大肠杆菌DHlOB菌液；
2. 3. 5. 11分别取大肠杆菌DHlOB菌液100 μ 1涂布于含卡那霉素50mg/L的LB培养基平板，温度37°C、培养16 19小时，观察转化结果；
2.3.5. 12平板上长出的菌落即为转化子，提取转化子中的测序重组质粒pET-C，用限制性内切酶》io I ,Nde I酶切测序重组质粒pET-C，条件同上述2. 3. 3酶切大肠杆菌质粒 pET-28a(+)步骤，电泳图谱显示分别为11Λ和5. 3kb的条带，证明测序重组质粒pET_C构建正确；
2. 4测定测序重组质粒pET-C中mpd基因核苷酸序列，获得测序重组质粒pET_C中mpd 基因核苷酸序列如下
ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCG GCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA 2. 5构建表达重组质粒pDA71-C
2. 5.1用PCR扩增的方法从测序重组质粒pET-C中克隆mpd基因，扩增测序重组质粒 pET-C上mpd基因的PCR扩增引物如下
正向5，- CG TCTAGAATGCCCCTGAAGAACCGCT-3， 反向5’ - CGGGTACCTCACTTGGGGTTGACGACC-3’ PCR反应参数
预变性94 0C5分钟，变性94 0C1分钟，复性56 0C1分钟，延伸72 0C1分钟，循环30个，
终止延伸72 °C10分钟，
得到测序重组质粒PET-C的PCR产物； 2. 5. 2构建表达重组质粒pDA71-C 2. 5. 2. 1回收测序重组质粒pET-C的PCR产物
用1%琼脂糖电泳检测扩增的测序重组质粒PET-C的PCR产物，回收11Λ的测序重组质粒pET-C的PCR产物片段；
2. 5. 2. 2酶切测序重组质粒pET-C的PCR产物
用两种限制性内切酶Kpn K Xba I分别酶切所述的测序重组质粒pET-C的PCR产物片段，酶切条件如下
测序重组质粒PET-C的PCR产物片段5 μ L
10倍的酶切缓冲液(10XL Buffer)2μ L
限制性内切酶KpnI0. 5yL无菌水补至20 μ L
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍上样缓冲液，1%琼脂糖凝胶电泳，回收11Λ的测序重组质粒PET-C的PCR产物的第一次酶切产物； 第二次酶切条件如下
回收的11Λ测序重组质粒pET-C的PCR产物的第一次酶切产物 IOuL 10倍的酶切缓冲液(M Buffer)2 μ L
限制性内切酶)(ba I0. 5uL
无菌水补至20 μ L
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍的上样缓冲液(10X Loading Buffer), 1%琼脂糖凝胶电泳，回收11Λ的测序重组质粒pET-C的PCR产物的第二次酶切产物； 2. 5. 2. 3 酶切质粒pDA71 (美国标准菌种典藏中心American Type Culture Collection,缩写 ATCC,检索号 77474)
用两种酶Kpn I ,Xba I分别酶切质粒pDA71，酶切条件如下 质粒 pDA715μ L
10倍的酶切缓冲液(10 X L buffer )2 μ L
限制性内切酶KpnI0. 5yL
无菌水补至20 μ L
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍的上样缓冲液(10X Loading Buffer), 1%琼脂糖凝胶电泳，回收质粒PDA71的第一次酶切产物； 第二次酶切条件如下
回收的质粒PDA71的一次酶切产物10 μ L
10倍的酶切缓冲液(IOXM buffer)2μ L
限制性内切酶)(ba I0. 5yL
无菌水补至20 μ L
37°C水浴4小时，加入1/10体积的10倍的上样缓冲液(10X Loading Buffer),
琼脂糖凝胶电泳，回收质粒PDA71的第二次酶切产物； 2. 5. 2. 4 连接
用连接试剂盒将所述质粒PDA71的第二次酶切产物和测序重组质粒pET-C的PCR产物的第二次酶切产物连接，构建表达重组质粒PDA71-C ；连接条件如下 质粒PDA71的第二次酶切产物如L
测序重组质粒PET-C的PCR产物的第二次酶切产物如L 10 倍连接缓冲液(10XLigase Buffer)IuL
T4 DNA 连接酶(Ligase)IuL,
16°C水浴12 - 16小时，即得表达重组质粒pDA71-C连接产物，表达重组质粒pDA71_C 连接产物中含有降解农药毒死蜱的mpd基因；
2. 5. 2. 5用表达重组质粒pDA71-C连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备方法如上述2. 3. 5. 1 2. 3. 5. 6步骤； 用表达重组质粒PDA71-C连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，将10 μ 1表达重组质粒PDA71-C连接产物加入到100 μ 1大肠杆菌DH10B感受态细胞中；操作方法如上述第2. 3. 5. 8 2. 3. 5. 12步骤，但在第2. 3. 5. 11中需用氨苄青霉素50mg/L取代卡那霉素，获得带有表达重组质粒PDA71-C的转化子；
将一环表达重组质粒PDA71-C的转化子接种到3mL含有氨苄青霉素(50mg/L)的LB液体培养基，37°C振荡培养过夜；取1. 5mL菌液加入离心管中，4°C下lOOOOr/min离心Imin ； 弃上清，将管倒置吸水纸上，使液体流尽；
加入150 μ 1用冰预冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris -CDpH 8.0,10 mM/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0)，剧烈振荡，重新悬浮菌体沉淀， 室温放置3 5min ；加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2mol/L氯化钠(NaOH)，1%十二烷基硫酸钠(SDS))，温和混勻，切勿剧烈振荡，室温5min ；加入450μ 1预冷的溶液III (乙酸钾溶液， PH 4. 8)，反复颠倒数次，温和混勻，室温5 IOmin ； 12000r/min离心5min ；
将上清液转入干净的1. 5mL离心管中，加入1. 5倍体积预冷无水乙醇，冰上放置10分钟，然后12000r/min离心IOmin ；彻底弃去上清液，沿壁加入ImlL 70%乙醇漂洗沉淀，颠倒数次，立即去上清，自然干燥；将沉淀物溶于30μ1 TE缓冲液(10mM/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris .Cl)，ImM/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0，含 20μ g/mL 的核酸酶 RNaseA))中，37°C 保温30min后即为表达重组质粒pDA71-C ；
采用与上述第2. 5. 2. 3步骤中)(ba I酶切、Kpn I酶切同样的条件酶切表达重组质粒 pDA71-C，l%琼脂糖电泳显示两个条带，大小分别为11Λ和6. 21Λ，分别为微嗜酸寡养单胞菌Gl菌株的mpd基因和微嗜酸寡养单胞菌Gl菌株的pDA71质粒载体，证明表达重组质粒 PDA71-C构建正确；
2. 5. 2. 6 玫瑰红红球菌 R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的转化 2. 5. 2. 6. 1玫瑰红红球菌R-D3菌株电转化感受态细胞的制备 2. 5. 2. 6. 1. 1按1%的接种量将玫瑰红红球菌R-D3菌株接种到IOOmL的LB培养基中， 温度30°C，培养18-M小时，得到玫瑰红红球菌R-D3菌株的扩大培养物，简称R-D3菌株的扩大培养物；
2. 5. 2. 6. 1. 2取IOmL R-D3菌株的扩大培养物，4000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，收集细胞，用4°C的无菌水洗涤1次，再用4°C 10%甘油洗涤2次；
2. 5. 2. 6. 1. 3离心2次后，弃去上清液，用ImL浓度10%的甘油重悬，得到玫瑰红红球菌R-D3菌株感受态细胞；
2. 5. 2. 6. 2用表达重组质粒pDA71-C电转化玫瑰红红球菌R-D3菌株感受态细胞，步骤如下
2. 5. 2. 6. 2. 1取1 μ L表达重组质粒pDA71_C与80 μ L的玫瑰红红球菌R-D3菌株感受态细胞混合，移入电击杯中，冰浴10分钟；将电击杯置于电击槽中电击，电击参数电击杯 0. 2cm,电压2. OkV，电击时间3. 5ms ；
2. 5. 2. 6. 2. 2电击完毕，立即向杯中加入420 μ L的LB培养液，温度30°C、振荡培养3 小时，即为电击转化产物；
2. 5. 2. 6. 2. 3将电击转化产物涂布含50 μ g/mL氨苄青霉素和200mg/L农药毒死蜱乳油制剂的牛肉膏蛋白胨平板，30°C培养5天；
2. 5. 2. 6. 3玫瑰红红球菌R-D3中mpd基因表达的检测
平板上出现菌落，有的菌落周围出现透明的水解圈，有的菌落周围没有透明的水解圈；有透明水解圈者，是由于这些菌落中的细胞的mpd基因表达，降解农药毒死蜱，因而形成透明的水解圈；证明微嗜酸寡养单胞菌Gl菌株的mpd基因在这些菌落的细胞中表达，降解农药毒死蜱，出现水解圈；这些菌落即为表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3 (.Rhodococcus rhodochrous R-D3)，基因核苷酸序列如下
ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCC GGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTG A0构建表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3所用材料如下 2. 2步骤扩增引物
正向5，-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3，、 反向5’ -GAATTCTCGAGCTTGGGTTGACGACCG-3，， 由上海生工生物工程有限公司根据所述的序列合成。质粒pET48a(+)，购自德国默克Novagen公司。质粒pDA71，美国标准菌种典藏中心(American Type Culture Collection，缩写 ATCC)提供，检索号77474。限制性内切酶Kpn I ,Nde I、Xho I、Xho I和T4 DNA连接酶均购自宝生物工程 (大连)有限公司。2. 5.1步骤扩增引物
正向5，- CG TCTAGAATGCCCCTGAAGAACCGCT-3，， 反向5’ - CGGGTACCTCACTTGGGGTTGACGACC-3，， 由上海生工生物工程有限公司根据所述的序列合成。大肠杆菌DHlOB菌株，上海雷浩信息科技有限公司提供。


本发明涉及表达mpd基因的玫瑰红红球菌及其构建方法。表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3可以快速降解水体中的农药毒死蜱残留。其构建方法包括以下步骤1、提取微嗜酸寡养单胞菌G1菌株的基因组DNA；2、扩增得到G1菌株的PCR产物；3、将G1菌株的PCR产物与大肠杆菌质粒pET-28a(+)连接，构建测序重组质粒pET-C；4、构建表达重组质粒pDA71-C；构建表达重组质粒pDA71-C电转化玫瑰红红球菌R-D3菌株得到表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3。