专利名称：肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及其融合基因与产物的制作方法肿瘤坏死因子(TNF)是机体内的一种多功能免疫调节分子，它可以和细胞膜上的受体结合发挥作用，往往引起靶细胞的死亡(它的名称即来源于此)或招引免疫效应细胞在局部的聚集。国外对类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的发病机理进行研究发现，肿瘤坏死因子α(TNF-α)在该疾病的病理进程中起十分关键的作用，患者或动物模型病变关节腔内的TNF水平异常升高(Feldman M，Brennan FM，Maini RN.The role of cytokines in rheumatoid arthritis.Ann RevImmunol 1996；14397；Grom A，Murray KF，Luyrink L等，Patterns ofexpression oftumor necrosis factor a，tumor necrosis factor β，and their receptors in synovia ofpatients with juvenile rheumatoid arthritis and juvenile spondyloarthropathy.ArthritisRheum 1996，391703；Saxne T，Palladino Jr MA，Heinegard D等，Detection oftumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritissynovial fluid and serum.Arthritis Rheum 1988；311041；Klareskog L和McDevitt HRheumatoid arthritis and its animal modelsthe role of TNF-α and the possibleabsence of specific immune reactions.Current Opinion in Immunology，1999；11657-662))。它在关节腔内的含量大量升高，一方面和关节滑膜细胞的受体结合造成该细胞直接损伤，另一方面，它可以召集免疫效应细胞聚集至此，分泌更多的细胞因子，产生更强更持久的自身免疫反应。在RA病患部位有过量的TNF-α表达，是造成患病部位肿胀和疼痛的主要因素之一。而且有大量研究表明，TNF还是引起脓毒性休克综合症的主要介质。脓毒性休克综合症患者血清中TNF-α水平升高预示着死亡率或致残率升高。被动输入TNF-α的拮抗剂可以防止LPS和细菌引起的休克合组织损伤，临床上应用TNF-α抗体或者其受体对类风湿关节炎和脓毒性休克综合症有一定疗效。对TNF受体(TNFR)的研究表明，有I型、II型两种肿瘤坏死因子受体，均为I型跨膜糖蛋白。其中以II型分布更为广泛，与肿瘤坏死因子的亲和力更强。两种受体虽然需位于细胞膜上才可以发挥向细胞内传递信号的功能，但仍有部分从细胞表面脱落至体液内，称为可溶性受体。进一步的研究表明，这种可溶性的受体可以中和TNF，在体内对TNF的活性起负调节作用(Smith CA，Farrah T，Goodwin RG.The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteinsactivation，costimulation，and death.Cell 1994；75959.)，但是由于这种可溶性受体的体内半衰期很短，即使能够人工合成这种受体分子，用来治疗RA也是不现实的。国外已有人借助基因工程手段构建了人TNFαII型受体可溶部分(sTNFR)与人抗体IgG Fc片段的融合蛋白，研究发现该融合蛋白在离体条件下对TNF有中和作用，因此有可能开发成功治疗RA的特效药物(参见Hoogenboom等，分子免疫学28(9)1027-1037，1991，“Ab-TNF融合蛋白的构建与表达”；美国专利5,605,690)。发明目的本发明的目的在于提供一种重组的sTNFR基因，它能够提高在哺乳动物细胞内的表达。本发明的目的还在于提供一种含有该重组基因的融合基因，以及由此得到的融合蛋白，该蛋白具有更强的免疫亲和力。本发明的目的还在于提供含有本发明重组基因的重组载体，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。本发明的目的还在于提供含有本发明重组载体的哺乳动物细胞。
技术方案为了实现本发明的目的，本发明提供了一种新的重组sTNFR基因，其中的密码子符合哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，所述重组基因的序列为SEQ IDNO1gtagctgtgt gcgcagctct cgcggtgggt ctcgacctgt gcgcagcagc tcaggcgttc 060ccagcacacg tagctttgac cccataggca cctgacccag gtaggacttg gcgactgagt 120gattagtacg agcacacggc acacatctgt tggaggaagt ggtcaccagg tcagcaggct 180aaggtgttgt gcacgaacac gtctgaaacg gtctgagagt cgtgagacga gaggacgtag 240acgcacctgt gcaagtgcgt accggactgg ttcagatgcg gatcgcgttg cagttcggag 300cacgtcgaca cacaggcatg gacgcgagat cacaagcgaa tgtgcacgtg aaggcctgga 360tggtactgcg ccctaaggaa ccatgacgga tggcgactct gggcacctct ccgaaattgg 420cgaccaggtt taggagtcgc aagtcctggt acggacacct ctgaggttgt ctggaaccca 480g 481为了克隆与表达的目的，本发明在该序列在该结构基因前增加了一段操作序列CATgctagcATG。其中，前3个大写碱基表示的保护碱基，下划线部分是NheI酶切位点，其后是加入的起始密码子ATG。
本发明还提供了包含该重组基因的融合基因。其中，重组sTNFR基因与人IgG Fc片段的融合。
在本发明的一种优选实施方式中，重组sTNFR基因通过一段接头序列与人IgG Fc片段的融合，其编码的氨基酸序列为(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO2)。该氨基酸序列的DNA序列之一为5’-ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCTCGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCA-3’(SEQ ID NO3)。
本发明的目的还在于提供含有本发明重组基因的重组载体，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。所述的载体可以是本领域熟知的各种适合转染哺乳动物的表达载体。
本发明的目的还在于提供含有本发明重组载体的哺乳动物细胞。所述的哺乳动物细胞可以是例如CHO细胞，Hela细胞，小鼠Ltk-(4)细胞，猴肾VERO细胞等各种常用哺乳动物工程细胞株。
发明效果本发明在构建人TNFαII型受体可溶部分(sTNFR)与人Ig抗体Fc片段的融合基因时，通过人工重新设计sTNFR基因及其与Fc片段之间的接头序列，使该融合蛋白的亲和力提高了一个数量级，而其在CHO细胞中的表达量提高了近5倍。
优选实施方式实施例1全长重组sTNFR基因的制备全长重组sTNFR基因的合成本发明根据哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，已知sTNFR片段的氨基酸序列，设计了一段带有克隆表达操作序列的新的重组sTNFR基因(SEQ ID NO1)CATgctagcATGgtagctgtgt gcgcagctct cgcggtgggt ctcgacctgt gcgcagcagc tcaggcgttc60ccagcacacg tagctttgac cccataggca cctgacccag gtaggacttg gcgactgagt 120gattagtacg agcacacggc acacatctgt tggaggaagt ggtcaccagg tcagcaggct 180aaggtgttgt gcacgaacac gtctgaaacg gtctgagagt cgtgagacga gaggacgtag 240acgcacctgt gcaagtgcgt accggactgg ttcagatgcg gatcgcgttg cagttcggag 300cacgtcgaca cacaggcatg gacgcgagat cacaagcgaa tgtgcacgtg aaggcctgga 360tggtactgcg ccctaaggaa ccatgacgga tggcgactct gggcacctct ccgaaattgg 420cgaccaggtt taggagtcgc aagtcctggt acggacacct ctgaggttgt ctggaaccca 480g 481运用GCG软件将上述序列及其互补序列分解成约85b的片段，共计22个多核苷酸片段，其中正链的的第一个片段为5’-CAGgctagcATGgtagctgtgtgcgcagctctcgcggtgggtctcgacctg-3’(SEQ ID NO4)，其前三位碱基是保护碱基，第4-9个碱基是向表达载体插入时的酶切位点(Nhe I)，第一个ATG是加入的起始密码子。该片段也是合成全长融合基因时的上游引物，本研究中记作sTNFR-M5’。设计原则是互补的相邻片段之间有18-20个碱基的互补区。参照文献ChrisostomosProdromou and Laurenee H，Pearl(1992)的方法进行片段的合成，然后进行PAGE纯化。
合成好的片段按照2μg/μl的浓度溶于灭菌的三蒸水中，用市售PCR试剂盒按照以下方法进行PCR反应体系的组成成分 数量(μl)10X PCR反应缓冲液 1025mM Mg2SO410Pfu DNA聚合酶(5U/μl) 2多核苷酸片段(2μg/μl) 各1μl，共计25μl灭菌三蒸水 至100μl反应条件预变性94℃，2分钟；主循环94℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，3分钟；循环数20后延伸72℃，5分钟。
PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行。电泳鉴定与凝胶回收按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中有两条带，其中一条分子量在480bp左右，用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约3微克。重组sTNFR基因的克隆、筛选与测序上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上，转化大肠杆菌DH5α细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选，取20个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增，用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了12个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果，确认了2个序列完全正确的克隆，为sTNFR-M6和sTNFR-M10。
实施例2天然sTNFR基因的制备突然sTNFR基因(sTNFR-N)的PCR扩增天然sTNFR基因的序列是已知的，可参见例如Genebank登录号AH006638。据此设计扩增引物上游引物5’CAGgctagcatggcgcccgtcgccgtc-3’(SEQ ID NO5)，其中，CAG为保护碱基，下划线部分为向表达载体pMSG(Pharmacia)克隆时的切点(Nhe I)。该片段也是构建天然sTNFR与Fc全长融合基因时的上游引物，记作sTNFR-N5′。
下游引物5’-cttgcacaccacgtctg-3’(SEQ ID NO6)。
合成上述引物，PAGE纯化后用于PCR。
用GIBCO公司的Trizol试剂从人肝细胞中抽提总RNA，操作过程按照厂家的说明进行。抽提的总RNA在1％琼脂糖电泳上确认完整性后用INVITROGENE公司的反转录试剂盒按照厂家说明进行反转录，获得cDNA。反应完毕，经Promega公司的反应体系DNA抽提纯化试剂盒纯化后作为PCR的模板。
利用上述引物和模板DNA进行PCR，其反应体系如下成分数量(μl)10X PCR反应缓冲液 1025mM Mg2SO410Pfu DNA聚合酶(5U/μl) 2引物(2μg/μl) 各3μl，共计6μl模板DNA(1.8μg/μl) 1灭菌三蒸水 至100μlPCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行，循环条件如下预变性94℃，2分钟；
主循环94℃，1分钟，60℃，1分钟，72℃，3分钟；共30循环。
后延伸72℃，5分钟。PCR产物的鉴定和凝胶回收按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中有一条分子量在450bp～500bp左右的单一带，与预期的480bp大小一致。用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约2.8微克。天然sTNFR基因的克隆、筛选与测序上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上，转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选，取5个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增，用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了3个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果，确认了1个序列完全正确的克隆，即sTNFR-N3。
实施例3sTNFR-Fc融合基因的获得人IgG1 Fc片段的序列是已知的(参见例如Genebank登录号acc82527)。据此设计3′端引物IgG1Fc-3′引物5’gcactcgagttttacccggagacagggagag-3’(SEQ ID NO7)。
其中，gca为保护碱基，下划线部分为向上述表达载体克隆时的切点(Xho I)。该引物也是获得全长sTNFR与Fc融合基因的下游引物。
另外设计跨接sTNFR与Fc的引物，用于重组sTNFR的为引物M5’-cagacgtggtgtgcaagccctctgaggttgtctggaacccag-3’(SEQ ID NO8)。
用于天然sTNFR的为引物N5’-cagacgtggtgtgcaagcccacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ ID NO9)。
以上引物按照常规方法合成，并进行PAGE纯化。
以前述的sTNFR-M和带有全长IgG1基因的质粒pMG18(DEVELOPMENTOF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，BirminghamB152TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)为模板，sTNFR-M5′、IgG1Fc-3’和前述引物M为引物进行PCR。在琼脂糖凝胶电泳上获得分子量约为1049bp的单一条带后进行凝胶回收。获得的DNA按照常规方法克隆到pUC18载体上后转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选。通过酶切鉴定和测序确认了一个序列完全正确的克隆，记作sTNFR-M/Fc。
同理，以sTNFR-N替换sTNFR-M，sTNFR-N5′替换sTNFR-M5′，以引物N替换引物M，制得sTNFR-N/Fc。
实施例4全长sTNFR/接头/Fc融合基因的制备本发明设计的接头序列其氨基酸序列为(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO2)；其DNA序列之一为5’-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3’(SEQ ID NO3)。
为了通过PCR将sTNFR编码区与Fc片段拼接，在该片段的首尾各加上一个分别与sTNFR编码区3′端和Fc编码区5′端互补的序列，各约20个碱基长度。用于连接sTNFR-M的记作“接头-M”，其序列为5’-tgaggttgtctggaacccagACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ ID NO10)；用于连接sTNFR-N的记作“接头-N”，其序列为5’-cagacgtggtgtgcaagcccACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ ID NO11)。
合成上述两种接头，并进行Page纯化。
以IgG1Fc-3′引物与“接头-M”构成引物对，以含有人IgG1全序列的质粒pMG18为模板进行PCR，获得带有接头-M的人IgG1 Fc片段，其大小均为764bp(669bp+95bp)。PCR，电泳，鉴定和凝胶回收的方法参照实施例1所述。获得的DNA记作“接头-M/Fc”。
同理，以“接头-N”替换“接头-M”，制得“接头-N/Fc”。
以前述“接头-M/Fc”和sTNFR-M6的DNA为模板，sTNFR-M5′和IgG1Fc-3’为引物进行PCR。反应体系为成分 数量(μl)10XPCR反应缓冲液 1025mM Mg2SO410Pfu DNA聚合酶(5U/μl)2引物(2μg/μl) 各1.5μl，共计2μl
接头-M/Fc DNA(1.6μg/μl) 1sTNFR-M6(1.5μg/μl) 1.1灭菌三蒸水至100μlPCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行，循环条件如下预变性94℃，2分钟；主循环94℃，1分钟，60℃，1分钟，72℃，3分钟；共30循环。
后延伸72℃，5分钟。PCR产物的鉴定和凝胶回收将以上所得的PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中有一条分子量在1100bp左右的单一带，与预期的1109bp大小一致。用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约1.8微克。融合sTNFR基因的克隆、筛选与测序上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上，转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选，取7个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增，用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了2个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果，确认了1个序列完全正确的克隆，记作“sTNFR-M/接头/Fc”。
同理，以“接头-N/Fc”替换“接头-M/Fc”，以sTNFR-N3替换sTNFR-M6，以sTNFR-N5′替换sTNFR-M5′，得到“sTNFR-N/接头/Fc”。
实施例5sTNFR基因的表达融合基因表达载体的构建将实施例3和4构建的pUC18[sTNFR/Fc]和pUC18[sTNFR/接头/Fc]正确克隆接种于含有氨苄青霉素的20ml液体LB培养基，37℃培养过夜，用Promega公司的Midi质粒DNA抽提纯化试剂盒抽提质粒DNA，各得质粒DNA约30微克。
分别用Nhe I和Xho I(Phamarcia)(10U/ul)消化pUC18[sTNFR/Fc]，pUC18[sTNFR/接头/Fc]和表达质粒pMSG(Phamarcia)。酶切反应37℃反应过夜。酶切产物在0.8％琼脂糖电泳上进行分离鉴定，用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收大小约为大小正确的片段。
分别用T4DNA连接酶(10U/ul)将sTNFR/Fc或sTNFR/接头/Fc连接到PMSG载体的Nhe I和Xho I位点。
按照常规方法(见Sambrook等，1989)用连接所得重组pMSG转化大肠杆菌DH5a菌株，并在IPTG/X-Gal平板培养基上进行蓝白斑筛选。各取白斑10个接种于LB液体培养基37℃培养后抽取质粒如前所述进行酶切鉴定，每种融合基因至少获得4个具有正确大小的插入片段的克隆，作为候选克隆。
将上述候选克隆中的两个进行DNA测序。根据测序结果，分别确认插入片段的序列与设计的完全一致。将所得的正确克隆分别记作pMSG[sTNFR-M/Fc]、pMSG[sTNFR-N/Fc]、pMSG[sTNFR-N/接头/Fc]和pMSG[sTNFR-M/接头/Fc]。CHO细胞的转化与表达取带有上述四种重组pMSG的大肠杆菌菌株，分别接种于500ml加入了氨苄青霉素的2xYT液体培养基，37℃，260rpm震荡培养16小时。用Qiagen公司的“Ultrapure Plasmid Purification Kit”抽提质粒DNA，抽提过程按照厂家提供的说明书进行。
用脂质体法转染CHO细胞，转染试剂盒购自Invitrogene公司。转染时分别取上述纯化的pMSG[sTNFR-N/接头/Fc]、pMSG[sTNFR-M/接头/Fc]、pMSG[sTNFR-M/Fc]、pMSG[sTNFR-N/Fc]质粒100微克作为DNA样品对CHO细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。
转染后的CHO细胞经连续3个月的氨甲喋呤(MTX)筛选，其浓度从0.05μM到10μM，每两周增加一次浓度，每次MTX的用量约为前一次的2倍，具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行，培养基为15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37℃，5％CO2培养箱中培养。然后按照常规极度稀释法进行单克隆化。应用ELISA方法分别检测其融合蛋白的表达量，总共得到pMSG[sTNFR-N/接头/Fc]克隆89个、pMSG[sTNFR-M/接头/Fc]克隆63个、pMSG[sTNFR-M/Fc]克隆87个、pMSG[sTNFR-N/Fc]克隆96个。
在DEME培养基中常规培养，经ELISA上述部分克隆sTNFR的表达强度进行了研究，具体数据如下基因类型 pMSG[sTNFR-N/ pMSG[sTNFR- pMSG[sTNFR- pMSG[sTNFR-接头/Fc] M/接头/Fc] N/Fe]M/Fc]被测克隆数量 32 44 38 48平均表达水平 0.26±0.23 1.47±0.33 0.31±0.17 129±0.42(mg/L上清)以上数据说明，本发明的重组sTNFR基因显著提高了其表达水平，提高的幅度高达4.16～5.65倍。对该蛋白质的规模生产具有重要的经济价值。
实施例6
sTNFR融合蛋白对TNFα拮抗能力的研究将上述pMSG[sTNFR-N/接头/Fc]、pMSG[sTNFR-M/接头/Fc]、pMSG[sTNFR-M/Fc]、pMSG[sTNFR-N/Fc]的表达细胞株培养后用A蛋白-Sepharose进行亲和层析，获得纯度达90％以上的融合蛋白。
上述四种纯化的融合蛋白通过以下方法检测其对TNFα的中和能力。
1.取对数生长期的L929细胞，用1％胰蛋白酶常规消化后充分分散细胞，并用细胞培养液稀释到2×105细胞/毫升。
2.取96孔板4块，每孔中加入100μl细胞悬浮液，5％CO2培养箱中37℃培养24小时。
3.用1～2μg/ml放线菌素D和0.001μg/ml TNFα标准品(Phamacia公司产品)的细胞培养液将待测样品稀释至10μg/ml、1.0μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml和0.00001μg/ml。
4.每孔加入100μl各种稀释度的样品，每个稀释度3个孔。阴性对照只加入含1～2μg/ml放线菌素D的细胞培养液。阳性对照中加入高剂量的TNFα(2μg/ml)。
5. 5％CO2培养箱中37℃培养24小时或更长。培养时间根据阳性对照孔中的细胞全部死亡确定。
6.用MTT染色后在读板机上读取光密度数据。 从以上数据可以看出，加入接头的融合蛋白比没有接头的融合蛋白对TNFα的中和能力提高了大约3倍。这说明，接头的加入可以明显提高融合蛋白的中和能力，即亲和力。
序列表<110>上海兰生国健药业有限公司<120>肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及其融合基因与产物<160>11<210>1<211>481<212>DNA<213>聚核苷酸<400>1GTAGCTGTGT GCGCAGCTCT CGCGGTGGGT CTCGACCTGT GCGCAGCAGC TCAGGCGTTC 060CCAGCACACG TAGCTTTGAC CCCATAGGCA CCTGACCCAG GTAGGACTTG GCGACTGAGT 120GATTAGTACG AGCACACGGC ACACATCTGT TGGAGGAAGT GGTCACCAGG TCAGCAGGCT 180AAGGTGTTGT GCACGAACAC GTCTGAAACG GTCTGAGAGT CGTGAGACGA GAGGACGTAG 240ACGCACCTGT GCAAGTGCGT ACCGGACTGG TTCAGATGCG GATCGCGTTG CAGTTCGGAG 300CACGTCGACA CACAGGCATG GACGCGAGAT CACAAGCGAA TGTGCACGTG AAGGCCTGGA 360TGGTACTGCG CCCTAAGGAA CCATGACGGA TGGCGACTCT GGGCACCTCT CCGAAATTGG 420CGACCAGGTT TAGGAGTCGC AAGTCCTGGT ACGGACACCT CTGAGGTTGT CTGGAACCCA 480G 481<210>2<211>25<212>PRT<213>接头肽<400>2Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala5 10 15Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser20 25<210>3<211>75<212>DNA<213>接头<400>3ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA 60ACCACAACCT CGTCA 75<210>4<211>51<212>DNA<213>引物<400>4CAGGCTAGCA TGGTAGCTGT GTGCGCAGCT CTCGCGGTGG GTCTCGACCT G 51<210>5<211>27<212>DNA<213>引物<400>5CAGGCTAGCA TGGCGCCCGT CGCCGTC27<210>6<211>17<212>DNA<213>引物<400>6CTTGCACACC ACGTCTG 17<210>7<211>31<212>DNA<213>引物<400>7GCACTCGAGT TTTACCCGGA GACAGGGAGA G 31<210>8<211>42<212>DNA<213>引物<400>8CAGACGTGGT GTGCAAGCCC TCTGAGGTTG TCTGGAACCC AG 42<210>9<211>42<212>DNA<213>引物<400>9CAGACGTGGT GTGCAAGCCC ACATGCCCAC CGTGCCCAGC AC42<210>10<211>117<212>DNA<213>引物<400>10TGAGGTTGTC TGGAACCCAG ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT60CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCAACATG CCCACCGTGC CCAGCAC 117<210>11<211>117<212>DNA<213>引物<400>11CAGACGTGGT GTGCAAGCCC ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT60CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCAACATG CCCACCGTGC CCAGCAC 11

本发明提供了一种重组sTNFR基因，其中的密码子符合哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性。本发明还提供一种包含该重组基因的融合基因。当本发明的基因或融合基因表达时，其在CHO细胞中的表达量提高了近5倍，所得融合蛋白的亲和力提高了一个数量级。